BAB III
METODELOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Divisi Ilmu Bedah Onkologi RSUP Haji Adam Malik bekerjasama dengan Departemen Patologi Anatomi RSUP Haji Adam Malik Medan.
3.1.2 Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan selama 5 bulan, Oktober 2015 sampai dengan Maret 2016, yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, analisa data dan penulisan. 3.2. Metode Rancangan
Rancangan penelitian ini menggunakan ancangan analitik dengan pendekatan
cross sectional. Pada penelitian ini dilakukan penilaian ulang jumlah tumor infiltrasi limfosit serta respon patologi oleh ahli patologi RSUP H. Adam Malik pada blok parafin yang sudah ada sebelumnya dan sudah diwarnai dengan hematoxilin dan eosin, sebelum dan sesudah pemberian terapi kemoterapi neoadjuvan, sampel diambil dari tahun 2011- 2015.
3.3 KerangkaTeori
3.4 Kerangka Konsepsional
Alur penelitian yang akan digunakan adalah sebagai berikut
Evaluasi TILs
High TILs
Low TILs
Respon Patologi kemoterapi
Tidak komplit
Respon Patologi kemoterapi
Tidak komplit Usia
Grading Jenis Histologi
Komplit Komplit
---3.5. Cara Penilaian TILS
- TILs harus dilaporkan untuk suatu kompartemen stromal (dalam % Stroma TILs) Penyebut yang digunakan untuk menentukan % stroma tils adalah areastroma jaringan ( yaitu area yang digunakan oleh sel-sel inflamasi mononuklear lebih luas stroma intratumoral ) , bukan jumlah sel stroma ( yaitu fraksi dari jumlah inti stroma yang mewakili mononuklear inti sel inflamasi) .
- Tils harus dievaluasi dalam batas-batas tumor invasif .
- Tidak termasuk tils luar perbatasan tumor dan sekitar DCIS dan lobulus normal.
- Tidak termasuk tils di zona tumor dengan artefak , nekrosis , hialinisasi regresif
- Semua sel mononuclear (termasuk limfosit dan sel plasma harus dinilai kecuali sel leukosit polimorfonuklear.
- Satu bagian ( 4-5 m , pembesaran × 200-400 ) per pasien saat ini dianggap cukup
- Seluruh potongan lebih disenangi bila dibandingankan dengan biops bila memungkinkan. Core dapat di gunakan pada pengaturan preterapi neoadjuvan saat ini tidak ada metodelogi yang divalidasi untuk mencetak nilai TILs sesudah kemoterapi neoadjuvan
- Penilaian penuh dari rata rata TILs di dalam area tumor oleh ahli patologis harus digunakan . tidak boleh focus pada hotspot.
- Consensus kelompok kerja mengatakan bahwa TILs dapat memberikaninformasi yang lebih relevansecarabiologisketika dinilai sebagaivariabel kontinu, karena denganini memungkinkananalisis statistikyang lebih akurat, yangnantinya dapatdikategorikan sebagai nilai ambang batas yang berbeda beda. Namun, dalampraktek
sehari-hari, kebanyakan ahli patologi
jarangakanmelaporkanmisalnya13,5% namun dilaporkan sebagai berikut misalnya range 5% -10%, dalam contoh inimisalnya 15%. Patologiharus melaporkannilai merekasedetailmungkin sesuai kenyamanan mereka dalam melaporkan.
- Tils harus dinilai sebagai parameter kontinu. Persentase stroma tils adalah parameter semikuantitatif untuk penilaian ini, untuk Misalnya, 80% stroma tils berarti bahwa 80% dari area stroma menunjukkan kepadatan infiltrasi mononuklear. Untuk penilaian nilai-nilai persentase, Pola pertumbuhan limfosit dipisahkan dan diperhitungkan. Limfosit biasanya tidak membentuk agregat selular padat ; karena itu, penunjukan '100% stroma tils' masih akan memungkinkan beberapa ruang kosong jaringan antara masing -masing limfosit
3.6 Alur Pemeriksaan TILS
Penderita Kanker Payudara
Blok Parafin Sebelum
Kemoterapi Adjuvan
Operasi
Lanjut kemoterapi
TILs
Tinggi
Rendah
Operasi Modified Radikal Mastektomi (MRM)
Respon Kemoterapi Histopatoloi Tumor Primer dan KGB
Komplit Tidak
3.7. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.7.1. Populasi
Populasi dalam penelitian adalah preparat histologik pasien penderita kanker payudara yang diambil dari 2011-2015 di RSUP Haji Adam Malik Medan yang memenuhi kriteria inklusi.
3.7.2. Sampel
Sampel penelitian adalah preparat histologik pasien penderita kanker payudara yang diambil dari 2011 - 2015 di RSUP Haji Adam Malik Medan yang memenuhi kriteria inklusi dan sesuai dengan besar sampel penelitian.
3.7.3. Besar Sampel Penelitian
Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan menggunakan rumus : (Sophyudin 2014)
N = (Zà + Zß)² ² 0,5In (1+r)/1-r) Keterangan :
- N = Jumlahpopulasi
- Zà= Kesalahan Tipe I1,64 - Zß = Kesalahan Tipe II 1.28
- R = Koefisien Korelasi dipilih nilai minimal = 0,4 Hasil Perhitungan :
N= (1.64+1,28)² 0,5In (1+0.4)/1-0,4)
²
= 50,51 51 Jumlah pasien minimal
+ 3
3.8 Kriteria Inklusi dan Eksklusi 3.8.1 Kriteria Inklusi
Semua pasien stadium lokal lanjut yang ada blok parafinnya, dan mendapat kemoterapi neoadjuvan serta telah dilakukan operasi modified radikal mastektomi (MRM)
3.8.2. Kriteria Eksklusi
• Data tidak lengkap
• Preparat histology tidak dapat diperiksa
3.9. Variabel Penelitian dan Defnisi Operasional 3.9.1. Variabel Penelitian
Variabel yang diteliti adalah :
- Variabel bebas adalah Tumor InfiltrasiLimfosit (TILs) - Variabel Terikat adalah Respon Patologi.
3.9.2. Defenisi Operasional
• Kanker payudara adalah karsinoma yang berasal dari duktus atau
lobulus payudara. (Suyatno, Emir .T 2010).
• Stadium lokal lanjut adalah atau locally advance breast cancer
(LABC) adalah kanker payudara stadium III menurut sistem TNM dari UICC dan AJCC; yaitu terdiridari stadium IIIA (To-T2 N2 Mo atau T3 N1-2 Mo) dan stadium IIIB (T4 tiap N oMo). (Suyatno, Emir .T 2010).
• Kemoterapi Neoadjuvant terapi tambahan sebelum dilakukan terapi
• Histopatologi jaringan merupakan teknik pemeriksaan histopatologi
berguna untuk mendeteksi adanya komponen patogen yang bersifat infektif melalui pengamatan secara mikroanatomi.(Nyoman.B 2010).
• Tumor InfltrasiLimfosit (TILs) adalah subset daril imfosit yaitu suatu
imun tubuh yang menysusup pada daerah tumor sebagai responi munbaik pro atau punanti tumor. (Dankert, 2010).
• Penilaian TILs adalah berdasarkan rekomendasi dari para peneliti
tentang penilaian TILs pada Desember 2013. Sistem penilaian dengan pewarnaan Hematoksilin dan eosin, kemudian dibacakan stroma TILs dan Intratumoral TILs oleh ahli patologi dan dipresentasikan dalam persentase,
TIls dikategorikan menjadi:
1. Tinggi TILs (High TILs) dengan nilai stroma TILs dan
intratumoral TILs ≥50%
2. Rendah TILs ( Low TILs)dengan kategori nilai stroma TILs dan
intra tumoral TILs <50%. ( M.V Dieci dkk.2015).
Presentasi TILs awal sebelum kemoterapi yang dijadikan sebagai parameter untuk dihubungkan dengan respons patologi.
• Respon Patologi :respon yang dinilai dari hasil pemeriksaan patologi
pasca operasi, terdiri dari respon komplit dan respon tidak komplit 1 Respon komplit: yaitu eradikasi seluruh tumor baik invasive
maupun non invasivedari kanker payudara atau kelenjar getah bening
2 Tidak komplit: yaitu masih dijumpai adanya tumor baik invasive maupu non invasive atau kelenjar getah bening. (Dankert, 2010).
• Standar parameter penilaian respon patologi yang digunakan dalam
penelitian dengan the German study groups (German Breast Group [GBG], yaitu respon komplit tidak dijumpai tumor invasive atau non
invasive atau limfe node pada kanker payudara (Salgado dkk,2010).
• Faktor prognosis adalah faktor yang dipakai dalam meramalkan
perjalan penyakit kanker
• Faktor prediktif adalah sesuatu yang berpengaruh secara spesifik
terhadap jenis pengobatan tertentu.
3.10 .Analisa Data
Penelitian ini merupakan studi crossectional analitik, penenlitian yang pengukurannya hanya satu kali, variabel bebas dan terikat dinilai secara simultan pada satu saat. Data yang diperolehakan ditampilkan dengan tabel, dan dianalisa dengan menggunakan tabel 2x2, dengan metode Chi-square untuk menilai hipotesis, dengan Batas kemaknaan 0.05, untuk mengetahui kekuatan hubungan antara variabel dependen dengan variabel independen digunakan rasio prevalensi (PR) dengan confident interval (CI) 95%.
Untuk membaca hubungan asosiasi ditentukan nilai (PR) sebagai berikut :
- PR >1 dan rentang interval kepercayaan tidak melewati angka 1
- PR <1 dan rentang interval kepercayaan tidak melewati angka 1 (Confident Interval tidak mencakup 1), berarti variabel tersebut merupakan faktor proteksi meningkatnya respon patologi
- PR =1dan rentang interval kepercayaan tidak melewati angka 1, berarti variabel tersebut tidak berhubungan dengan variabel dependen.
BAB IV
HASIL PENELITIAN
Selama periode penelitian data di ambil dari Sub divisi Bedah Onkologi dan departemen Patologi Anatomi dengan mengumpulkan blok paraffin jaringan penderita kanker payudara sebelum dan sesudah kemoterapi neoadjuvant kemudian dinilai kembali tumor infiltrasi limfosit dan respon patologi yang memenuhi criteria inklusi. Data diambil dari tahun 2011 hingga 2015. Didapatkan jumlah sampel penelitian sebanyak 51 pasien yang memenuhi kriteria inklusi. 4.1 Analisa Data
Dari data yang dikumpulkan didapatkan data mengenai karakteristik sampel berdasarkan usia, frekuensi, jenis histopatologi dan grading histopatologi. Kemudian dianalisa untuk mencari hubungan Tils sebelum dan sesudah kemoterapi dengan respon patologi penderita kanker payudara.
Tabel 4.1 Karakteristik pasien kanker payudara
Tumor Infiltrasi Limfosit
Pada tabel diatas didapatkan tidak dijumpai ada hubugan yang bermakna dari usia terhadap TILs (P=0,762). Selain itu tidak dijumpai adanya hubungan antara grading histopatologi dan tipe histologi dengan TILs (P=1.000) dan (P= 1,283)
Tabel 4.2. Hubungan Grading dengan Respon Patologi
Pada tabel diatas tidak dijumpai adanya hubungan yang bermakna antara grading histopatologi dengan respon patologi kemoterapi, dimana dijumpai P=0,835. Dari tabel tersebut juga respon komplit dijumpai paling banyak pada grade 2, sebanyak 12 pasien.
Tabel 4.3. Hubungan Tipe Histologi dan Respon Patologi
Tipe Histologi Respon Patologi
Komplit Tidak
Table 4.4. Hubungan Tumor Infiltrasi Limfosit dengan Respon Patologi
Respon patologi
P
RP
Confident
Interval (CI)
Komplit Tidak komplit
Lower- Upper
N % N %
Tils tinggi
rendah
Total
11 (47,8%)
8 (28,6 %)
12 (52,2 %)
26 (71,4%)
0,157 2.292 0,720-7.298
19 (37,3%) 32 ( 62,7%)
BAB V PEMBAHASAN
Sistem imun salah satunya berfungsi sebagai untuk memproteksi dengan cara mengenal dan menghancurkan sel-sel abnormal sebelum berkembang menjadi tumor atau membunuhnya jika tumor itu sudah tumbuh. Peran sistem imun ini disebut immune surveillance. Beberapa bukti yang mendukung bahwa ada peran sistem imun dalam melawan tumor ganas diperoleh dari beberapa penelitian, di antaranya yang mendukung teori itu adalah: (1) banyak tumor mengandung infiltrasi sel-sel mononuklear yang terdiri darisel T, sel NK, dan makrofag; (2) tumor dapat mengalami regresi secara spontan; (3) tumor lebih sering berkembang pada individu dengan imunodefisiensi atau bila fungsi sistem imun tidak efektif, bahkan imunosupresi seringkali mendahului pertumbuhan tumor; (4) di lain pihak, tumor seringkali menyebabkan imunosupresi pada penderita. (Nyoman Budiono, 2010).
Pada penderita kanker payudara pemberian neoadjuvant kemoterapi secara
sistemik memberikan kesempatan untuk penilaian yang relatif cepat dalam
keberhasilan terapi dari rejimen yang diberikan, pengaturan ini tidak hanya untuk
mengevaluasi peran prediksi biomarker, termasuk Tils, tetapi juga memungkinkan
penilaian dari dinamika perubahan biomarker sebelum dan sesudah. (Hornychova
H,2008). Selain itu dalam beberapa penelitian dilaporkan bahwa jumlah infiltrasi
limfosit yang signifikan tinggi pada pasien dengan terapi neoadjuvant memiliki
respon lengkap patologis. (Melichar B, Loi s 2013, Loi.S 2014).
Evaluasi TiLs dengan pemeriksaan histopatologi jaringan dengan pemulasan hematoksilin dan eosin sebelum dan sesudah pemberian kemoterapi pada 51 pasien di analisa dengan hasil intratumoral (it) dan stromal (str) tumor
infiltrating lymphocytes (TILs) dalam jumlah persentase berdasarkan nilaicut-off
point yang sudah di validasi oleh peneliti sebelumnya. Hasil cut-off point tersebut didapati <50 untuk low TILs dan High TILs ≥ 50% .(Salgado 2014; Dieci 2015).
Pada penelitian ini dilakukan penilaian ulang pada blok paraffin sebanyak
51 sampel, yang diambil dari tahun 2011- 2015, didapatkan rerata usia pasien
adalah 49.22, jenis terbanyak dari histologi kanker payudara adalah karsinoma
duktal invasif payudara sebanyak 49 (96%) pasien sedangkan lobular carcinoma
sebanyak 2pasien (4 %) (table 4.1). Frekuensi grading histopatologi jaringan
dengan TILs tinggi grade 1 dijumpai 5 pasien sedangkan grade 2 dengan TILs
tinggi 15 pasien, grade 3 dengan tinggi TILs memiliki frekuensi yang paling
rendah sebanyak 3 pasien (tabel 4.1 ). Tidak ada perbedaan yang bermakna antara
TILs sebelum dan seduah kemoterapi pada pasien dibawah 50 tahun maupun
diatas 50 tahun (table 4.1). Selain itu tidak dijumpai adanya hubungan yang
bermakna dari Grade histopatologi dan tipe histology kanker payudara terhadap
respon patologi pada pasien yang diterapi dengan neoadjuvan kemoterapi. Grade
1 sebanyak 6 pasien yang mendapatkan respon patologi komplit, grade 2
sebanyak 12 pasien dan grade 3 sebanyak 4 pasien (Tabel 4.2 dan tabel 4.3).
Analisa data ini juga dijumpai tidak ada hubungan yang signifikan pada
penilaian TILs terhadap respon patologi pasien dengan kemoterapi neoadjuvan.
Namun dalam hal ini presentase TIls yang tinggi lebih sering mendapatkan respon
patologi komplit bila dibandingkan dengan presentase TILs yang rendah. Dalam
penelitian ini didapatkan 47,8 % atau sebanyak 11 sampel dari 23 sample dengan
high TILs dengan respon patologi komplit, sementara dijumpai hanya 28,8 %
serupa dengan penelitian Denkert, dkk 2010 dilaporkan bahwa respon patologis
komplit dijumpai 40% pada pasien dengan tumor ditandai oleh infiltrasi limfositik
yang tinggi, dan hanya 7,2% pasien tanpa infiltrate limfositik. Penelitian ini juga
telah dikonfirmasi peran prediksi tils pada pasien dengan kanker payudara yang
menjalani kemoterapi neoadjuvan dalam sebuah penelitian pada 68 pasien yang
diobati dengan regimen anthracycline dan taxane based. Dan dalam penelitian lainnya Denker tdkk, 2010 juga melaporkan peningkatan Tils setelah pemberian trantuzumab pada kanker payudara dengan HER2 terekspresi dan pada pemberian neoadjuvant kemoterapi dengan carboplatin. Para peneliti juga menemukan bahwa hampir setengahnya (47,4%) dengan tingkat tinggi dari infiltrasi limfosit memiliki respon lengkap patologis pada pasien dengan pengobatan neoadjuvant kemoterapi. Untuk setiap kenaikan10% dalam jumlah infiltrasi limfosit tumor, terdapat peningkatan sebesar 16% mendapatkan complete pathological respons
lengkap patologis baik analisis secara univariat dan multivariat, kehadiran tils
berbeda menurut subtype kanker payudara. Meningkatnya kehadiran dari tils
berhubungan dengan histologi duktal , high grade, tidak adanya ekspresi reseptor
hormone dan ekspresi tinggi dari antigen proliferasi Ki-67. Infiltrasi limfositik
memiliki korelasi yang signifikan pada pasien dengan triple-negative dimana
BAB VI
SIMPULAN DAN SARAN 6.1Simpulan
Dari penelitian tersebut belum dapat ditentukan adanya hubungan yang bermakna antara tumor infiltrasi limfosit sebelum kemoterapi terhadap respon patologi (P= 0,157) dengan Confident Interval (CI) 95 % (0,720-7,298) Ratio Prevalensi (RP; 2.292). Namun presentasi TILs yang tinggi lebih sering mendapatkan respon patologi komplit dibandingkan dengan TILs yang rendah.
6.2Saran
Informasi mengenai TILs dan pemeriksaan TILs yang rutin dapat terus dilakukan sehingga penelitian dapat lebih dikembangkan lebih lanjut dan TIls bisa saja menjadi salah satu parameter keberhasilan dalam terapi.
