PRODUKSI PROTEIN DENGAN SISTEM EKSPRESI DI SEL EUKARYOT

PRODUKSI PROTEIN DENGAN SISTEM EKSPRESI DI SEL EUKARYOT

Suharsono

• Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB • Departemen Biologi, FMIPA, IPB

Kelemahan sel prokaryot

Produksi protein heterologus eukaryot di sel prokaryot (bakteri):

-Tidak stabil

-Kekurangan aktivitas biologis

-Dapat terkontaminasi oleh toksin dari bakteri ‰di dalam sel prokaryot tidak terjadi modifikasi pascatranslasi

‰Pembentukan ikatan disulfida oleh disulfida

isomerase Æ pelipatan protein Æ menentukan stabilitas dan aktivitas

‰Pemotongan proteolitik dari protein prekursor Æ menentukan fungsi protein

‰Glikosilasi melalui penambahan residu gula Æ menentukan stabilitas protein

-Terikat pada O: serin, treonin -Terikat pada N: asparagin

‰Penambahan pada protein: fosforilasi, asetilasi, sulfatasi, asilasi, γ-karboksilasi, miristilasi,

palmitasi

Glikosilasi Terikat pada O Khamir Serangga Mamalia Terikat pada N Khamir Serangga _Mamalia

Vektor ekpresi pada eukaryot

1. Gen penanda seleksi di eukaryot

2. Promoter

3. Signal berhenti transkripsi dan translasi

4. Sekuen yang menandai

poliadenilasi pada transkrip mRNA

+ Ori (plasmid) atau sekuen komplementer (untuk

integrasi ke DNA kromosom sel inang)

Introduksi DNA ke dalam sel: •Transformasi (bakteri, khamir) •Transfeksi (sel hewan)

Teknik untuk transformasi khamir

1. Elektroporasi (kejutan listrik berenergi tinggi) 2. Perlakuan Li asetat

3. Menggunakan protoplast Transveksi pada sel hewan

1. Sel dicampur dengan DNA yang telah

dipresipitasi dengan CaPO₄ atau DEAE-dextran 2. Elektroporasi

Sistem ekspresi

Saccharomyces cerevisiae

Sebagai sel inang ekspresi gen eukaryot:

1. Sel tunggal, secara genetik dan fisiologis telah diketahui, mudah tumbuh (di tabung reaksi dan bioreaktor)

2. Mempunyai promoter kuat dan plasmid (2 μm) 3. Melakukan proses modifikasi pascatranslasi

4. Mensekresi beberapa protein, shg bila digunakan untuk produksi protein rekombinan ekstrasel Æ purifikasi mudah

Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae

Vektor ekspresi

S. cerevisiae

3 kelompok

1. Vektor episom atau plasmid,

yeast episomal

plasmid

(YEp)

2. Vektor terintegrasi atau

yeast integrating plasmid

(YIp)

3. Kromosom-khamir buatan atau

yeast artificial

chromosome

(YAC)

YEp:

-ekstensif digunakan (produksi protein intra/ekstra sel) -berdasarkan plasmid 2 μm dengan jumlah kopi yang tinggi

-menggunakan inang S.c mutan auxotrofik, gen WT di

Vektor ekspresi S. cerevisiae

Promoter yang disenangi:

teregulasi secara ketat, indusibel

Misal: promoter yg diinduksi galaktosa: transkripsi naik 1000x bila + galaktosa

•dalam kultur berskala besar (>10 liter)

Îintegrasi gen ke kr. Æ YIp

Kendala: produk rendah krn kopi gen tunggal

Îdiatasi: sasaran ke DNA repetitif (rDNA= 200 kopi; sekuen δ = 400 kopi)

δ = bagian retrotransposon = sekuen DNA Æ RNA Æ DNA Æ integrasi ke

beberapa situs

A1 & A2 = ujung gen yang tidak esensial Plasmid tidak stabil di S. c.

YAC

-pengklonan segmen besar

(100 kb), kromosom terpisah di S.c.

-stabil

-untuk: peta fisik genom

manusia, analisis gen besar, pustaka genom

-mirip kromosom:

Ori (ARS), sentromer, telomer -belum digunakan untuk

produksi protein

-potensi: produksi protein dg jumlah besar dari gen

multikopi atau protein dengan subunit yang berbeda

Produksi protein intrasel di

S. cerevisiae

Superoksida + H+ Cu/Zn-SOD _H 2O2

katalase/peroksidase

H₂O + O₂

Cu/Zn-SOD: agen terapi untuk penyakit bengkak (osteroarthritis, rheumatoid arthritis, scleroderma, ankylosing spondylitis)

Æ perlu Cu/Zn-SOD dari manusia

• Ekspresi cDNA Cu/Zn-SOD manusia di

E. coli

Æ alanin setelah metionin inisiator tidak terasetilasi

Produksi SOD manusia Dengan YEp sehingga:

1. gen LEU2; 2. Ori dari plasmid 2 μm; 3. gen AmpR_{; 4. Ori} E. coli; 5. cDNA Cu/Zn-SOD manusia (promoter dan

terminator GAPD= glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) S. c (LEU2-₎ Seleksi medium tanpa leusin LEU2 tumbuh produk Cu/Zn-SOD

Untuk memudahkan purifikasi: ÆProtein disekresikan ke luar sel

ƒfusi dengan sekuen signal (peptida signal, sekuen pendahulu) di hulu

contoh sekuen signal: faktor tipe kelamin (

mating

) gen α, prepro-α-factor

Contoh: hirudin (dari

Hirudo medicinalis

) sebagai antikoagulan darah

Kelemahan ekspresi di

S. cerevisiae

1. Kadang ekspresi rendah dan hasil rendah 2. Hiperglikosilasi (>100 residu manosa) Æ

mengganggu fungsi, antigen

3. Protein kadang disekresikan di ruang periplasmik Æ purifikasi mahal

4. Pada konsentrasi sel yang tinggi, menghasilkan etanol yang toksik terhadap sel sehingga jumlah protein yang disekresikan rendah

Sistem ekspresi selain khamir

•

Pichia pastoris

(methylothropic yeast), karena:

1. punya promoter yang diinduksi metanol (alkohol oksidase): + metOH Æ 30% AOX; -metOH Æ 0% AOX)

2. tidak mensintesis etanol sehingga dapat mencapai kerapatan sel yang tinggiÆ jumlah protein yang

disekresikan tinggi

3. mensekresikan sedikit protein sehingga

mempermudah purifikasi protein rekombinan yang disekresikan

1. GOI di antara promoter dan terminator AOX1 2. Ori dan penanda seleksi di

E. coli

3. Penanda seleksi di khamir Vektor ekspresi di P. p

Vektor integratif

P. pastoris

Æ menghindari instabilitas plasmid

GOI dan penanda seleksi diintegrasikan ke kromosom: 1). rekombinasi tunggal; 2). rekombinasi ganda

GOI -bakteri, fungi, tan, hewan -manusia: HBsAg, HSA

Alternatif inang lain:

Hansenula polymorpha:

hemoglobin A manusia (2

α- dan 2 β-globin)

Schizosaccharomyces pombe

Candida utilis

: monelin

Aspergillus

: α-amylase, lipase, amyloglucosidase, cellulase untuk pangan, minuman, dan industri dan pulp.

Sistem ekspresi sel serangga-baculovirus Baculovirus

Inang: invertebrata (serangga) Siklus infeksi: 2 bentuk

1. Nukleokapsid tunggal (partikel virus): dari sel terinfeksi

2. Polihedron: kumpulan nukleokapsid (virion) terbungkus di dalam matriks protein (polihedrin)

Sel lisis, organisme mati Æ polihedron Polihedron melindungi virion

Polihedrin disintesis dalam jumlah banyak pada tahap akhir (36-48 jam setelah

infeksi, selama 4-5 hari) s/d sel lisis dan inang mati

• sangat kuat, tidak untuk produksi virus • proses pascatranskripsi

• dapat untuk produksi protein (polihedrin diganti dengan GOI)

Îbaculovirus digunakan utk produksi protein mamalia

Contoh:

Autographa californica

multiple nuclear

polyhedrosis virus (AcMNPV) menginfeksi ulat

jengkal alfalfa (A.c) dan 30 spesies serangga, sel serangga (ulat tentara,

Spodoptera frugiperda

) Promoter polihedrin (polyh)

Sistem vektor ekspresi Baculovirus AcMNPV rekombinan:

1. promoter polihedrin dan bagian hulu AcMNPV (situs rekombinasi)

2. MCS (di antara promoter dan terminator polihedrin)

3. terminator polihedrin dan daerah hilir AcMNPV (situs rekombinasi)

Sel serangga diinfeksi dengan AcMNPV dan vektor (GOI) Î c.o. ganda Î GOI terintegrasi ke AcMNPV, gen polihedrin hilang. Virion tanpa gen polihedrin Î baculovirus rekombinan dapat diisolasi dari plak

tanpa oklusi

Identifikasi virus rekombinan:

-hibridisasi, PCR

-biru-putih bila lacZ di

bawah kontrol promoter baculovirus

Sel inang + baculovirus rekombinan Î 4-5 hari panen protein

Sistem ekspresi sel mamalia

•produksi protein dg modifikasi pascatranslasi

•Sel COS, BHK, HEK-239: ekspresi sementara dan cepat untuk mengetahui integritas konstruksi

•Sel CHO: ekspresi stabil & produksi protein dalam jumlah besar

Vektor ekspresi sel mamalia:

•Ori di sel eukaryot (dari virus ex: SV40) •promoter & terminator pengendali GOI

Vektor ekspresi sel mamalia

p= promoter I= intron

pa= polyadenilation

MCS= multiple cloning sites SMG= selectable marker gene ori= origin of replication

•Protein yang tersusun dari 2 rantai peptida yang berbeda

•human thyroid-stimulating hormone

(heterodimer); hemoglobin (tetramer, α2β2) &

antibodi (tetramer, H2L2)

Sintesis: @ peptida terpisah, dirakit menjadi dimer atau tetramer secara in vitro Æ tidak efisien

In vivo Æ efisien:

2 vektor ekspresi @ cDNA untuk satu subunit & penanda seleksi berbeda

•Seleksi dengan 2 agen Æ sel hidup membawa dua vektor Æ protein rekombinan dimer/tetramer

Kendala: satu vektor hilang, jumlah kopi berbeda (jumlah protein beda)

Æ satu vektor membawa 2 gen di bawah promoter & terminator berbeda

•jumlah kedua protein sama

•mengandung 2 GOI dipisah oleh IRES (internal ribosome entry site, dari virus mamalia) dikontrol satu promoter & terminator Æ transkrip tunggal Æ translasi dari ujung 5’ untuk rantai α dan dari IRES untuk rantai β

Skema seleksi untuk meningkatkan produksi protein •jumlah kopi vektor ekspresi dinaikkan dengan peningkatan konsentrasi agen