iv ABSTRAK
OPTIMASI AMPLIFIKASI BAGIAN GEN parC DENGAN METODE PCR PADA ISOLAT Salmonella typhi DARI RUMAH SAKIT IMMANUEL
BANDUNG PERIODE 2006
Hadi Sumitro Jioe, 2008. Pembimbing I : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph. D Pembimbing II : Sylvia Soeng, dr., M. Kes
Strain dari Salmonella typhi yang resisten terhadap antibiotik telah menjadi masalah kesehatan di dunia. Dari penelitian terdahulu, telah di temukan bahwa pada negara lain, beberapa strain dari Salmonella typhi, yang resisten terhadap antibiotik seperti kuinolon, memiliki mutasi pada bagian dari gen parC, yaitu gen yang penting dalam proses replikasi DNA. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR yang dapat digunakan untuk mengamplifikasi bagian dari gen parC dari Salmonella typhi yang diduga telah mengalami resistensi terhadap kuinolon. Kondisi PCR ini diperlakukan pada beberapa sampel Salmonella typhi yang didapat dari Rumah Sakit Immanuel Bandung. Kromosom DNA di ekstrak dari sampel-sampel tersebut dan digunakan sebagai templat. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan ekstrak DNA tersebut dan menggunakan 0.6 µM dari masing-masing primer. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus selama 60 detik pada suhu 94ºC, 60 detik pada suhu 40ºC, dan 60 detik pada suhu 72ºC. Analisis dengan menggunakan gel agarosa elektroforesis 1% menunjukkan pita yang diharapkan, yaitu antara 400 – 500 pb.
v ABSTRACT
OPTIMATION PART OF parC GENE AMPLIFICATION BY PCR METHOD IN ISOLATE OFSalmonella typhiFROM IMMANUEL HOSPITAL BANDUNG IN
PERIOD OF 2006
Hadi Sumitro Jioe, 2008. First tutor : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph. D Second Tutor : Sylvia Soeng, dr., M. Kes
Strains of Salmonella typhi that are resistant to antimicrobial agents have become a worldwide health problem. From previous investigation, it was found that in other countries, some strains of Salmonella typhi, that are resistant to some antibiotics such as quinolons, have mutations in the part of parC gene, the gene that important in DNA replication process. The purpose of this research is to determine the PCR condition that can be used to amplify part of parC of Salmonella typhi that is suspected to be responsible for quinolon resistance. This PCR condition was applied into few Salmonella typhi samples obtained from Immanuel Hospital Bandung. Chromosomal DNA were extracted from those samples and used as a template. DNA amplification was performed with extracted DNA using 0.6 µM of each of the primer. PCR was performed for 30 cycles of 60 seconds at 94oC, 60 second at 40oC and 60 second at 72oC. Analysis with 1% electrophoresis gel agarose showed the expected band, between 400 and 500 bp.
ix DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PERSETUJUAN ii
SURAT PERNYATAAN iii
ABSTRAK iv
ABSTRACT v
KATA PENGANTAR vi
DAFTAR ISI ix
DAFTAR GAMBAR xi
DAFTAR TABEL xii
BAB I PENDAHULUAN 1
1.1Latar Belakang 1
1.2Identifikasi Masalah 3
1.3Maksud dan Tujuan 3
1.4Manfaat Penelitian 4
1.5Metode Penelitian 4
1.6Waktu dan Lokasi Penelitian 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 5
2.1 Salmonella typhi 5
2.1.1 Sejarah 5
2.1.2 Epidemiologi 5
2.1.3 Karakteristik 6
2.1.4 Gejala Infeksi 8
2.1.5 Faktor Virulensi dan Toksin 9
x
2.1.7 Pengobatan 13
2.1.8 Resistensi Antibiotik 14
2.2 Gen parC 16
2.3 Amplifikasi dengan Teknik PCR 21
BAB III ALAT, BAHAN DAN METODE 26
3.1 Subjek Penelitian 26
3.2 Metode Penelitian 26
3.3 Alat dan Bahan 26
3.3.1 Alat 26
3.3.2 Bahan 27
3.4 Cara Kerja 27
3.4.1 Tahap 1 : Pembuatan Templat 27
3.4.2 Tahap 2 : PCR 28
3.4.2.1 PCR menggunakan Primer Ca8 dan Ca9 28 3.4.2.2 PCR menggunakan Primer parC1 dan parC2 28
3.4.3 Elektroforesis 29
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 30
4.1 Penanaman Sampel pada Medium Salmonella Shigella 30
4.2 PCR menggunakan Primer Ca8 dan Ca9 31
4.3 PCR menggunakan Primer parC1 dan parC2 32
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 35
5.1 Kesimpulan 35
5.2 Saran 36
DAFTAR PUSTAKA 37
xi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Salmonella typhi 7
Gambar 2.2 Salmonella typhi dengan pewarnaan gram 7
Gambar 2.3 Proses masuknya Salmonella typhi kedalam tubuh manusia 8 Gambar 2.4 Faktor-faktor virulensi yang penting dalam Patogenesis Salmonella 9 Gambar 2.5 Salmonella typhi menginfeksi tubuh melalui plaque Peyeri yang ada di
usus halus 12
Gambar 2.6 Multi-drug Resistant oleh Salmonella typhi 15
Gambar 2.7 DNA Supercoiled and DNA Open Circular 17
Gambar 2.8 Tahap-tahap utama pada proses PCR 23
xii
DAFTAR TABEL
Halaman
39
RIWAYAT HIDUP PENULIS
Nama : Hadi Sumitro Jioe
Tempat dan Tanggal Lahir : Tasikmalaya, 06 Agustus 1986 Alamat : Jl. Rumah Sakit No. 21 Tasikmalaya Riwayat Pendidikan :
- 1992 Lulus TKK BPK Penabur Tasikmalaya - 1998 Lulus SDK BPK Penabur Tasikmalaya - 2001 Lulus SLTPK BPK Penabur Tasikmalaya - 2004 Lulus SMU Negeri 1 Tasikmalaya
1 Universitas Kristen Maranatha BAB I
PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Demam tifoid atau demam enterik adalah penyakit akut atau sub-akut yang
disebabkan oleh bakteri Salmonella, secara lebih spesifik lebih banyak disebabkan
oleh Salmonella typhi. Gejala awal penyakit ini dapat berupa malaise, demam, nyeri
pada perut, dan konstipasi. Apabila tidak diobati, maka dapat menyebabkan diare,
rash, pembesaran limpa dan komplikasi lainnya. (Darmowandowo, 2006)
Demam enterik adalah penyakit endemik di sebagian besar negara-negara
berkembang di dunia, khususnya di daerah Amerika Selatan dan Tengah, juga Asia,
terutama Asia Selatan dan Asia Tenggara. Dilaporkan ada sekitar 16 – 33 juta kasus,
dengan angka kematian 500.000 – 600.000 per tahunnya. Angka kejadian rata – rata
penyakit ini 225 – 810 per 100.000 penduduk di Chili, Nepal, Indonesia dan Afrika
Selatan (Giraud, et al., 2005)
Sejak tahun 1948 kloramfenikol merupakan drug of choice untuk infeksi
Salmonella. Keampuhan kloramfenikol pada pengobatan demam tifoid telah diakui
berdasarkan efektifitasnya terhadap Salmonella typhi disamping harga obat yang
relatif murah. Setelah kloramfenikol bertahan sekitar 25 tahun, dilaporkan oleh
beberapa peneliti di berbagai negara adanya strain Salmonella typhi yang resisten
terhadap kloramfenikol. Peneliti di India melaporkan adanya kasus demam tifoid
yang resisten terhadap kloramfenikol pada tahun 1970, sedangkan di Mexico pertama
kali dilaporkan pada tahun 1972. Resistensi tersebut ternyata diikuti oleh adanya
resistensi Salmonella typhi terhadap obat-obat lain yang biasa dipergunakan untuk
2
Universitas Kristen Maranatha Pada tahun 1960, kuinolon yang pertama diperkenalkan, yaitu asam nalidiksat
akan tetapi memiliki keterbatasan oleh karena aktivitas intrinsik yang rendah dan
cepatnya terjadi resistensi. Penambahan fluor pada molekul kuinolon menghasilkan
fluorokuinolon (pertama kali diperkenalkan sebagai siprofloksasin pada 1987) yang
memiliki spektrum lebih luas terhadap bakteri gram negatif, namun aktivitas terhadap
gram positif lemah (Sastroasmoro, 2005)
Dewasa ini fluorokuinolon biasa digunakan sebagai obat golongan utama dalam
mengobati infeksi Salmonella typhi. Akan tetapi, beberapa kuman Salmonella typhi
yang resisten terhadap obat ini pun telah diketemukan. Lebih lagi, telah dilaporkan
kegagalan pengobatan dengan fluorokuinolon terhadap pasien dengan infeksi
Salmonella typhi. Kasus-kasus tersebut banyak dilaporkan dan terjadi di
negara-negara berkembang. Pada kebanyakan strain Salmonella typhi, resistensi terhadap
fluorokuinolon tersebut diakibatkan oleh adanya mutasi dari gen yang mengkode
DNA gyrase (gyrA dan gyrB) dan DNA topoisomerase IV (parC dan parE) (Hirose,
et al., 2002). Dahulu para peneliti mengira bahwa hanya gen gyrA yang menyebabkan
resistensi terhadap fluorokuinolon, akan tetapi penelitian terbaru menemukan bahwa
gen parC pun terlibat dalam mekanisme resistensi tersebut (Gaind, et al., 2006)
Menjadi hal yang menarik bagi kita untuk meneliti lebih lanjut tentang hubungan
antara mutasi pada gen parC dengan resistensi terhadap fluorokuinolon pada
Salmonella typhi di Indonesia.
Untuk mengawali penelitian ini, dilakukan perbanyakan (amplifikasi) bagian gen
parC dari Salmonella typhi di Indonesia, yang sampelnya diperoleh dari Rumah Sakit
Immanuel Bandung. Bagian gen yang diamplifikasi adalah bagian gen parC, yang
dari penelitian di negara Inggris dan Jepang telah diketahui merupakan bagian yang
termutasi (Hirose, et al., 2002, Turner, et al., 2006). Pada penelitian ini, amplifikasi
bagian gen parC dilakukan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR).
Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan pada
penelitian selanjutnya, untuk memperoleh informasi lebih lanjut tentang mutasi pada
3
Universitas Kristen Maranatha Informasi tersebut diharapkan dapat digunakan untuk pembuatan kit yang dapat
mendeteksi adanya resistensi terhadap Salmonella typhi dalam waktu cepat
menggunakan teknik PCR, sehingga dapat dilakukan metode pengobatan yang lebih
tepat.
Penelitian ini mengerjakan tahap awal, yaitu mencari kondisi PCR yang paling
optimal untuk mengamplifikasi gen parC, dengan cara optimalisasi kondisi PCR
yang sudah ada sebelumnya.
1.2. Identifikasi Masalah
Bagaiman kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen parC menggunakan primer
parC1 dan parC2?
1.3. Maksud dan Tujuan
Maksud dari penelitian ini adalah untuk mengetahui hubungan antara gen parC
dengan resistensi terhadap fluorokuinolon pada Salmonella typhi di Indonesia.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR gen parC
menggunakan primer parC1 dan parC2 pada Salmonella typhi di Indonesia,
4
Universitas Kristen Maranatha 1.4 Manfaat Penelitian
Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan penelitian pendahuluan bagi para
peneliti selanjutnya dalam melakukan penelitian lebih lanjut mengenai adakah
hubungan antara gen parC dengan resistensi antibiotik yang ditimbulkannya serta
pembuatan kit untuk deteksi infeksi kuman Salmonella typhi.
1.5 Metode Penelitian
Penelitian laboratory experimental ini merupakan suatu cara untuk mencari
kondisi yang paling optimal untuk deteksi gen parC menggunakan teknik PCR.
1.6 Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penelitian & Pengembangan Ilmu
Kedokteran Dasar (LP2 – IKD) Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha
dan Laboratorium Biokimia, Program Studi Kimia, FMIPA ITB pada bulan Maret
35 Universitas Kristen Maranatha
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Penelitian ini bertujuan untuk mencari kondisi PCR bagian gen parC
menggunakan primer parC1, dan parC2. Primer parC1 dan parC2 dirancang dengan
mengoptimalisasi primer yang sudah ada sebelumnya. Rancangan primer baru ini
ternyata bisa digunakan untuk amplifikasi dengan kondisi sebagai berikut:
1. Formula PCR untuk satu kali reaksi menggunakan primer parC1 dan parC2
adalah:
- Buffer 1x (tanpa Mg2+)
- Mg2+ 1.5 – 3.5 mM
- dNTP 200 µM
- parC1 0.6 µM
- parC2 0.6 µM
- Taq polymerase 1 U
- H2O steril
- Templat hasil isolasi keromosom 0.5 µl
2. Kondisi PCR untuk mengamplifiksai bagian gen parC adalah:
- Jumlah siklus : 30
- Denaturasi : 94ºC 1 menit
- Annealing : 40ºC 1 menit
36
Universitas Kristen Maranatha
5.2 Saran
1. Pada penelitian selanjutnya, analisis sekuensing perlu dilakukan terhadap
hasil amplifikasi PCR bagian gen parC Salmonella typhi. Hal ini
dimaksudkan untuk mengetahui ada tidaknya mutasi pada bagian gen parC
tersebut.
2. Analisis resistensi terhadap fluorokuinolon menggunakan kertas cakram dapat
digunakan sebagai awal pemilihan sampel Salmonella typhi sebelum
37 Universitas Kristen Maranatha
DAFTAR PUSTAKA
Brown, T. A. (1995). Gene cloning, an introduction, 3rd ed. Chapman & Hall. p. 228 - 38
Darmowandowo, W., et al (2006) Demam Tifoid. Surabaya: FK Unair..
Eykyn, S. J. & Williams, H. (1987). Treatment of multiresistant Salmonella typhi with oral ciprofloxacin. Lancet ii, 1407 – 1408.
Gaind, R., et al (2006). Molecular characterization of ciprofloxacin-resistant Salmonella enterica serovar Typhi and Paratyphi A causing enteric fever in India. J Antimicrob Chemother 58: 1139 – 44.
Giraud., et al (2005). A review of vaccine research and development: human enteric infections. Science Direct. p. 2744
Hadinegoro, S. R. (1999). Masalag Multi Drug Resistance pada Demam Tifoid Anak.
Jakarta: FK UI.
Heisig P.(1996). Genetic Evidence for a Role of parC Mutations in Development of High-level Fluoroquinolone resistance in a Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 40: 879 – 85.
Hirose, K., et al (2002). DNA Sequence Analysis of DNA Gyrase and DNA Topoisomerase IV Quinolone Resistance-Determining Regions of Salmonella enterica Serovar Typhi and Serovar Paratyphi A. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 3249-52.
Kariuki S, Revathi G, Muyodi J, et al (2004). Characterisation of multi-resistant typhoid outbreaks in Kenya. J Clin Microbiol 42:1477 – 82.
38
Universitas Kristen Maranatha
Madigan, M. T., et al (2003). Brock’s Biology of Microorganism, 10th ed. New Jersey: Pearson Education, Inc .p. 741-42
Pollack, D, V. (2003). Student presentation on Salmonella enterica typhi. Connecticut: University of Connecticut – Department of Molecular and Cell Biology.
Juwono, R. (1996). Demam Tifoid. In: Noer, H.M.S., Waspadji, S., Rachman, A.M., Lesmana, L. A., Widodo, D., Isbagio, H., et al. eds. Buku Ajar Ilmu PEnyakit Dalam, 3rd ed. Jilid 1. Jakarta: balai Penerbit FKUI. p. 435 - 62
Rudiretna, A. (1998) Gen mirip CarA pada Salmonella typhi. Desertasi Program Pasca Sarjana. Institut Teknologi Bandung.
Turner, A. K., Nair, S., Wain, J. (2006). The acquisition of full fluoroquinolone resistance in Salmonella Typhi by accumulation of point mutations in the topoisomerase targets. J Antimicrob Chemother 58: 733-40.
