BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei sampai dengan Juni 2008. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat Aromatik Bogor, Laboratorium Kimia Analisis Makanan GMK, Laboratorium Kimia Pangan Fateta Institut Pertanian Bogor, dan di Laboratorium Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan (Balitbang-Gizi) Departemen Kesehatan Bogor.
Bahan dan Alat Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun murbei varietas Morus multicaulis berumur 80 hari dan diperoleh dari Teaching Farm Sutera Alam Kebun Percobaan IPB Desa Sukamantri Kabupaten Bogor. Hewan percobaan yang digunakan untuk pengujian efek hipoglikemik adalah tikus jantan jenis Sprague Dawley dengan ciri-ciri berwarna putih, berkepala kecil, ekor lebih panjang daripada badan, dan berumur 70 hari dengan berat rata-rata berkisar antara 200-250 gram. Tikus tersebut diperoleh dari Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan (Balitbang-Gizi) Departemen Kesehatan Bogor.
Bahan-bahan yang digunakan pada analisis proksimat daun murbei adalah K2SO4, H2SO4, H3BO3 pekat, Hexane, Metilene merah, Metilene biru (Kanto Chemical, Jepang), NaOH-Na2S2O3, HCl, Etanol 95%, metanol p.a, air bebas ion, buffer asetat 100 mM (Merck, Jerman), DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (Sigma, USA), trolox®(Sigma, USA).
Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk penginduksian tikus diabetes ialah Aloksan monohidrat 5 %, dan larutan Natrium klorida 0,9%.
Alat
Peralatan yang digunakan yaitu: glukometer, rotary evaporator (R110 Merck Buchi, Jepang),stirer (IKA Merck, Jerman), kertas saring kasar, penangas air, oven, hot plate, centrifuge, neraca analitik, alat-alat gelas, sonde, kandang tikus, botol minum dan wadah ransum. Peralatan yang digunakan dalam analisis sifat
kimia antara lain tabung reaksi, labu lemak, alat ekstraksi soxhlet, desikator, tanur, labu Kjeldahl, stop-watch, cawan petridish, pH-meter, alat destilasi, spektrofotometer (Spectronic 21, CAMAG), freeze drier, vortex.
Metode Penelitian
Penelitian ini dibagi dalam tiga tahapan percobaan. Masing-masing tahapan percobaan, diuraikan sebagai berikut:
Percobaan I. Penyiapan bubuk daun murbei, ekstraksi dan uji proksimat
Daun murbei segar yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Teaching Farm Sutera Alam Kebun Percobaan IPB Desa Sukamantri Kabupaten Bogor yang berumur 60 sampai 90 hari. Daun murbei segar yang berasal dari daun muda dan daun tua disortir, ditimbang kemudian dicuci dalam air mengalir sebanyak dua kali dan dipotong-potong dengan panjang ± 1 cm. Selanjutnya dilakukan pengeringan dengan sinar matahari dan di oven dengan suhu 45˚C selama 5 jam hingga tercapai kadar air akhir 7%. Nilai ini mengacu pada SNI-01-3836-2000 dimana kadar air teh kering dalam kemasan adalah maksimal 8%. Daun murbei yang telah kering dihaluskan dengan blender untuk mendapatkan partikel yang relatif homogen dengan ukuran 32 mesh. Untuk pembuatan ekstrak daun segar, tidak dilakukan pengeringan, setelah daun disortir, ditimbang dan dicuci, daun langsung diblender.
Penggunaan daun tua dan daun muda pada penelitian ini adalah ingin mengetahui apakah kandungan senyawa aktif yang berperan sebagai inhibitor alfa-glukosidase yang terdapat pada daun murbei muda dan daun murbei tua sama kuatnya dalam menurunkan kadar glukosa darah. Selain itu belum ada penelitian daun murbei yang membandingkan penggunaan antara daun muda dan daun tua, walaupun secara empiris daun muda banyak digunakan sebagai lalap dan diyakini dapat menurunkan berat badan dan gula darah.
Ekstrak daun murbei yang digunakan untuk menguji efek hipoglikemik dihasilkan melalui proses ekstraksi yang dilakukan secara maserasi yaitu proses ekstraksi dengan pengadukan secara terus menerus selama 5 jam, kemudian didiamkan selama 24 jam pada suhu ruangan. Untuk menghasilkan ekstrak kasar digunakan pelarut air dan pelarut hexane masing-masing dengan perbandingan
1:5. Setelah itu dilakukan penyaringan. Penguapan sisa pelarut menggunakan rotari evaporator (rotavapor) dan dipekatkan dalam penangas air pada temperatur 50˚C sehingga dihasilkan ekstrak daun murbei kental (Modifikasi Andayani, 2003). Tahapan alur proses pembuatan ekstrak daun murbei disajikan pada Gambar 8. Selanjutnya dilakukan analisis proksimat yang meliputi kadar air, lemak, kadar abu, protein, karbohidrat dan serat kasar. Metode pemanasan langsung digunakan untuk menentukan kadar air dan kadar abu, reaksi hidrolisis untuk menetapkan serat kasar, ekstraksi soklet untuk mengukur kadar lemak, metode Kjeldahl untuk menentukan kadar protein. Penentuan kadar karbohidrat dengan cara 100% dikurangi kadar air, abu, protein dan lemak (by difference).
Penggunaan pelarut air dan pelarut hexane pada penelitian ini karena kedua jenis pelarut tersebut telah banyak digunakan untuk menguji aktivitas hipoglikemik pada berbagai jenis tanaman obat, seperti ekstrak hexane buah biji makassar (Brucea javanica), telaah kandungan kimia ekstrak hexane buah takokak (Solanum tarvum), kembang kol (Brassica oleraceae) dan umbi daun dewa (Gynum pseudochina). Hasil uji fitokimia fraksi hexane dari ekstrak tumbuhan menunjukkan adanya senyawa steroid, terpenoid dan flavonoid yang diketahui mempunyai kemampuan hipoglikemik, sedangkan fraksi air dari ekstrak tumbuhan umumnya menunjukkan aktivitas hipoglikemik yang lebih kuat (Sayekti et al 2003). Menurut Agusta dan Yuliasri (2006) pelarut hexane dapat mendeteksi 26 komponen kimia.
Maserasi (24 jam 25˚C)
Gambar 8. Diagram alur proses pembuatan ekstrak daun murbei
Sortasi, penimbangan dan pencucian
Penghalusan dengan blender (32 mesh)
Penyaringan dengan kertas saring
Ekstrak daun murbei kental Ekstraksi : Daun murbei: air = 1:5 Daun murbei: hexane = 1:5
Daun murbei segar Daun murbei kering
Penguapan dg rotavapor dipekatkan dlm pemanas air suhu 50˚C
Analisis Proksimat dan Serat kasar Ekstrak Daun Murbei Kadar Air , Metode Oven (Apriyantono et al 1989; James 1995 )
Cawan aluminium dikeringkan dalam oven pada suhu 100-102oC selama 15 menit, didinginkan dalam desikator selama 10 menit kemudian ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak ± 5 g dalam cawan (B). Cawan beserta isinya dikeringkan dalam oven 100oC selama 4-6 jam. Cawan dipindahkan ke dalam desikator lalu didinginkan dan ditimbang. Cawan beserta isinya dikeringkan kembali sampai diperoleh berat konstan (C). Kadar air dihitung dengan rumus:
Kadar Air (% bb) = ( ) x100% B A C B
Kadar Abu (Metode Total Abu)
Cawan porselen yang telah diketahui bobot tetapnya (A) dimasukkan sampel yang telah ditimbang sebanyak 5 g (B). Sampel diarangkan di atas api bunsen dengan nyala api kecil hingga asapnya hilang, selanjutnya dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 500-600oC sampai menjadi abu yang berwarna putih. Cawan yang berisi abu didinginkan dalam desikator lalu ditimbang hingga diperoleh bobot tetap (C). Kadar abu dihitung dengan rumus:
Kadar Abu (% bb) = (C – A)/(B – A) x 100%
Kadar Abu (% bk) = kadar abu (% bb)/(100-kadar air (% bb) x 100%
Kadar Karbohidrat (by difference)
Karbohidrat ditentukan dengan metode Nelson-Somogy. Sampel dihidrolisis dengan larutan HCL 0,1 M dalam pemanas air, kemudian dinetralkan dengan NaOH 0,1 M. Protein diendapkan dengan menambahkan larutan ZnSO4 5 % dan Ba(OH)2 0,3 N, kemudian disaring. Supermatan ditambah dengan pereaksi Nelson, dan kadar karbohidrat ditentukan dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 500 nm. Kadar karbohidrat dihitung dengan rumus:
Kadar Karbohidrat (% bb) = 100% - (KA + A + P + L) Kadar karbohidrat (%bk) = 100 - %bk (A + P + L)
Dimana :
KA = kadar air (% bb) A = kadar abu (% bb) P = kadar protein (% bb) L = kadar lemak (%)
Kadar Protein, Metode Mikro-Kjeldahl (AOAC 1995)
Sampel sebanyak 0.5-3 g ditimbang (A) dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 30 ml lalu ditambahkan 1.9 ± 0.1 g K2SO4, 40 ± 10 mg HgO dan 2.0 ± 0.1 ml H2SO4kemudian didestruksi dengan pemanasan sampai larutan berwarna jernih. Larutan hasil destruksi diencerkan dan didestilasi dengan penambahan NaOH-Na2S2O3sebanyak 8-10 ml. Destilat ditampung dalam 5 ml larutan H3BO3 dan 2-4 tetes indikator (campuran 2 bagian metil merah 0.2% dalam alkohol dan 1 bagian metilen blue 0.2% dalam alkohol). Kemudian dilakukan destilasi sampai tertampung kira-kira 50 ml destilat dalam erlenmeyer, lalu dititrasi dengan HCl 0.02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Dari hasil titrasi ini total nitrogen dapat diketahui, dan kadar protein sampel dihitung dengan mengalikan total nitrogen dengan faktor konversi. Kadar protein dihitung dengan rumus:
Total Nitrogen (%) = A x x mlblankoxN mlHCl HCl 14.007 100
Kadar Protein (%bb) = total nitrogen (%) x faktor koreksi (6.25)
Kadar Protein (%bk) = kadar protein (%bb)/(100-kadar air %bb) x 100%
Kadar Lemak, Metode Ekstraksi Soxhlet (AOAC 1995)
Labu lemak dikeringkan dalam oven (110oC selama 1 jam), kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga bobot tetap (A). Sampel sebanyak 5 g (B) dibungkus dengan kertas saring lalu dimasukkan dalam labu soxhlet kemudian dipasang alat kondensor. Pelarut hexana dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya sesuai dengan ukuran yang digunakan. Selanjutnya dilakukan refluks minimum 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang ada di dalam labu lemak didestilasi dan
ditampung. Kemudian labu lemak yang berisi hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC sampai beratnya tetap lalu didinginkan dalam desikator dan dilakukan penimbangan labu beserta lemaknya hingga diperoleh bobot yang tetap (C). Kadar lemak ditentukan dengan rumus:
Kadar Lemak (% bb) = x100%
B A C
Kadar lemak (%bk) = kadar lemak (%bb)/(100-kadar air %bb) x 100%
Kadar Serat Kasar
Sampel dihaluskan sehingga dapat melalui saringan diameter 1 mm dan diaduk merata. Ditimbang 2 gram bahan, diekstraksi lemak sampel dengan metode Soxhlet. Sampel dipindahkan ke dalam Erlenmeyer 600 ml, serta jika ada ditambahkan juga 0,5 gram asbes yang telah dipijarkan dan 3 tetes zat anti buih. Ditambahkan 200 ml larutan H2SO4 mendidih dan ditutup dengan pendingin balik. Dididihkan selama 30 menit dengan kadang-kadang digoyang-goyangkan. Disaring suspensi dengan menggunakan kertas saring. Residu yang tertinggal dalam Erlenmeyer dicuci dengan air mendidih. Dicuci residu dalam kertas saring sampai air cucian tidak bersifat asam lagi (diuji dengan kertas lakmus). Residu dipindahkan secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam Erlenmeyer dengan menggunakan spatula. Sisanya dicuci lagi dengan 200 ml larutan NaOH mendidih sampai semua residu masuk ke dalam Erlenmeyer. Dididihkan dengan pendingin balik sambil kadang-kadang digoyang-goyangkan selama 30 menit. Disaring kembali melalui kertas saring yang diketahui beratnya atau krus gooch yang telah dipijarkan dan diketahui beratnya, sambil dicuci dengan larutan K2SO4 10%. Kemudian residu dicuci lagi dengan air mendidih, lalu dengan sekitar 15 ml alkohol 95%. Dikeringkan kertas saring atau krus dengan isinya pada 110oC sampai berat konstan (1-2 jam), didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Jangan lupa untuk mengurangi berat asbes. Berat residu yang diperoleh sama dengan berat serat kasar. (Apriyantono, 1989).
Percobaan II. Penginduksian aloksan dan pengukuran glukosa darah
Sebelum melakukan percobaan tikus dipelihara dalam kandang selama 7 hari untuk menyeragamkan cara hidup dan makanannya, makanan dan minuman diberikan secara ad libitum. Kesehatan tikus dipantau setiap hari, dan berat ditimbang setiap 2 hari sekali. Setelah masa adaptasi selama 7 hari, dilakukan pengukuran kadar glukosa darah. Sebelum dilakukan pengukuran kadar glukosa darah, tikus dipuasakan terlebih dahulu selama 10 jam. Induksi dilakukan dengan menggunakan 5 % larutan aloksan monohidrat dalam larutan NaCl 0,9% dengan dosis 125 mg/kg BB secara intraperitonial (Andayani 2003). Setelah hewan diinduksi, diberi makanan yang cukup (ad libitum) dan dalam waktu 24 jam pertama dalam air minumnya ditambahkan 5 % larutan D-glukosa monohidrat untuk mencegah terjadinya hipoglikemia yang fatal. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan 3 hari setelah induksi. Tikus dikatakan DM jika kadar glukosa darah puasa > 126 mg /dl atau kadar gula sesaat > 200 mg/dl. Tahapan alur penginduksian aloksan disajikan pada Gambar 9.
Gambar 9. Diagram tahapan alur penelitian penginduksian aloksan
Tikus diadaptasi selama 7 hari
Pemeriksaan kadar glukosa darah puasa
Induksi Aloksan monohidrat 5%
Tikus DM dikelompokkan berdasarkan berat badan Pemeriksaan kadar glukosa
Percobaan III. Uji Efek Hipoglikemik Ekstrak Daun Murbei
Setelah tikus hiperglikemik (kadar glukosa darah sesaat > 200 mg/dl), masing-masing tikus yang akan digunakan dalam penelitian, ditimbang dan dicatat berat badannya. Kemudian sebanyak 45 ekor tikus DM dibagi menjadi sembilan kelompok, masing-masing terdiri dari lima ekor tikus. Tikus yang mempunyai berat badan yang sama (selisih berat badan tidak lebih dari 10%) dijadikan satu kelompok. Untuk menentukan perlakuan yang akan diberikan kepada masing-masing kelompok tikus dilakukan secara acak. Kelompok tikus dalam percobaan ini diuraikan sebagai berikut:
1. Kelompok MKA, yaitu tikus yang diberi perlakuan ekstrak daun murbei muda kering dengan pelarut air.
2. Kelompok KSS, yaitu tikus yang hanya diberikan salin steril (kontrol) 3. Kelompok MSA, yaitu tikus yang diberi perlakuan daun muda segar
dengan pelarut air.
4. Kelompok MSL, yaitu tikus yang diberi perlakuan ekstrak daun muda segar dengan pelarut hexane.
5. Kelompok TSA, yaitu tikus yang diberi ekstrak daun murbei tua segar dengan pelarut air.
6. Kelompok TSL, yaitu tikus yang diberi perlakuan ekstrak daun murbei tua segar dengan pelarut hexane.
7. Kelompok MKL, yaitu tikus yang diberi perlakuan ekstrak daun murbei muda kering dengan pelarut hexane.
8. Kelompok TKL, yaitu tikus yang diberi perlakuan daun murbei tua kering dengan pelarut hexane.
9. Kelompok TKA, yaitu tikus yang diberi perlakuan ekstrak daun murbei tua kering dengan pelarut air.
Sebelum diberikan ekstrak daun murbei, dilakukan pengukuran kadar glukosa darah (0 jam). Pemberian ekstrak daun murbei pada tikus dilakukan dengan menggunakan sonde. Penentuan dosis ekstrak yang dicekokkan ke tikus didasarkan pada pemakaian tradisional. Dalam penggunaannya sebagai obat tradisional untuk diabetes, sebanyak 2-3 lembar daun murbei direbus dengan 2 gelas air selama 15 menit, setelah dingin disaring. Air rebusan diminum dua kali
sehari pagi dan sore (Arisandi & Yovita 2006). Dalam penelitian ini digunakan dosis konversi yang setara dengan bobot ekstrak 3 lembar daun murbei untuk manusia dengan bobot badan 50 kg. Perhitungan dosis ekstrak daun murbei yang dicekokkan pada tikus dapat dilihat pada Lampiran 1. Sebelum ekstrak diberikan, ekstrak dilarutkan dalam salin steril dan diberikan secara oral menggunakan sonde lambung dengan volume 1 ml sekali pemberian (Aybar 2001), dalam penelitian ini ekstrak diberikan sebanyak 5 kali dengan interval waktu 25 menit setiap pemberian. Pengukuran glukosa darah dilakukan 1 jam, 3 jam, dan 5 jam setelah perlakuan. Tahapan alur penelitian uji hipoglikemik pada tikus DM disajikan pada Gambar 10.
Pengukuran Kadar Glukosa Darah Tikus Percobaan
Kadar glukosa darah ditentukan dengan metode glucose oxidase biosensor, menggunakan alat ”One Touch Ultra” (alat monitoring glukosa darah, diproduksi oleh Lifescan Johnson & Johnson Company 2002). Darah diambil dari bagian ekor tikus, dengan cara ekor tikus dibersihkan lalu dipijat atau diurut perlahan-lahan, kemudian bagian ujung ditusuk dengan jarum (lancet). Darah yang keluar kemudian ditempelkan pada strip glukometer. Kadar glukosa darah akan terukur dan nampak pada layar glukometer setelah 5 detik, dinyatakan dalam mg/dl (Soemardji 2004).
Gambar 10. Diagram tahapan alur penelitian uji hipoglikemik pada tikus DM
Pembuatan ransum standar
Pembuatan ransum tikus percobaan berdasarkan AOAC (1990) yang dimodifikasi oleh laboratorium Biokimia dan Fisiologi Gizi Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor. Ransum tikus yang digunakan adalah dalam bentuk bubuk. Komposisi ransum tikus tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
Pemeriksaan kadar glukosa darah stlh induksi
Pembagian kelompok perlakuan pd tikus DM secara
acak
pemeriksaan glukosa darah ( 1 jam stlh perlakuan)
pemeriksaan glukosa darah (3jam stlh perlakuan) Pemberian ekstrak daun
murbei
Pemeriksaan kadar glukosa darah (0 jam sblm perlakuan)
pemeriksaan glukosa darah (5jam stlh perlakuan)
Tabel 1 Komposisi ransum standar tikus Bahan Jumlah (gram) Tepung beras Tepung kedele Susu skim Minyak kelapa Mineral mix1 Vitamin2 Garam 250 gram 136 gram 250 gram 200 gram 60 gram ** 40 gram Keterangan :
1Campuran mineral per kilogram ransum, terdiri dari : 139,3 gram NaCl, 0,79 gram KI, 389 gram KH2PO4, 57,3 gram MgSO4, 381,4 gram CaCO3, 27 gram FeSO4, 4,01 gram MnSO4, 0,549 gram ZnSO4, 0,477 gram CuSO4, dan 0,023 gram CaCl2.
2 Campuran vitamin per kilogram ransum, terdiri dari : 6000 IU vitamin A, 400 IU vitamin D, 10 mg vitamin E, 1 mg vitamin K, 5 mg folat, 30 mg tiamin HCl, 20 mg riboflavin, 5 mg piridoksin HCl, 20 mg Ca pantotenat, 100 mg nikotinamida, dan 150 μg vitamin B12.
Pengukuran jumlah konsumsi ransum
Pemberian ransum dilakukan setiap hari secara ad libitum, ransum dan sisa ransum ditimbang setiap hari dan dinyatakan dalam satuan gram untuk mengetahui apakah keadaan diabetes berpengaruh pada total konsumsi ransum tikus selama percobaan. Jumlah konsumsi ransum dihitung dengan mengurangi jumlah ransum yang diberikan dengan sisa ransum yang telah ditimbang.
Pengukuran berat badan
Pengukuran berat badan tikus dilakukan sebelum induksi aloksan, setelah induksi dan setelah pemberian ekstrak, dengan tujuan untuk mengetahui tingkat perubahan berat badan tikus selama percobaan. Pengukuran berat badan tikus dilakukan menggunakan timbangan dan dinyatakan dalam satuan gram.
Analisis Data
Analysis of variance (ANOVA) dilakukan untuk menganalisis data yang diperoleh dari masing-masing kelompok perlakuan dengan menggunakan program SPSS. Tingkat signifikasi dinyatakan dalam α = 5 % . Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial menggunakan dua faktor yaitu daun muda dan daun tua. Faktor daun muda terdiri atas empat taraf yaitu ekstrak daun muda segar dengan pelarut air, ekstrak daun muda segar dengan pelarut hexane, ekstrak daun muda kering dengan pelarut air, dan ekstrak daun muda kering dengan pelarut hexane. Sedangkan faktor daun tua terdiri dari empat taraf yaitu ekstrak daun tua segar dengan pelarut air, ekstrak daun tua segar
dengan pelarut hexane, ekstrak daun tua kering dengan pelarut air, dan ekstrak daun tua kering dengan pelarut hexane. Model matematik umum yang digunakan adalah:
Yijk = µ + αi+βj +(αβ)ij+εij Keterangan :
Yij = nilai pengamatan pada perlakuan faktor A taraf ke-i, faktor B taraf ke-j dan ulangan ke-k.
µ = nilai tengah populasi (rata-rata yang sesungguhnya) αi = pengaruh perlakuan faktor A pada taraf ke-i
βj = pengaruh perlakuan faktor B pada taraf ke-j (αβ)ij= pengaruh interaksidari faktor A dan faktor B εij = pengaruh acak yang menyebar normal (0, σ2)
Untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan antara rerata kadar glukosa darah sebelum dan setelah perlakuan digunakan uji t (t test). Jika terjadi beda nyata pada faktor perlakuan pada selang kepercayaan 95 %, dilanjutkan dengan uji LSD.
