III. METODE PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioproses IV, Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI, Jalan Raya Bogor Km 46, Cibinong. Penelitian dilakukan pada bulan Mei 2006 sampai Desember 2007.
3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah perlengkapan pengenceran (gelas piala, labu ukur, corong, tabung kaca 10 ml, 100 ml dan 1.000 ml), cawan petri, jarum oase, kertas saring, neraca analitik, pH meter, timbangan,
pengukur panjang, autocklaf, inkubator, centrifuse, tabung glass 70 ml (pyrex No. 9825), rotary shaker, beker glass, serta plastik hitam penutup tabung,
quebec colony counter, spektrofotometer ( merk SHIMADZU UV-1201, 1-cm path longth call), laminar. Selain itu digunakan sejumlah kolom terbuat dari bahan acrilik/paralon dengan diameter 7 cm dilengkapi slang dan pompa, botol/wadah tertutup untuk cairan diazinon in let.
3.2.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah limbah media jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) yang mengandung miselia, yang selanjutnya disebut kompos jamur tiram, dari pembudidayaan jamur di Desa Galuga, Kecamatan Cibungbulang, Bogor, yang sudah tidak digunakan lagi. Pestisida organofosfat merek dagang diazinon 60 EC, chloroform, 0.5 M K2SO4, metanol (pa), etil asetat (teknis), aseton, aquadest, aquabidest, alkohol, spiritus. Proses pertumbuhan mikroorganisme, maka diperlukan bahan–bahan kimia lain seperti media NaCl faali, dextrosa, tripton agar, yeast, cycloheximide dan bakto agar ( Merck 1996) serta bahan-bahan untuk analisis populasi mikroorganisme digunakan metode flourecein diacetate assay/FDA (flourecein diacetate, penyangga natrium fosfat, membran filter polisulfon 0.45 mikron) dan analisis diazinon (nitrogen, asetonitril dan petroleum eter/methanol (Eggen 1999).
3.3. Tahapan Kerja
3.3.1. Persiapan Bahan Kompos dan Identifikasi Mikroorganisme dari Kompos Jamur Tiram
Penelitian ini menggunakan limbah media jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) atau sisa proses produksi jamur tiram. Adapun komposisi dari media jamur tiram ini sebagai berikut : serbuk gergaji : dedak : gipsum : kapur = 40 kg : 40 kg : 8 kg : 5 kg dan air untuk memberi kelembaban 60%. Media kompos jamur tiram ini merupakan by-product budidaya jamur tiram setelah berproduksi 4 bulan. Limbah dikering-anginkan lebih dahulu, selama 2 jam, kemudian diayak dengan saringan, ukuran partikel 20-50 mesh. Pada penelitian ini juga dilakukan penentuan kualitas awal kompos dengan parameter sebagai berikut C/N ratio, kelembaban, karbon organik (%), fosfor, kalium, kapasitas tukar kation (KTK) dan pH akan dilakukan sesuai dengan prosedur SNI serta total populasi mikroorganisme dengan cara flourece diacetate assay (FDA).
3.3.2. Analisis Kompos Jamur Tiram
Analisis sampel kompos sebelum penelitian dan setelah penelitian berakhir dilaksanakan oleh Laboratorium Tanah, IPB. Pengujian kompos jamur (SMC) yang meliputi: TPC, C/N, KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, pH, sedangkan aktivitas mikroorganisma dilakukan di Laboratorium IV Bioproses LIPI.
3.3.3. Rancangan Reaktor Biofilter
Penelitian tahap pertama penggunaan biofilter kompos jamur tiram untuk menentukan kinerja terbaik dalam proses degradasi diazinon. Kolom terbuat dari acrylic/mika dengan diameter dalam 7 cm panjang 50 cm, masing–masing kolom bagian bawah diberi ram kawat untuk penyangga kompos dan pada dasar kolom ada kran out let, cairan diazinon ditampung dengan wadah erlemeyer (sistem batch), skema dapat dilihat pada Gambar 4 (a). Selain hal tersebut juga ada perlakuan lain yaitu sistem semi kontinyu dengan wadah erlemeyer yang dilengkapi slang daur ulang dan pompa untuk mengangkat cairan out let kembali masuk ke in let. skema dapat dilihat pada Gambar 4 (b). Kolom biofilter dan wadah penampung out let dilapisi plastik hitam, dengan asumsi selama penelitian berlangsung tidak terpapar cahaya. Penelitian ini menggunakan 11 tabung biofilter.
(a) (b)
Gambar 4 (a) Skema biofilter sistem batch, dan (b) biofilter sistem semi kontinyu
Ke dalam masing–masing tabung dimasukkan kompos, yang telah dipersiapkan terlebih dahulu (kompos telah diketahui kualitas dan total populasi mikroorganisme awal), dengan perlakuan berat kompos, sesuai perlakuan pada desain metode permukaan respon (respons surface method/RSM) yaitu 300 g, 450 g, 600 g, dan sebagainya sesuai perlakuan. Tabung biofilter, agar dapat berdiri tegak didesain tempat dudukan serupa rak tabung reaksi terbuat dari bahan kayu.
3.3.4. Persiapan Larutan Diazinon
Larutan diazinon konsentrasi 500 ppm, 1000 ppm dan 1500 ppm, dibuat dengan volume 2 liter. Pembuatan larutan dilakukan dengan cara mengencerkan diazinon teknis 60 EC. Ke dalam 2 liter aquadest dimasukkan diazinon teknik 60 EC, masing-masing sebesar 1.66 ml, 3.33 ml dan 5.0 ml. Campuran diaduk sampai homogen. Larutan diazinon dengan konsentrasi awal (500 ppm,1000 ppm dan 1500 ppm) dimasukkan ke dalam masing–masing tabung biofilter sesuai
7 cm 50 cm 1.tutup 2.tabung biofilter 3.kompos 4.ram kawat 5.kran 6.erlemeyer 7.dudukan kayu 8.selang sirkulasi 9.pompa
dengan perlakuan. Tahapan penelitian biofilter sistem batch (tersaji pada Gambar 5) adalah sebagai berikut:
1. Kompos limbah media jamur tiram putih segar (SMC) dikering-anginkan, lalu diayak untuk memperoleh ukuran partikel yang seragam (20-50 mesh). 2. Larutan diazinon dibuat dengan cara: 2 liter air dicemari diazinon dengan
konsentrasi (500 ppm, 1000 ppm, dan 1500 ppm) sesuai perlakuan pada rancangan percobaan.
3. Air yang telah dicemari diazinon (larutan diazinon) kemudian dimasukkan ke tabung biofilter kompos melalui atas, laju alir sesuai grafitasi.
4. Fermentasi/inkubasi pada suhu ruang selama 10 hari, tanpa sirkulasi dan tanpa pengadukan.
5. Analisis cairan out let dan kompos biofilter (kadar diazinon, TPC, C/N, KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, pH, dan aktivitas mikroorganisme).
6. Konsentrasi diazinon out let dianalisis setiap kali setelah inkubasi selama 24 jam untuk biofilter sistem batch, dan untuk melihat pertumbuhan total populasi mikroorganisme dilakukan pengambilan sampel untuk total plate count (TPC) setiap hari hingga percobaan akhir. Kemudian sampel dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer.
Tahapan penelitian biofilter sistem semi kontinyu (tersaji pada Gambar 6) adalah sebagai berikut:
1. Kompos limbah media jamur tiram putih segar (SMC) dikering-anginkan, lalu diayak untuk memperoleh ukuran partikel yang seragam (20-50 mesh). 2. Larutan diazinon dibuat dengan cara: 2 liter air dicemari diazinon dengan
konsentarasi (500 ppm, 1000 ppm, dan 1500 ppm) sesuai perlakuan pada rancangan percobaan.
3. Air yang telah dicemari diazinon (larutan diazinon) kemudian dimasukkan ke tabung biofilter kompos melalui atas, setelah inkubasi semalam, keesokan harinya, air out let dimasukkan kembali ke tabung biofilter dengan menggunakan slang yang dilengkapi pompa, dengan laju air 4 ml dt-1. 4. Fermentasi/inkubasi pada suhu ruang selama 4 hari, dan dilakukan
sirkulasi dari out let ke in let selama 6 jam per hari dari pukul 10.00 s/d 15.00 WIB.
5. Analisis cairan out let dan kompos biofilter (kadar diazinon, TPC, C/N, KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, dan pH).
6. Pengambilan sampel untuk konsentrasi diazinon out let dilakukan setiap 1 jam sekali, setelah inkubasi selama 24 jam untuk biofilter sistem semi kontinyu, dimulai jam 10.00-15.00 WIB dilakukan sirkulasi pompa dan untuk melihat pertumbuhan total populasi mikroorganisme dilakukan pengambilan sampel untuk total plate count (TPC) setiap 1 jam hingga pengamatan akhir sampai jam 15.00 setiap hari. Kemudian sampel dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer.
Gambar 5 Diagram tahapan penelitian biofilter sistem batch.
3.3.5. Identifikasi Mikroorganisme dari Kompos Jamur Tiram
Identifikasi mikroorganisme dari sampel kompos sebelum penelitian dan setelah penelitian berakhir 10 hari dilaksanakan oleh Laboratorium Bakteriologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB.
3.3.6. Analisis Populasi Mikroorganisme
Larutan diazinon 60 EC
Kompos jamur tiram
Analisis kompos (C/N, KTK, unsur hara, Kadar air,
pH, aktifitas mikroorganisme) Biofilter Inkubasi waktu 10 hari Sampling setiap 24 jam untuk analisis penurunan kadar diazinon, populasi mikroorganisme Analisis : Kadar diazinon, TPC, C/N, KTK, unsur hara, kadar abu, pH, dan
aktifitas mikroorganisme
Analisis populasi mikroorganisme dilakukan setiap hari untuk biofilter sistem batch dan setiap jam untuk biofilter semi kontinyu. Metode total plate count digunakan untuk menghitung populasi mikroorganisme (Marshall & Devinny 1988). Satu gram kompos dari masing-masing perlakuan dimasukkan ke tabung reaksi,
Gambar 6 Diagram tahapan penelitian biofilter sistem semi kontinyu.
kemudian dilakukan pengenceran seri menggunakan tabung reaksi 20 buah. Larutan pengencer yang digunakan adalah larutan NaCl faali sebanyak 9 ml. Masing-masing pengenceran diambil 0.1 ml lalu diteteskan diagar plate kemudian diratakan dengan spreader segitiga. Seluruhnya dilakukan dalam keadaan steril di lemari laminar. Pembuatan media agar plate dengan cara, 1500 ml aquabidest dalam erlemeyer, ditambahkan 22.5 g bacto agar, 1.5 g dextrosa 7.5 g Tripton dan 2.25 g yeast dipanaskan dan distire, tambahkan beberapa tetes cycloheximide, untuk mencegah pertumbuhan fungi, setelah homogen dimasukkan ke dalam erlemeyer ukaran 250 ml, ditutup rapat lalu disterilisasi.
Agar plate yang telah diinokulasi, disimpan diinkubator selama 3-5 hari pada suhu ruang untuk melihat pertumbuhan mikroorgnisme. Unit koloni mikroorganisme per-pengenceran dihitung dengan alat quebec colony counter. Jumlah koloni per
Larutan diazinon 60 EC Kompos jamur tiram Biofilter Inkubasi waktu 4 hari Sampling Setiap hari, tiap hari 6 jam untuk analisis penurunan kadar diazinon dan populasi mikroorganisme Analisis : Kadar diazinon, TPC, C/N, KTK, unsur hara, kadar abu, pH
Cairan out let Kompos biofilter Pompa
sirkulasi
Analisis kompos (C/N, KTK, unsur hara, Kadar air,
unit dibandingkan dengan tabel, untuk mengestimasi jumlah mikroorganisme (Haris & Somme 1968). Selanjutnya dihitung perubahan pertumbuhan mikroorganisme dengan mengurangi populasi mikroorganisme hari ini dengan hari sebelumnya dan hasilnya dibagi populasi mikroorganisme sebelumnya.
Perubahan pertumbuhan mikroorganisme = (populasi H2-H1)/populasi H1 Keterangan :
H1 = populasi hari pertama H2 = populasi hari kedua
3.3.7. Analisis Residu Diazinon dan Turunannya
Analisis kadar diazinon menggunakan metode seperti yang dilakukan oleh Ningsih (2001) yaitu menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan plat silika gel 60 F254 dan spektrofotometer UV/VIS Beckman DU 650 pada panjang gelombang 241 nm.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Metode ini dilakukan dengan maksud untuk mengetahui ada tidaknya produk turunan hasil degradasi diazinon dalam sampel. Analisis kadar diazinon dengan metode KLT ini menggunakan plat silika gel 60 F254 eluen pengembang heksana : etil asetat dengan perbandingan 10 : 1 (v/v) dan pewarna digunakan serium (II) sulfat (Ningsih 2001).
KLT dilakukan dengan cara mentotolkan sampel out let dari perlakuan sistem batch (B4 hari ke-0 dan hari ke-9) pada plat kemudian dimasukkan ke dalam bejana yang berisi larutan pengembang dari heksana dan etyl asetat dengan perbandingan 10 : 1 (v/v) yang telah dijenuhkan selama 30 menit, dan selanjutnya didiamkan 7 menit, hingga eluen naik sampai batas garis. Spot yang terbentuk dapat dilihat dengan menggunakan sinar ultraviolet dan pewarnaan dengan menggunakan serum (II) sulfat. Spot yang diperoleh dibandingkan dengan spot dari diazinon teknis pekat dan spot dari stok diazinon 10000 ppm.
Spektrofotometer UV-VIS
Analisis residu diazinon dengan metode spektrofotometer ini merupakan modifikasi yang dilakukan oleh Bavcon et al. (2003) dengan metode yang dilakukan oleh Ningsih (2001), yaitu diawali dengan membuat grafik larutan standar diazinon. Diazinon 60 EC memiliki kandungan diazinon aktif sebanyak 600 g l-1. Pembuatan
kurva standar dilakukan dengan cara: membuat larutan stock konsentrasi 1.000 ppm dengan volume 10 ppm. Volume diazinon teknik 60 EC., yang diperlukan dihitung dengan rumus pengenceran (V1M1 = V2M2), sebesar 16.6 ul diazinon 60 EC, dipipet dengan menggunakan pipet effendorf (100 ul dan 1000 ul), kemudian ditera dengan menggunakan labu ukur lalu ditambah metanol pa. Selanjutnya dari larutan stok ini dibuat larutan standar diazinon dengan konsentrasi 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, dan 45 ppm, dengan metanol pa sebagai pelarut.
Serial larutan tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang 241 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS (Beckman DU 650), dan sebagai blanko digunakan metanol pa. Absorbansi terukur kemudian diplotkan terhadap konsentrasi, lalu dibuat grafik linearnya. Grafik linear yang dihasilkan digunakan sebagai grafik standar diazinon.
Supernatan dari out let sampel hasil sampling pada pengamatan pertumbuhan mikroorganisme diukur kandungan diazinonnya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 241 nm. Ke dalam masing-masing tabung sentrifus masukkan 5 ml sampel sesuai perlakuan, kemudian divortex terlebih dahulu selama 30 detik, kemudian diinkubasi di waterbath shaker selama 30 menit pada suhu 37oC. Selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, supernatan yang diperoleh kemudian diukur absorbansinya. Absorbansi yang diperoleh kemudian dikonversi menjadi konsentrasi diazinon dengan menggunkana grafik standar yang telah dibuat.
Uji recovery diazinon dilakukan sebelum penelitian, untuk menguji metode ekstraksi diazinon dari sampel yang digunakan pada penelitian ini. Hasil uji recovery diazinon diperoleh rata-rata lebih besar dari 85%. Hal tersebut memperlihatkan bahwa metode ekstrasi layak digunakan.
3.3.8. Analisis Aktifitas Mikroorganisme dengan Flourescein Diacetate Assay (FDA)
Total populasi mikroorganisme pada kompos yang digunakan sebagai biofilter dihitung di awal penelitian dan akhir siklus penelitian dengan metode FDA/ flourescein diacetate assay (Hunter 2000; El Tarabily 2002). Larutan standar FDA dibuat dengan melarutkan 0.0399 g FDA dalam aseton hingga volume 100 mL. Standar dibuat dengan menambahkan 50 ml penyangga fosfat dan 10 g sampel kompos ke masing-masing sampel kompos ke masing-masing dari 7 buah botol/beker glass dan kemudian tambahkan 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1.0 dan 1.5 ml
dari flourescein standar. Hasilnya larutan mengandung ekuivalen dari 0, 50, 100, 250, 500, dan 750 µg FDA dirubah menjadi flourescein per botol. Standar diinkubasi pada rotary shaker (120 rpm) selama 1 jam dan kemudian ditambahkan 50 ml aseton. Larutan disentrifus selama 10 menit pada 6.000 rpm, lalu disaring
dan nilai absorban filtrat diukur dengan spektrofotometer (SHIMADZU UV-1201, 1-cm path longth cell) pada 490 nm. Nilai absorban diplot untuk memperoleh persamaan regresi.
Perlakuan pada sampel dilakukan dengan cara menimbang FDA 0.200 g lalu dilarutkan dengan aseton kemudian ditambah dengan “deionized water” (aquabidest) hingga 100 ml sebagai larutan stok. Sampel ditimbang masing-masing 10 g ke dalam erlemeyer ditambah 50 ml penyangga fosfat (pH 7.6) dan larutan FDA 0.5 ml kemudian diinkubasi dengan rotary shaker pada kecepatan 120 rpm selama satu jam kemudian ditambahkan 50 ml aseton. Larutan didekantasi (dipindahkan) ke dalam tabung sentrifuse dan disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit, lalu disaring dengan milipore (0.45 µm). Absorban diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm.
3.4. Rancangan Percobaan
Penelitian ini untuk mengkaji kemampuan kompos matang sebagai biofilter residu diazinon dalam limbah cair sintetik. Penelitian menggunakan rancangan percobaan dengan perlakuan konsentrasi limbah cair diazinon awal/in let (x1), dan berat biofilter kompos dalam kolom (x2). Saat penelitian berlangsung diasumsikan, suhu sama yaitu suhu kamar, jenis kompos, kelembaban kompos dan kandungan oksigen seragam serta pengaruh cahaya ditiadakan. Kemudian tahap berikut dengan menambahkan pompa sirkulasi.
Pada penelitian ini, untuk memperoleh pengaruh konsentrasi larutan diazinon dan berat kompos dalam biofilter terhadap hasil degradasi diazinon terbaik dilakukan optimasi dengan menggunakan metode permukaan respon (respons surface method/RSM) mengikuti rancangan komposit fraksional, masing-masing dengan peubah uji terdiri dari tiga taraf dengan rincian tersaji pada Tabel 3.
Konsentrasi diazinon yang digunakan dalam penelitian ini adalah : C500 = limbah cair dengan konsentrasi diazinon 500 ppm.
C1000 = limbah cair dengan konsentrasi diazinon 1000 ppm. C1500 = limbah cair dengan konsentrasi diazinon 1500 ppm.
Perlakuan berat biofilter kompos menggunakan 3 besaran, yaitu: 300 g, 450 g dan 600 g (Tabel 3).
Tabel 3 Kisaran dan taraf peubah uji pada optimasi biofilter kompos
Jenis perlakuan Nilai rendah (-1) Nilai tengah (0) Nilai tinggi (+1) Konsentrasi diazinon (ppm) 500 1000 1500 Berat kompos dalam biofilter (g) 300 450 600
Central composite design (CCD) menurut Montgomery (1991) dalam percobaan ini digunakan dengan 3 ulangan pada titik pusat sehingga memenuhi model kuadratik, nilai pusat perlakuan digunakan konsentrasi diazinon 1000 ppm dan berat kompos 450 g. Matriks satuan-satuan percobaan pada proses biofilter dalam unit dan nilai asli disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Matrik satuan percobaan pada optimasi proses biofilter kompos rancangan komposit fraksional
No Kode Nilai asli Penamaan Diazinon Kompos Diazinon (ppm) Kompos (g)
1 +1 +1 1500 600 B1 2 -1 +1 500 600 B2 3 +1 -1 1500 300 B3 4 -1 -1 500 300 B4 5 0 0 1000 450 B51 6 0 0 1000 450 B52 7 0 0 1000 450 B53 8 1.414 0 1707 450 B6 9 -1.414 0 293 450 B7 10 0 1.414 1000 662 B8 11 0 -1.414 1000 279 B9
Nilai asli = {(nilai tertinggi/rendah-nilai tengah) x nilai kode + nilai tengah}
Adanya dua peubah uji ini, maka model kuadratiknya seperti bentuk persamaan berikut:
Yi = bo + b1x1i + b2x2i + b11x1i2 + b22x2i2 + b12x1i + ri ... (1)
Keterangan :
Y = Respon dari masing-masing perlakuan
X = (x1 : konsentrasi diazinon; x2 : berat kompos dalam kolom)
b = Koefisien parameter r = Error
Parameter respon utama yang digunakan adalah penurunan konsentrasi diazinon (diazinon). Di luar perlakuan tersebut dibuat 3 buah kontrol biofilter kompos tanpa mikroorganisme (kompos yang disterilkan). Pada penelitian ini juga dicoba penggunaan pompa untuk mensirkulasi larutan diazinon.
