LAPORAN AKHIR
PENELITIAN TIM PASCASARJANA
PENGEMBANGAN TEKNIK DIAGNOSIS GANGGUAN REPEAT BREEDER DAN PENANGGULANGANNYA
UNTUK MENINGKATKAN PRODUKTIVITAS SAPI ACEH
Tahun ke-2 dari 3 Tahun
Ketua : Prof. Dr. drh. Tongku N. Siregar, MP Anggota : Dr. drh. Sri Wahyuni, M.Si
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS SYIAH KUALA
SEPTEMBER, 2017
RINGKASAN
Tujuan jangka panjang penelitian ini adalah meningkatkan produktivitas sapi aceh melalui pencegahan dan pengobatan gangguan kasus kawin berulang (repeat breeder = RB). Penelitian ini terdiri atas 3 tahun. Pada Tahun II, penelitian bertujuan mengembangkan model diagnosis dan mengetahui faktor-faktor penyebab RB pada sapi aceh melalui gambaran folikel dan CL yang diobservasi melaui pemeriksaan postmortem, pemeriksaa mukus serviks, pemeriksaan histopatologis saluran reproduksi, kondisi bakteri pada saluran reproduksi, dan mengetahui faktor stres panas terhadap kematian embrio yang merupakan salah satu penyebab RB. Dalam penelitian ini digunakan 10 ekor sapi aceh berumur 3-8 tahun, skor kondisi tubuh >3, minimal telah melahirkan satu kali, dan mengindikasikan RB. Pemeriksaan saluran reproduksi ante mortem dilakukan melalui palpasi rektal. Ovarium diklasifikasikan berdasarkan kehadiran folikel, CL, dan abnormalitas. Uterus diklasifikasikan berdasarkan ukuran, tonus, serta ada tidaknya leleran. Vulva dan vagina diklasifikasikan secara visual normal atau tidak normal. Pemeriksaan postmortem dilakukan segera setelah hewan disembelih. Saluran reproduksi dibawa ke laboratorium untuk diperiksa secara mikroskopis. Pemeriksaan bakteriologi dilakukan dengan koleksi sampel dari lumen uterus seperti yang dilakukan pada Tahun I.
Pemeriksaan histopatologis juga dilakukan pada setengah bagian kornua uterus kiri dan kanan mengikuti prosedur standar. Hasil pemeriksaan sifat fisik mukus serviks pada sapi fertil vs sapi RB menunjukkan bahwa kuantitas mukus tidak ada/sedikit (0,00 vs 66,67%), warna keruh (0,00 vs 66,67%), konsistensi kental (0,00 vs 100%), pola pakis (0,00 vs 66,67%), spinnbarkeit (5,16±1,60 vs 2,83±2,02 cm) dan nilai pH (7,33±0,57 vs 9,33±1,52). Hasil swab uterus sapi pada sapi fertil maupun sapi RB, positif terinfeksi bakteri dan diperoleh 16 isolat bakteri di antaranya enam isolat berasal dari fertil dan sepuluh isolat berasal dari sapi RB. Dari 10 isolat bakteri Gram negatif yang ditemukan pada sapi RB terdiri atas Escherichia coli (30,00%), Pseudomonas sp. (30,00%), Enterobacter sp. (20,00%), Klebsiella sp. (20,00%).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kematian embrio terjadi pada K1 sebanyak 50%, sedangkan pada K2 tidak terjadi kematian kematian embrio setelah hari ke-25.
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa cekaman panas dapat menyebabkan kematian embrio dan terapi dengan GnRH dapat mengurangi kematian embrio. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbedaan cekaman panas tidak memengaruhi kinerja berahi dan konsentrasi estradiol tetapi memengaruhi angka konsepsi dan insidensi kematian embrio. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa sapi aceh yang mengalami RB mempunyai kuantitas mukus tidak ada/sedikit, warna lebih keruh, konsistensi kental, dan pH yang lebih rendah dibanding sapi aceh
yang fertil. Bakteri yang paling banyak menginfeksi uterus sapi RB adalah Escherichia coli dan Pseudomonas sp. Kinerja berahi sapi aceh pada kondisi stres panas lingkungan tidak dipengaruhi oleh metode sinkronisasi berahi dengan PGF2α atau ovsynch. Protokol ovsynch terbukti tidak dapat meningkatkan angka konsepsi sapi aceh dibandingkan perlakuan dengan PGF2α. Insiden kematian embrio yang terjadi akibat stres panas lingkungan dapat dikurangi dengan metode ovsynch.
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa peningkatan suhu lingkungan tidak memengaruhi kinerja berahi dan level estradiol sapi aceh tetapi dapat menurunkan angka konsepsi dan meningkatkan insidensi kematian embrio dini yang merupakan salah satu penyebab RB.
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT, karena berkat rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian dengan judul ‘PENGEMBANGAN TEKNIK DIAGNOSIS GANGGUAN REPEAT BREEDER DAN PENANGGULANGANNYA UNTUK MENINGKATKAN PRODUKTIVITAS SAPI ACEH' yang merupakan tahun ke- 2 dari rencana 3 tahun penelitian.
Dalam kegiatan penelitian ini, berbagai pihak telah banyak memberikan dorongan, bantuan serta masukan sehingga dalam kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Direktorat Riset dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Kementerian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi dan Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LP2M) Universitas Syiah Kuala atas kepercayaan yang diberikan melalui Hibah Penelitian Tim Pascasarjana Tahun Anggaran 2017.
2. Dekan dan semua sivitas akademika Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala atas dukungan dan bantuannya.
3. Laboratorium Riset Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala atas bantuan fasilitas Laboratorium dan sumber daya manusianya.
4. Semua pihak yang tidak dapat kami sebutkan satu per satu yang turut andil dalam pelaksanaan kegiatan penelitian ini.
Akhir kata, kami berharap penelitian ini memberikan manfaat bagi kita semua terutama untuk pengembangan ilmu pengetahuan di bidang ilmu reproduksi
Banda Aceh, September 2017
Prof. Dr. drh. Tongku N. Siregar, MP
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN PENGESAHAN...
RINGKASAN...
PRAKATA...
DAFTAR ISI...
BAB 1. PENDAHULUAN...
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA...
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN...
BAB 4. METODE PENELITIAN...
BAB 5. HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI...
BAB 6. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA...
BAB 7. DAFTAR PUSTAKA...
LAMPIRAN ...
ii iii v vi 1 3 3 8 20 43 44 47
BAB 1. PENDAHULUAN
Sapi aceh merupakan salah satu plasma nutfah sapi potong lokal yang ada di Indonesia selain sapi bali dan sapi madura. Keunggulan sapi potong lokal adalah mampu menunjukkan produktivitas dan efisiensi ekonomi yang maksimal pada berbagai kondisi yang terbatas. Oleh karena itu, sapi potong lokal lebih tepat dan ekonomis dikembangkan pada pola dan kondisi peternakan rakyat (Romjali et al., 2007). Penyebaran sapi aceh menurut laporan FAO (1996) terdapat di Aceh dan Sumatera Utara dengan jumlah yang tidak diketahui sampai saat ini. Namun, dari survei yang sudah dilakukan diketahui bahwa populasi sapi aceh berada pada posisi yang mengkhawatirkan dan mengalami kecenderungan penurunan. Jika penurunan populasi sapi aceh ini tidak diperhatikan maka dikhawatirkan populasi sapi aceh akan terancam punah.
Salah satu penyebab penurunan produktivitas sapi potong, termasuk sapi aceh, adalah tingginya kasus kawin berulang atau repeat breeder (RB). Gangguan RB terjadi pada sapi dengan abnormalitas yang tidak teramati tetapi gagal menjadi bunting setelah dikawinkan > 3 kali (Amiridis et al., 2009). Indikasi dari RB pada sapi adalah panjang calving interval 18-24 bulan, angka konsepsi < 40%, dan jumlah service per conception > 3 (Rustamaji et al., 2007).
Secara umum, faktor penyebab RB dapat dibagi 2 yakni kegagalan fertilisasi dan kematian embrio dini (Amiridis et al., 2009). El-Khadrawy et al. (2011) melaporkan beberapa faktor penyebab RB adalah genetik, infeksi bakteri, kelainan anatomi, dan ketidakseimbangan hormonal.
Insidensi RB pada beberapa ternak dilaporkan berbeda dengan insidensi tertinggi terdapat pada ternak sapi. Insidensi pada kerbau sebesar 0,7-8,33% (Ahmed et al., 2010), pada sapi sebesar 5,5-33,33% (Saxena, 2004), dan pada babi sebesar 8,6-11,3% (Tummaruk et al., 2000). Meskipun belum terdapat laporan angka gangguan RB pada sapi aceh, tetapi beberapa kondisi fisiologis dan manajemen yang sudah diperoleh pada penelitian sebelumnya (Siregar et al., 2014), diduga mempunyai peluang mengalami gangguan RB. Beberapa faktor tersebut antara lain adalah intensitas berahi yang rendah terutama pada suhu dan kelembaban yang tinggi, level steroid khususnya progesteron yang relatif rendah, dan manajemen pemeliharaan yang relatif belum baik.
Dari hasil riset sebelumnya diketahui bahwa terdapat kelemahan sapi aceh yang dapat berimbas pada tingginya insiden RB yakni rendahnya konsentrasi progesteron terutama pada fase puncak luteal. Fenomena yang menarik dari konsentrasi progesteron sapi aceh adalah konsentrasi puncak yang hanya berkisar 1,54 ng/ml pada hari ke-13 siklus (Siregar et al., 2014). Konsentrasi ini relatif lebih rendah dibandingkan dengan konsentrasi progesteron puncak pada sapi lain. Pada sapi Punganur, konsentrasi puncak dicapai pada hari ke-15 dengan konsentrasi progesteron mencapai 10,66 ng/ml (Naik et al., 2013). Pada sapi Holstein, konsentrasi puncak dicapai pada hari ke-14 dengan konsentrasi > 6 ng/ml (Henricks et al., 1970). Konsentrasi sapi aceh relatif sama dengan konsentrasi progesteron sapi Sahiwal pada fase midluteal yang dilaporkan sebesar 1,94+0,22 ng/ml (Mondal dan Prakash, 2003).
Wolfenson (2006) mengatakan bahwa rendahnya konsentrasi progesteron berhubungan dengan 2 masalah utama yakni stres pada musim panas dan keseimbangan energi negatif Rendahnya konsentrasi progesteron kemungkinan akan berhubungan dengan rendahnya fertilitas sapi aceh. Mann dan Lamming (1999) mengatakan rendahnya konsentrasi progesteron berdampak terhadap rendahnya angka konsepsi. Willard et al. (2003) menambahkan bahwa salah satu penyebab utama kematian embrio dini yang menjadi penyebab utama RB adalah tidak cukupnya fungsi luteal yang diindikasikan oleh rendahnya konsentrasi progesteron.
Konsentrasi progesteron dapat memengaruhi beberapa peristiwa fisiologis seperti dinamika folikel ovarium dan fungsi uterus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi progesteron dan estradiol pada sapi perah laktasi lebih rendah dibandingkan dengan sapi perah non-laktasi. Kondisi ini akan memengaruhi dinamika folikel ovarium. Sapi perah laktasi memiliki jumlah folikel yang lebih besar lebih banyak, folikel ovulasi yang lebih besar, konsentrasi estradiol yang lebih rendah, dan interval ovulasi yang lebih lama yang diikuti dengan rendahnya kemampuan folikel tersebut untuk membentuk embrio normal (Sota et al., 1993; Sartori et al., 2002). Selanjutnya (Mihm et al., 1999) menambahkan bahwa konsentrasi progesteron yang rendah merupakan predisposisi frekuensi pulsatik LH yang lebih tinggi dan mendorong terjadinya folikel persisten. Ketika folikel persisten berovulasi, oosit telah berada pada tahap pematangan. Oosit dapat mengalami fertilisasi tetapi akan diikuti dengan kematian embrio dini.
Metode diagnosis selama ini yang digunakan untuk mendiagnosis RB adalah dengan
melihat perpanjangan siklus estrus. Sapi-sapi yang kembali estrus 17-25 hari setelah inseminasi diangap mengalami kematian embrio dini (Erb dan Horz, 1958 yang disitasi Butterfield dan Lishman, 1988). Namun demikian, metode diagnosis dengan cara ini dianggap kurang tepat karena hanya terdapat perbedaan lama siklus yang relatif sedikit antar individu sapi sehingga perlu dikembangkan metode diagnosis yang tepat, mudah, dan murah dengan akurasi yang tinggi. Faktor rendahnya konsentrasi progesteron yang menjadi penyebab utama terjadinya kematian embrio dini berhubungan juga dengan rendahnya intensitas berahi dan rendahnya konsentrasi estradiol. Selain itu, faktor manajemen yang tidak baik akan berakibat tingginya jumlah bakteri di dalam saluran reproduksi. Oleh karena itu perlu dicari hubungan satu sama lain sehingga dapat diperoleh model prediksi terjadinya RB pada sapi aceh yang perlu dalam penetapan diagnosis dan terapinya. Model prediksi tersebut akan bermanfaat dalam mengurangi risiko RB pada sapi aceh.
Luaran kegiatan ini adalah peningkatan produktivitas sapi aceh dan mendukung implementasi dari Program Swasembada daging Sapi/Kerbau (PSDSK) yang dicanangkan oleh Pemerintah Pusat untuk mengurangi ketergantungan terhadap ternak impor. Peningkatan angka konsepsi hasil inseminasi buatan dan penurunan insiden kematian embrio dini akan meningkatkan ekonomi peternak karena sapi betina peternak akan mencapai produktivitas yang optimum yakni mampu menghasilkan satu anak dalam satu tahun.
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi Sapi Aceh
Sapi termasuk filum Chordata, kelas Mammalia, ordo Artiodactyla, famili Bovidae, genus Bos, dan subgenus Taurinae. Subgenus Taurinae terbagi atas 2 (dua) jenis yaitu Bos taurus dan Bos indicus. Bos indicus adalah golongan sapi-sapi yang memiliki punuk atau gumba Sapi aceh termasuk dalam sub genus Bos indicus (Abdullah, 2009).
Sapi aceh merupakan keturunan persilangan antara sapi lokal (diduga turunan Bos sondaicus) dengan sapi turunan zebu dari India (Bos indicus) yang terjadi ratusan tahun lalu (Basri, 2006). Awal percampuran Bos sondaicus dengan Bos indicus sulit ditentukan karena tidak ada catatan resmi. Bos indicus diduga masuk ke Aceh bersamaan dengan datangnya pedagang dari Gujarat (India) ke kerajaan Islam pertama di Peureulak (Aceh Timur) pada tahun 847 Masehi (225 Hijriyah) (Abdullah, 2009).
Departemen Pertanian Amerika Serikat atau United States Departement of Agriculture (USDA) sudah mengidentifikasi sapi aceh sebagai suatu bangsa sapi tersendiri (Aceh cattle breed) dengan nomor character based user interface (CUI) 133655001 (APHIS) (USDA, 2010). Hasil analisis deoxyribonucleic acid (DNA) mitokondria dan DNA mikrosatelit menunjukkan bahwa materi genetik sapi aceh berbeda dengan sapi bali, sapi madura, sapi PO, sapi pesisir dan bangsa sapi lain di dunia yang ditandai dengan urutan basa nukleotidanya yang spesifik.
Sapi aceh merupakan bangsa sapi tipe kecil yang ditemukan di daerah Aceh. Hasil penelitian menunjukkan bobot badan dan ukuran tubuh sapi aceh mengalami penurunan dibandingkan dengan bobot badan dan ukuran tubuh yang dilaporkan pada tahun 1926.
Ukuran tubuh sapi aceh lebih kecil pada tingkat umur yang sama, apabila dibandingkan sapi bali, sapi madura dan sapi PO, namun masih berada di atas rataan ukuran dan bobot badan sapi pesisir di Sumatera Barat. Rata-rata bobot hidup sapi aceh dewasa betina dan jantan masing-masing adalah 161,19 dan 191,78 kg (Abdullah, 2008). Abdullah (2008) melaporkan bahwa hampir seluruh populasi sapi aceh mempunyai garis muka yang cekung dan sebagian (4,5%) memiliki garis muka yang lurus. Secara umum sapi aceh mempunyai garis punggung yang cekung (89,25%), sebagian lainnya mempunyai garis punggung cembung (6,25%), dan
sebagian kecil mempunyai garis punggung lurus (4,5%). Secara kualitatif, sapi aceh mempunyai warna dominan merah bata dan coklat muda serta pola warna beragam mulai warna gelap sampai terang. Bentuk pertumbuhan tanduk sapi betina mengarah ke samping dan melengkung ke atas kemudian ke depan dan pada jantan mengarah ke samping dan melengkung ke atas.
Kematian Embrio Dini
Kematian embrio merupakan kasus yang menyebabkan kerugian ekonomi terbesar pada peternakan sapi. Kasus ini di Amerika terjadi 40.000.000 ekor sapi dan menyebabkan kerugian sekitar $ 1,2 milyar setiap tahunnya. Meskipun di Indonesia belum terdapat laporan kerugian ekonomi terhadap gangguan ini, namun diduga kondisi yang sama juga terjadi pada peternakan di Indonesia. Hal ini didasarkan dengan rendahnya produktivitas sapi dan panjangnya interval kelahiran.
Beberapa faktor terlibat dalam kematian embrio dini, yakni genotipe, nutrisi, asinkroni, progesteron, palpasi, dan faktor-faktor lain (Lamb, 2014). Faktor utama yang menyebabkan terjadinya kematian embrio dini adalah rendahnya konsentrasi progesteron.
Hormon progesteron adalah esensial untuk memelihara kebuntingan. Jika sapi tidak mempunyai level progesteron yang cukup, maka kebuntingan akan gagal dipertahankan.
Terdapat 2 faktor yang menyebabkan level progesteron rendah, yakni korpus luteum yang berumur pendek dan korpus luteum yang mensekresikan progesteron dengan konsentrasi rendah. Pada kategori pertama, luteolisis terjadi ketika embrio belum mensekresikan signal bTP-1, sedangkan pada kategori kedua, korpus luteum tidak dapat menekan efek luteolitik prostaglandin. Kedua kategori di atas bertanggung jawab terhadap terjadinya kematian embrio dini karena faktor hormonal (Robinson et al., 1989).
Pada sapi potong, dilaporkan bahwa tingkat fertilisasi hasil inseminasi buatan adalah 90-100% (Sreenan et al., 2001). Namun, hanya 70% dari perkawinan tersebut yang menghasilkan kebuntingan jika didiagnosis 30 hari kemudian. Kematian embrio didefinisikan sebagai kematian yang terjadi mulai hari 42 kebuntingan ketika diferensiasi dan implantasi telah terjadi. Kematian embrio selanjutnya dibagi menjadi dua kategori dan diklasifikasikan
sebagai early embryo mortality (EEM, kematian sampai hari ke- 27 ) dan late embryo mortality (LEM, kematian mulai hari 28-42) (Humbolt, 2001).
Pembentukan Mukus Serviks
Mukus serviks adalah lendir yang disekresikan oleh serviks selama berahi dan serviks merupakan salah satu bagian dari uterus (Abidin et al., 2012). Hormon estrogen yang bekerja pada organ kelamin betina akan menyebabkan peningkatan sekresi mukus serviks sehingga dijumpai adanya lendir yang menempel pada bagian vulva. Hormon estrogen tersebut diproduksi oleh folikel yang tumbuh pada saat ternak sedang berahi. Estrogen merupakan hormon yang berperan penting dalam intensitas berahi (Ismail, 2009).
Serviks yang terdiri atas sphincter otot polos yang kuat, dan tertutup rapat, kecuali pada saat terjadi berahi atau pada saat kelahiran. Pada saat berahi, serviks agak relaks sehinggga memungkinkan spermatozoa untuk memasuki uterus. Pada saat tersebut serviks akan mengeluarkan mukus yang kemudian mengalir ke vulva.
Peningkatan jumlah mukus juga diproduksi oleh sel-sel goblet pada serviks selama kebuntingan, guna mencegah masuknya zat-zat yang membawa infeksi dari vagina ke dalam uterus (Frandson,1986).
Mukus serviks di samping sebagai media bagi spermatozoa untuk mencapai tempat pembuahan, juga sebagai selektor terhadap spermatozoa (Cox et al., 1997;
Hafez dan Hafez, 2000). Di bawah pengaruh hormon gonad, mukus serviks mengalami perubahan sifat fisik dan kimia akibat adanya perubahan hormonal pada saat estrus (Eltohamy et al., 1990). Sifat fisik mukus serviks yang meliputi warna (tampilan), konsistensi, elastisitas, pola pakis dan pH akan mengalami perubahan pada sapi yang mengalami RB (Mohanty et al., 1996).
Pengaruh Mukus Serviks Terhadap Sistem Reproduksi
Kawin berulang pada sapi telah diakui sebagai salah satu masalah reproduksi yang paling serius dalam dunia peternakan sapi. Sindrom ini menyebabkan kerugian ekonomi akibat tingkat penurunan konsepsi pada sapi. Sifat mukus serviks memiliki pengaruh yang besar pada aktivitas spermatozoa dalam saluran reproduksi betina.
Mukus serviks menunjukkan perubahan siklik dalam sifat fisik dan kimia di bawah kendali hormon gonad dan kesuburan berhubungan dengan melihat sifat fisik mukus serviks tersebut seperti warna, konsistensi, pola pakis, pH dan spinnbarkeit mukus serviks estrual (Modi et al., 2011).
Setelah dideposisikan ke saluran reproduksi betina, spermatozoa akan berjalan ke lingkungan yang berbeda untuk mencapai tempat fertilisasi. Saat semen dideposisikan ke dalam vagina maupun serviks pada saat inseminasi buatan mukus serviks akan menfilter dan mengeluarkan spermatozoa yang memiliki morfologi dan motilitas yang buruk (Saurez dan Pacey, 2006).
Selama periode proestrus, tingginya estrogen akan memengaruhi saluran kelamin betina dan ditemukan edema, tonik dan sekresi lendir yang tinggi, yang mengakibatkan beratnya aliran mukus serviks (Roelofs et al., 2010). Rasio air dan konsentrasi elektrolit dapat memengaruhi perubahan sifat reologi mukus serviks yang dipengaruhi oleh glikoprotein. Pada fase folikuler, kuantitas mukus serviks akan menjadi meningkat, lebih encer, tembus pandang, dan kurang kental yang membuat spermatozoa mudah melintasi saluran betina selama fase folikuler dibandingkan dengan fase luteal selama siklus estrus berlangsung. Ketika kuantitas mukus serviks sedikit dan kental, hal ini tidak menguntungkan bagi penetrasi spermatozoa (Rutllant et al., 2005).
Infeksi Bakteri pada Kasus RB
Infeksi bakteri merupakan hal yang paling penting di antara berbagai penyebab subfertilitas (Dholakia et al., 1987). Kolonisasi bakteri dapat menyebabkan servisitis atau endometritis bermacam tingkat, yang pada gilirannya dapat
menyebabkan kematian embrio dan masalah RB (Elliott et al., 1968). Infeksi genital sapi, baik spesifik atau non-spesifik di alam, terhitung sebagai sejumlah besar kegagalan kebuntingan pada sapi (Sirohi et al., 1989). Umumnya, infeksi bakteri non- spesifik dari saluran reproduktif sapi adalah penyebab utama dari RB (Dinesh et al., 2006).
Uterus sapi dan serviks yang steril sebelum partus memberikan penghalang terhadap invasi intra-uterin oleh patogen selama masa kebuntingan (Sheldon dan Dobson, 2004). Pada saat melahirkan, uterus dapat terinfeksi oleh infeksi mikroorganisme non-spesifik yang berasal dari lingkungan. Beberapa infeksi yang umum pada periode pasca partus yaitu bakteri, protozoa, virus, dan mikoplasma.
Bakteri yang umum menginfeksi uterus adalah Actinomyces spp., Escherichia coli, Fusobacterium spp., Pasteurella spp., Pseudomonas spp., dan Staphylococcus spp.
(Erin et al., 2005) dan beberapa organisme yang paling banyak terlibat adalah Escherichia coli, Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus dan Klebsiella (Ahmed dan Bhattacharyya, 2005; Gani, et al., 2008).
Infeksi uterus dapat terjadi gangguan besar dalam manajemen reproduksi karena tidak efisien bila dilakukan deteksi estrus (Sheldon dan Dobson, 2004).
Infeksi ini juga dapat memengaruhi kesuburan dengan mengubah lingkungan uterus yang mengakibatkan gangguan transport sperma, kematian sperma dan lingkungan yang tidak sesuai untuk perkembangan embrio dan pemeliharaan hasil konsepsi yang mengarah ke kematian (Rahman et al., 1996). Kejadian infeksi uterus pada sapi menurun dengan meningkatnya periode pasca partus, mulai dari 90% dalam 25 hari pasca partus sampai 9% pada 46-60 hari pasca partus (Gilbert et al,. 2005).
Faktor lain yang mungkin menyebabkan RB adalah infeksi dan gangguan reproduksi seperti distokia, retensi plasenta, prolapsus uterus, dan gangguan ovarium.
Infeksi pada uterus dapat terjadi baik setelah perkawinan (karena tidak hygienes dan tidak prosedural) atau setelah partus (masa puerpureum) dapat menyebabkan endometritis (radang pada endometrium) (Robert, 1986). Endometritis dapat juga
disebabkan oleh kelanjutan distokia, prolapsus uterus, retensi plasenta, dan lingkungan yang buruk. Lingkungan yang buruk terutama pada pasca partus akan memudahkan masuknya mikroba ke dalam lumen uterus, mencemari lingkungan lumen uterus, mengganggu kehidupan embrio dan ini dapat menyebabkan kematian embrio dini. Gejala adanya kematian embrio dini pada sapi perah yang sudah dikawinkan adalah timbulnya kawin berulang (Arthur, 2001).
Sapi dengan infeksi uterus pada periode pasca partus umumnya memiliki tingkat konsepsi yang rendah di suatu peternakan. Persentase yang tinggi dari sapi yang terdapat bakteri dalam uterus selama dua minggu pertama setelah melahirkan dapat dianggap sebagai terinfeksi. Namun, dua bulan pasca partus, prevalensi penurunan infeksi uterus menjadi kurang dari 10%. Meskipun, bakteri pathogen bertahan dalam beberapa sapi menyebabkan penyakit uterus dapat mencegah involusi uterus secara fisiologis yang mengakibatkan sub-fertilitas pada sapi individu atau bahkan di seluruh populasi (Opsomer et al., 1996).
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
Tujuan Penelitian
1. Mengetahui metode diagnosis RB pada sapi aceh yang meliputi gambaran folikel dan CL selama siklus
2. Mengetahui metode diagnosis melalui pemeriksaan bakteri pada saluran reproduksi dan diagnosis post-mortem
3. Mengetahui metode diagnosis melalui pemeriksaan histopatologis saluran reproduksi
4. Mengetahui perubahan sifat fisik mukus serviks dari sapi yang mengalami RB.
5. Mengetahui kinerja berahi sapi aceh pada kondisi stres panas lingkungan yang diinduksi dengan protokol sinkronisasi berahi pola ovsynch?
6. Mengetahui angka konsepsi sapi aceh pada kondisi stres panas lingkungan yang diinduksi dengan protokol sinkronisasi berahi pola ovsynch?
7. Mengetahui persentase kematian embrio sapi aceh pada kondisi stress panas lingkungan yang diinduksi dengan protokol sinkronisasi berahi pola ovsynch?
8. Mengetahui konsentrasi progesteron sapi aceh bunting pada kondisi stres panas lingkungan yang diinduksi dengan protocol sinkronisasi berahi pola ovsynch?
9. Mengetahui konsentrasi proegesteron sapi aceh yang mengalami kematian embrio?
10. Mengetahui perbedaan kinerja berahi sapi aceh pada dua periode stres panas lingkungan yang berbeda.
11. Mengetahui penurunan angka konsepsi sapi aceh pada lingkungan panas yang lebih tinggi.
12. Mengetahui penurunan konsentrasi estradiol sapi aceh pada lingkungan panas yang lebih tinggi.
13. Mengetahui peningkatan kematian embrio sapi aceh pada lingkungan panas yang lebih tinggi.
Manfaat Penelitian
Gangguan RB pada ternak merupakan salah satu penyebab utama infertilitas. Ternak sapi mempunyai angka insidensi tertinggi dibandingkan ternak lainnya. Kerugian utama RB bersifat ekonomis karena menurunnya produktivitas ternak meskipun secara klinis ternak terlihat sehat dan kesehatan reproduksi dianggap normal, tanpa terdapat hal-hal gangguan yang dapat diamati. Kondisi ini mengakibatkan RB jarang sekali ditangani secara serius.
Faktor utama penyebab RB adalah kegagalan fertilisasi dan kematian embrio dini.
Kegagalan fertilisasi biasanya berhubungan dengan ketidaktepatan waktu perkawinan akibat gejala berahi yang tidak mampu diamati dengan baik. Intensitas berahi yang rendah ini berhubungan dengan dinamika folikel dan level steroid. Pada sapi aceh, laporan sebelumnya membuktikan bahwa intensitas berahi relatif kurang baik terutama pada musim ketika suhu dan kelembaban sangat tinggi seperti pada saat bulan Mei-Juli. Selain itu, level hormonal pada sapi aceh yang rendah, khususnya progesteron pada fase luteal, berkontribusi dalam rendahnya intensitas berahi. Gambaran kedua kondisi di atas dapat diobservasi melalui pengamatan dinamika folikel dan CL.
Faktor utama lain penyebab RB adalah kematian embrio dini. Kematian embrio dini dapat terjadi pada sapi aceh yang berhubungan dengan rendahnya level progesteron dan buruknya manajemen pascapartus. Manajemen pascapartus yang tidak baik akan menyebabkan tingginya koloni bakteri pada saluran reproduksi, khususnya uterus, sehingga akan berdampak pada dua hal yakni kegagalan fertilisasi dan kematian embrio dini.
Melalui pemeriksaan dan diagnosis yang menyeluruh terhadap faktor-faktor penyebab RB pada sapi aceh maka akan dapat ditetapkan metode untuk penanggulangannya.
Penanggualngan tersebut dapat dilakukan baik dengan cara membuat keseimbangan hormonal tercapai maupun dengan cara mengurangi populasi bakteri di dalam saluran reproduksi sehingga angka konsepsi menjadi lebih tinggi, service per conception menjadi lebih rendah, dan gangguan RB dapat diminimalkan.
BAB 4. METODE PENELITIAN
Eksperimen 1.
Hewan Coba
Dalam penelitian ini digunakan 10 ekor sapi aceh berumur 3-8 tahun, skor kondisi tubuh >3, minimal telah melahirkan satu kali, dan mengindikasikan RB.
Pemeriksaan Ante Mortem
Pemeriksaan saluran reproduksi ante mortem dilakukan melalui palpasi rektal.
Ovarium diklasifikasikan berdasarkan kehadiran folikel, CL, dan abnormalitas. Uterus diklasifikasikan berdasarkan ukuran, tonus, serta ada tidaknya leleran. Vulva dan vagina diklasifikasikan secara visual normal atau tidak normal (Neves, 1976).
Pemeriksaan Bakteriologi Isolasi Bakteri
Mikroba lumen uterus dianalisis dengan menumbuhkan sampel uterus pada media kultur primer menggunakan plat agar darah dan MCA. Kemudian diinkubasi pada suhu 37° C selama 24 jam. Setelah itu, dilakukan pewarnaan Gram untuk melihat morfologi bakteri secara mikroskopis dan uji biokimia untuk mengidentifikasi bakteri.
Pewarnaan Gram
Preparat apus bakteri dibuat dengan cara mencampurkan satu biakan bakteri dengan NaCl fisiologis yang telah diteteskan pada obyek gelas, kemudian dibuat apus setipis mungkin, dikeringkan, dan difiksasi di atas lampu spiritus. Preparat apus ditetesi pewarna pertama dengan karbol gentian (kristal) violet selama 2 menit, dicuci dengan air mengalir, ditetesi lugol selama 1 menit, kemudian preparat apus dilunturkan dengan alkohol 90% selama 10 detik. Selanjutnya alkohol dibuang, preparat dicuci dengan akuades dan diberi pewarna kedua dengan larutan safranine
selama 1 menit. Warna kemudian dibuang dan dibersihkan dengan akuades, dikeringkan dan diamati morfologi sel, serta warnanya diamati di bawah mikroskop.
Bakteri dikelompokkan sebagai Gram positif apabila selnya terwarnai keunguan, dan Gram negatif apabila selnya terwarnai merah.
Identifikasi Bakteri
Uji biokimia dilakukan untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat-sifat biokimiawinya. Beberapa uji biokimia yg dilakukan yaitu uji oksidase, uji katalase, uji gula-gula, uji urease, uji penggunaan sitrat, uji motility, uji MR-VP, uji TSI, dan uji lisin. Pada uji oksidase, menggunakan reagen/larutan tetramethyl-paraphenyldiamine.
Media-media yang digunakan untuk uji gula-gula yaitu media glukosa, laktosa, maltosa, dan sukrosa yang ditambahkan dengan indikator phenol red. Pada uji urease menggunakan media urea broth dan urea agar. Pada uji penggunaan sitrat menggunakan media Simmons citrat. Uji MR-VP pada media MR menggunakan indikator larutan alpha-naphtol 5% dan pada media VP menggunakan indikator KOH 40%. Media SIM digunakan untuk uji motility, media TSIA digunakan untuk mengetahui bakteri yang dapat menfermentasi gula dan uji lisin menggunakan media LIA.
Koleksi Mukus Serviks
Organ genitalia eksternal seluruh sapi dibersihkan dengan larutan antiseptik ringan dan dikeringkan dengan kapas. Sampel mukus serviks dikumpulkan dengan metode aspirasi menggunakan kateter steril yang dihubungkan dengan disposible syringe 50 ml. Kateter dimasukan melalui vagina yang diikuti dengan palpasi rektal agar mudah mengarahkan pipet kaca masuk ke leher uterus atau dekat lipatan vagina.
Sampel mukus serviks dikumpulkan diperiksa untuk kuantitas, warna, konsistensi, pola pakis, spinnbarkeit, dan pH. Kuantitas dapat diklasifikasi menjadi tidak ada/sedikit, sedang, dan banyak sekali. Warna mukus yang diperoleh
diobservasi tampilannya secara visual, yang diklasifikasikan menjadi cerah, berawan, atau keruh. Konsistensi mukus diperoleh dengan meneteskan 2-3 tetes di atas objek gelas bersih dan dimiringkan. Mukus yang telah diobservasi dikelompokkan ke dalam tiga konsistensi yang berbeda (Deo and Roy, 1971) yakni kental, sedang, atau tipis. Untuk melihat pola pakis (fern pattern), mukus serviks diletakkan atau diteteskan pada objek gelas lalu dikering-udarakan. Setelah preparat mengering, kemudian diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 dan 10 x 40. Pola pakis dapat diklasifikasikan berdasarkan tipikal, atipikal, atau nihil. Untuk mengetahui spinnbarkeit, 2-3 tetes mukus serviks ditempatkan pada objek gelas bebas lemak dan objek gelas lainnya ditempatkan di atasnya. Kedua objek gelas perlahan-lahan dijauhkan satu sama lain. Jarak antara dua slide diukur dengan tali sebelum lendir terputus dengan skala cm (Panigrahi, 1964). Nilai-nilai spinnbarkeit dikelompokkan menjadi 0-8; 8-16; 16-24; dan >24 cm. pH diukur dengan menggunakan alat indikator universal. pH dapat dikategorikan ke dalam grup: <7,0;
7,0-7,5; 7,5-8,0; dan >8,0.
Analisis Data
Seluruh data hasil penelitian dilaporkan secara deskriptif.
Eksperimen 2.
Sampel penelitian
Sampel penelitian yang digunakan adalah 20 ekor sapi aceh betina dewasa, umur 5-8 tahun, bobot badan 150-250 kg, dan telah mengalami minimal dua kali siklus reguler. Seluruh sapi yang digunakan dalam penelitian ini merupakan sapi aceh milik Balai Pembibitan Ternak Unggul Indrapuri (BPTU), Aceh Besar. Sapi yang digunakan secara klinis sehat dan mempunyai skor kondisi tubuh dengan kriteria baik. Sapi dipelihara di padang penggembalaan dengan pemberian pakan hijauan dan konsentrat. Sapi-sapi dikelompokkan dalam dua kelompok penelitian, masing-masing berjumlah sepuluh ekor yang digunakan pada dua perlakuan yang
berbeda (Mei-Juni) untuk menguji efek panas lingkungan terhadap kinerja reproduksi sapi aceh. Pengukuran suhu dilokasi BPTU Indrapuri dilakukan setiap hari, yakni pada pagi hari (09.00 WIB), siang hari (14.00 WIB), dan sore hari (18.00 WIB).
Pemilihan waktu kegiatan berdasarkan informasi yang diperoleh dari Badan Meteorologi, Klimatologi, dan Geofisika (BMKG) Indrapuri, yang memperkirakan pada bulan Mei dan Juni terdapat suhu yang ekstrim di Provinsi Aceh.
Prosedur Penelitian Sinkronisasi Berahi
Seluruh sapi dibagi ke dalam dua kelompok, masing-masing terdiri atas sepuluh ekor. Pada kelompok 1 (K1) disinkronisasi berahi dengan menggunakan PGF2α sebanyak 25 mg secara intramuskulus (LutalyseTM, Pharmacia & Upjohn Company, Pfizer Inc.) dengan pola penyuntikan ganda dengan interval 11 hari, sedangkan pada kelompok 2 (K2) disinkronisasi berahi dengan menggunakan protokol ovsynch.
Protokol ovsynch diawali pada hari ke-0 dengan penyuntikan GnRH (FertagylTM, Merck, Animal Health) yang berisi 50 µg gonadoreline diacetate tertahydrate/ml dengan dosis 100 µg. Pada hari ke-7 seluruh sapi diinjeksi kembali dengan sebanyak 25 mg secara intramuskulus (LutalyseTM, Pharmacia & Upjohn Company, Pfizer Inc.) Selanjutnya pada hari ke-9 diinjeksi kembali dengan 100 µg GnRH.
Inseminasi Buatan
Perkawinan dilakukan dengan teknik inseminasi buatan menggunakan semen beku sapi aceh. Sebelum inseminasi, dilakukan pemeriksaan motilitas semen beku yang digunakan. Semen beku yang digunakan minimal mempunyai motilitas >70%.
Inseminasi dilakukan 12 jam setelah gejala berahi muncul. Inseminasi dilakukan oleh seorang inseminator yang telah memiliki sertifikasi.
Pemeriksaan Kebuntingan dan Diagnosis Kematian Embrio Dini
Pemeriksaan kebuntingan dilakukan dengan menggunakan metode transrektal ultrasonografi pada hari ke-25 setelah inseminasi. Pemeriksaan diulang setiap 10 hari sampai hari ke-55 pasca-inseminasi sesuai dengan petunjuk Chaudhary dan Purohit (2012). Ultrasonografi transrektal dilakukan menggunakan scanner ultrasound yang dilengkapi dengan transducer 5 MHz (Ultrascan 90 Alliance, Quebec C). Sapi dianggap bunting pada hari ke-25 pascainseminasi didasarkan adanya cairan anechoic dengan visualisasi embrio dan detak jantung pada salah satu kornua uterus sedangkan kematian embrio didiagnosis mulai hari ke-35 yang didasarkan visibilitas non- embrio, tidak terdapatnya tanda-tanda positif dari kebuntingan, atau adanya tanda- tanda embrio mengalami degenerasi.
Koleksi Darah dan Pemeriksaan Konsentrasi Steroid
Sampel darah untuk pemeriksaan hormon progesteron dikoleksi dari vena jugularis pada hari ke-7 pasca-inseminasi buatan. Darah yang diambil dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditempatkan dalam termos berisi es. Darah kemudian dibawa ke dalam laboratorium untuk diambil plasmanya dan didiamkan selama 30 menit sebelum dilakukan sentrifugasi. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 2500 rpm selama 15 menit. Plasma kemudian diambil dari tabung dan dimasukkan dalam tabung mikro (microtube). Plasma disimpan dalam freezer -20º C sampai saat digunakan untuk analisis hormonal.
Pemeriksaan konsentrasi steroid dilakukan dengan metode enzyme linked absorbant immunoassay (ELISA). Kit yang digunakan adalah DRG Progesterone ELISA (DRG Instrumenst GmbH, Germany). Pada masing-masing well (sumur) plat ELISA dimasukkan 25 µl larutan standar, sampel, dan kontrol lalu diinkubasikan selama lima menit pada suhu ruang. Selanjutnya dicampur dengan 200 µl reagen konyugat progesteron-HRP atau estrogen HRP lalu diinkubasikan selama 60 menit pada suhu ruang dan dikocok dengan cepat untuk mengeluarkan isi well lalu bilas well sebanyak tiga kali dengan menambahkan larutan pencuci sebanyak 400 µl pada
setiap well. Pada masing-masing well dimasukkan sebanyak 200 µl larutan substrate solution dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Reaksi enzimatik dihentikan dengan menambahkan 100 µl larutan stop solution pada masing-masing well. Nilai absorbansi dibaca dengan ELISA reader dalam waktu 10 menit dengan panjang gelombang 450 nm.
Analisis Data
Data kinerja berahi dan konsentrasi progesteron pada sapi bunting dianalisis dengan uji t. Hubungan antara konsentrasi progesteron pada hari ke-5 pasca-inseminasi dianalisis secara deskriptif .
Eksperimen 3.
Sampel penelitian
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 20 ekor sapi aceh betina dewasa, umur 5-8 tahun, bobot badan 150-250 kg, dan mempunyai minimal dua siklus reguler. Seluruh sapi yang digunakan dalam penelitian ini merupakan sapi aceh milik Balai Pembibitan Ternak Unggul Indrapuri, Aceh Besar. Sapi yang digunakan secara klinis sehat dan mempunyai skor kondisi tubuh dengan kriteria baik. Pakan yang diberikan merupakan pakan standar dari Balai Pembibitan Ternak Unggul Indrapuri, yakni hijauan dan konsentrat. Sapi-sapi dikelompokkan dalam dua kelompok penelitian, masing-masing berjumlah 10 ekor yang digunakan pada dua periode yang berbeda untuk menguji efek panas lingkungan terhadap kinerja reproduksi sapi aceh. Pemilihan waktu kegiatan berdasarkan informasi yang diperoleh dari Badan Meteorologi, Klimatologi, dan Geofisika (BMKG) Indrapuri, yang memperkirakan pada bulan Mei dan Juni terdapat suhu yang ekstrim sedangkan pada bulan November dan Desember suhu relatif normal di Provinsi Aceh.
Prosedur Penelitian Sinkronisasi Berahi
Seluruh sapi disinkronisasi berahi mengunakan PGF2α sebanyak 5 mg/ml secara intramuskular (LutalyseTM, Pharmacia & Upjohn Company, Pfizer Inc.) dengan pola penyuntikan ganda dengan interval sebelas hari. Sapi yang digunakan adalah sapi yang tidak bunting, tetapi memiliki korpus luteum. Sapi-sapi tersebut diberi pakan hijauan dua kali sehari dan konsentrat sekali serta air minum ad libitum.
Hari ketika sapi menunjukkan estrus dianggap sebagai hari ke-0.
Pengukuran Kinerja Berahi Deteksi Estrus
Pengamatan estrus sebagai respons sinkronisasi dilaksanakan 24 jam setelah pemberian preparat sinkronisasi terakhir, yang dilakukan selama ±1 jam. Sapi dengan tanda-tanda estrus primer dan sekunder seperti standing heat, menaiki sapi lain, gelisah, vulva merah dan bengkak, keluarnya mukus serviks, dan penurunan nafsu makan dilakukan skoring pada skala 0-5, yaitu 5 = excellent, standing, menaiki sapi lain, gelisah, vulva merah dan bengkak, keluarnya mukus serviks, dan penurunan nafsu makan; 4 = good (standing, menaiki sapi lain, vulva merah dan bengkak, dan keluarnya mukus serviks; 3 = normal: vulva merah dan bengkak, keluarnya mukus serviks, dan penurunan nafsu makan; 2 = fair: vulva merah dan bengkak dan penurunan nafsu makan; dan 1 = poor, penurunan nafsu makan; dan 0 = tidak estrus (Sonmez et al. 2005).
Inseminasi Buatan
Sapi yang memperlihatkan gejala berahi pada pagi hari (standing heat) saat dilakukan observasi akan diinseminasi pada sore harinya sedangkan sapi yang memperlihatkan gejala berahi pada sore hari akan diinseminasi pada pagi hari keesokan harinya. Perkawinan dilakukan dengan teknik inseminasi buatan
menggunakan semen beku sapi aceh. Sebelum inseminasi, dilakukan pemeriksaan motilitas semen beku yang digunakan. Semen beku yang digunakan minimal mempunyai motilitas >70%.
Pemeriksaan Kebuntingan
Setelah 25 hari inseminasi dilakukan pemeriksaan kebuntingan menggunakan metode ultrasonography dengan scanner ultrasound yang dilengkapi dengan transduser 5 MHz (Ultrascan 90 Alliance, Quebec C). Sapi dianggap bunting pada hari ke-25 pasca-inseminasi didasarkan adanya cairan anechoic dengan visualisasi embrio dan detak jantung pada salah satu kornua uterus. Untuk pemeriksaan kematian embrio, dilakukan diagnosis dengan USG pada hari ke-35, 45, dan 55 pasca- inseminasi.
Koleksi Darah dan Pemeriksaan Konsentrasi Estradiol
Sampel darah untuk pemeriksaan hormon estradiol dikoleksi dari vena jugularis sesaat setelah inseminasi buatan. Darah yang diambil dimasukkan dalam tabung reaksi yang diberikan antikoagulan (EDTA) dan ditempatkan dalam termos berisi es. Darah kemudian dibawa ke dalam laboratorium untuk diambil plasmanya dan didiamkan selama 30 menit sebelum dilakukan sentrifuga. Sentrifuga dilakukan dengan kecepatan 2500 rpm selama 15 menit. Plasma kemudian diambil dari tabung mikro. Plasma disimpan dalam freezer -20°C sampai saat digunakan untuk analisis hormonal.
Pemeriksaan konsentrasi steroid dilakukan dengan metode enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Kit yang digunakan adalah kit Estradiol ELISA (DRG Instrument Gmbh, Germany). Prosedur analisis dimulai denagn memasukkan 25 µl larutan standar, sampel, dan kontrol pada masing-masing well, lalu diinkubasikan selama 5 menit pada suhu ruang. Selanjutnya dicampurkan dengan 200 µl reagen konyugat progesterone-HRP atau esterogen HRP lalu diinkubasikan selama
60 menit pada suhu ruang dan dikocok dengan cepat untuk mengeluarkan isi well lalu bilas well sebanyak 3 kali dengan menambahkan larutan pencuci sebanyak 400 µl pada setiap well. Pada masing-masing well dimasukkan sebanyak 200 µl larutan substrate solution dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Reaksi enzimatik dihentikan dengan menambahkan 100 µl larutan stop solution pada masing-masing well. Nilai absorbansi dibaca pada ELISA reader dalam waktu 10 menit pada panjang gelombang 450±10 nm.
BAB 5. HASIL DAN LUARAN YANG DICAPAI
Eksperimen 1.
Sampel mukus serviks yang dikumpulkan diperiksa kuantitas, warna, konsistensi, pola pakis, spinnbarkeit, dan pH. Dari hasil pemeriksaan mukus serviks sapi fertil, dua sapi memperlihatkan lendir serviks menunjukkan kuantitas banyak (66,67%) dan satu sampel dengan kuantitas sedang (33,37%). Pada sapi yang mengalami RB, kuantitas mukus menunjukkan tidak ada/sedikit (66,67%) sedangkan kuantitas sedang (33,37%). Perbedaan tersebut menunjukkan bahwa sapi yang mengalami RB memiliki proporsi mukus serviks yang lebih sedikit dibandingkan dengan sapi fertil. Peningkatan air dan konsentrasi elektrolit dalam lendir serviks, mengubah glikoprotein dan rasio air yang mengarah ke perubahan pada sifat mukus serviks, sehingga meningkatkan jumlah mukus serviks, mukus serviks lebih encer, tembus, tidak kental sehingga memudahkan spermatozoa untuk melintas menuju ke tempat fertilisasi dibandingkan dengan kuantitas lendir sedikit yang tidak menguntungkan untuk penetrasi sperma (Rutllant et al., 2005).
Tingkat kekeruhan lebih tinggi pada sapi RB (66,67%) dibandingkan sapi fertil yang menunjukkan warna yang cerah (100%). Hasil ini sesuai dengan laporan penelitian Zaman et al. (2013), bahwa tingkat konsepsi yang maksimum ditemukan pada sapi yang memiliki mukus serviks yang berwarna cerah. Mukus serviks yang bewarna cerah jelas kondusif untuk penetrasi sperma, sedangkan motilitas sperma akan terhambat oleh mukus serviks yang keruh. Hormon steroid yang dihasilkan ovarium akan menginduksi perubahan fisikokimia seperti karakteristik warna mukus serviks sehingga dapat memfasilitasi berjalannya spermatozoa. Menurut Enkhia dan Kohli (1982) umumnya warna mukus serviks dilaporkan menjadi faktor dalam penetrasi sperma dan konsepsi. Kekeruhan pada mukus serviks akan menahan pergerakan (motilitas sperma) menuju ke tempat pembuahan. Untuk kesuburan yang optimal, warna mukus serviks harus cerah dan transparan (Lopez-Gatius et al., 1993).
Konsistensi kental; sedang; dan tipis mukus serviks pada sapi fertil masing- masing adalah 0,00; 33,33; dan 66,67%. Pada sapi yang mengalami RB seluruhnya memiliki konsisten kental (100%). Hasil tersebut sesuai dengan laporan Sukh dan Roy (1971), bahwa tingkat konsepsi yang lebih tinggi diamati pada sapi yang fertil dengan konsistensi tipis (100%). Konsistensi mukus serviks yang tipis meningkatkan kelangsungan transportasi dan kehidupan spermatozoa. Menurut Mufti et al. (2010) tingkat konsepsi 47,54% terjadi pada mukus serviks yang memiliki konsistensi tipis sampai konsistensi sedang, yang menyebabkan meningkatnya migrasi spermatozoa pada saluran reproduksi betina. Gabungan antara mukoprotein dan penetrasi yang lemah dari sperma akan menghalangi pergerakan progresif spermatozoa yang menjadi penyebab tingkat konsepsi lebih rendah pada mukus serviks yang memiliki konsistensi kental.
Dari tiga sapi fertil, dua ekor (66, 67%) menunjukkan pola pakis atipikal dan satu ekor (33,33%) nihil, sedangkan pada sapi yang mengalami RB, dua ekor (66,67%) menunjukkan pola yang tipikal dan (33,33%) atipikal. Hasil ini tidak sesuai dengan pendapat Modi et al. (2011) yang menyebutkan bahwa angka konsepsi maksimum ditunjukkan pada sapi fertil yang memiliki pola pakis tipikal dibandingkan dengan sapi yang mengalami RB yang memiliki pola pakis atipikal dan nihil.
Pola pakis terbentuk karena adanya kristalisasi, diproduksi oleh agregasi molekul yang mengarah ke formasi dari inti kristal (nukleasi). Mukus serviks dapat mengkristal karena mukus serviks mengandung mukoprotein (misalnya, mucins) atau senyawa organik lainnya dan elektrolit, terutama garam, seperti NaCl, KCl, dan CaCl.
Bahkan, NaCl adalah garam utama yang ditemukan dalam mukus serviks (Cortes et al., 2014).
Tipologi ferning lendir serviks akan memberikan gambaran yang berbeda- beda sesuai dengan siklus atau periode berahinya. Semakin mendekati ovulasi maka gambarannya menjadi lebih jelas, karena meningkatnya konsentrasi hormon estrogen.
Pola kristalisasi lendir serviks memiliki keterkaitan dengan aktivitas kerja ovarium
betina. Pola-pola kristalisasi akan segera terbentuk sebelum, selama, dan setelah estrus. Noonan et al. (1975) menyatakan bahwa pattern ferning (pola pakis) dari lendir vagina dan serviks yang sudah dikeringkan terjadi pada tingkat yang lebih besar pada hari estrus dibandingkan selama setiap tahap lain dari siklus estrus.
Selama siklus estrus, konsentrasi vagina dan lendir serviks mencapai nilai minimum pada hari estrus dan nilai maksimum pada pertengahan estrus (midestrus).
Pengambilan mukus serviks yang tidak pada pertengahan estrus (midestrus) kemungkinan yang menyebabkan pola pakis yang terbentuk atipikal pada sapi fertil.
Nilai rata- rata spinnbarkeit mukus serviks pada sapi fertil dan sapi RB masing-masing adalah 5,16±1,60 dan 2,83±2,02 cm. Nilai spinnbarkeit pada sapi fertil berada di kisaran 0-8 cm (67,77%) dan 8-16 cm (33, 33%) dan pada sapi yang mengalami RB nilai spinnbarkeit berada di kisaran 0-8 cm (100%). Modi et al.
(2011) menyatakan bahwa tingkat konsepsi lebih baik pada nilai spinnbarkeit yang lebih besar.
Pada sapi fertil, nilai pH mukus serviks selama estrus berkisar 7,0-8,5 dengan rata-rata 7,33±0,57 . Hasil ini sesuai dengan pengamatan yang dilakukan oleh Methai et al. (2005). Nilai pH mukus serviks pada sapi RB berkisar 8,0-11 dengan rata-rata 9,33±1,52. Hasil ini sesuai dengan laporan dari Rane dkk. (1992), bahwa pH mukus serviks pada sapi yang mengalami RB lebih tinggi dari mukus serviks sapi yang fertil.
pH mukus serviks menunjukkan status lingkungan uterus pada saat pembuahan.
Hafez dan Hafez (2000) menyatakan bahwa keasaman atau alkalinitas berlebihan lendir serviks mengurangi motilitas sperma, sehingga menyebabkan terjadinya kegagalan pembuahan. pH asam atau basa sering disebabkan oleh kondisi biofisik dan biokimia dari lendir serviks dikendalikan oleh perubahan hormon selama siklus estrus. Mekanisme ini yang menyebabkan masing-masing tahap siklus estrus menghasilkan nilai pH yang berbeda (Noakes et al., 2003). Pada awal estrus, nilai pH adalah di 6,54 dan satu hari sebelum tanda munculnya estrus, nilai pH adalah di kisaran 6,72-7,00 dan pada estrus nilai pH adalah 7,32. Namun hasil penelitian ini tidak sesuai dengan laporan Modi et al. (2011) yang menyatakan rata-rata nilai pH
pada sapi fertil adalah 8,39±0,17 dengan kisaran 7,3-9,1, sedangkan pH pada sapi RB dilaporkan bervariasi 4,7-7,9 dengan rata-rata 6,19±0,18. Sapi fertil menunjukkan pH yang lebih tinggi (basa) dibandingkan dengan sapi RB. pH yang basa dari mukus serviks lebih menguntungkan bagi motilitas sperma.
Hasil isolasi dan identifikasi bakteri Gram negatif pada utreus sapi aceh diperoleh beberapa jenis bakteri dan frekuensi yang berbeda seperti yang disajikan pada Tabel 1. Pada penelitian yang dilakukan oleh Bhat et al. (2014), jenis dan persentase bakteri yang berbeda diisolasi dari sapi-sapi RB yakni Staphylococcus spp.
(21,05%), Escherichia coli (18,42%), Bacillus spp. (13,16%), Corynebacterium spp.
(13,16%), Pseudomonas spp. (10,53%), Proteus spp. (10,53%), Klebsiella spp.
(7,89%), dan Streptococcus spp. (5,26%).
Tabel 1. Frekuensi distribusi isolat bakteri pada uterus sapi acehfertil dan sapi aceh repeat breeding
Isolat bakteri Repeat Breeding (K2) Sapi Fertil (K1) Frekuensi (%) Frekuensi (%)
Escherichia coli 3 30,00 2 33,33
Pseudomonas sp 3 30,00 1 16,67
Enterobacter sp 2 20,00 1 16,67
Klebsiella sp 2 20,00 2 33,33
Hasil penamaan jenis bakteri diperoleh dengan memperhatikan sifat-sifat koloni, pewarnaan Gram dan hasil uji biokimia (Gambar 1-3) maka dapat diisolasi dan diidentifikasi berbagai jenis bakteri Gram negatif yang terdapat pada uterus sapi aceh yaitu Escherichia coli, Pseudomonas sp, Klebsiella sp dan Enterobacter sp.
Menurut Benyamin et al. (1982) dan Naik (1982), Escherichia coli merupakan salah satu bakteri yang pada umumnya menyebabkan gangguan reproduksi seperti RB, endometritis, vaginitis, dan vulvitis.
Gambar 1. Bentuk koloni Escherichia coli (a) dan Pseudomonas sp (b) pada media MCA, dan bentuk koloni Enterobacter sp (c) dan Klebsiella sp (d) pada media BA
Gambar 2. Bentuk bakteri Escherichia coli (a), Pseudomonas sp (b), Enterobacter sp (c) dan Klebsiella sp (d) pada pewarnaan Gram
Gambar 3. Hasil uji biokimia pada Escherichia coli, memproduksi asam dan gas dari fermentasi karbohidrat
Pada media Mc Conkey, koloni Escherichia coli terlihat berukuran sedang, berwarna merah bata, rata, sedikit cembung. Pada pewarnaan Gram Escherichia coli bewarna merah muda, berbentuk batang dan kokus, terpisah-pisah dan ada juga yang bergabung membentuk rantai pendek dan tidak membentuk spora. Menurut Gani dkk.
(2008), Escherichia coli adalah bakteri Gram negatif, yang berbentuk batang dan terpisah-pisah dalam pewarnaan Gram. Singh et al. (1989) menyatakan bahwa ditemukan Escherichia coli, diduga karena adanya kontaminasi tinja yang mengandung bakteri tersebut, dikarenakan letak anus berdekatan dengan saluran reproduksi. Bakteri ini merupakan flora normal saluran pencernaan hewan dan manusia.
Pseudomonas sp adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang, motil, bersifat aerob, katalase, dan oksidase positif, dan menfermentasi glukosa. Menurut Gani et al.
(2008), Pseudomonas sp menghasilkan koloni kasar pada NA dan hemolisis β di BA.
Pada pewarnaan Gram terungkap sebagai Gram negatif dan berbentuk batang.
Enterobacter spp. tumbuh pada media BA dengan ukuran koloni sedang- besar, sedikit cembung, bulat, berwarna putih sampai abu-abu dan anhaemolitik. pada pewarnaan Gram adalah berwarna merah muda dan berbentuk batang. Bakteri ini
memfermentasi gula-gula, motil, indol positif, katalase dan oksidase positif. Bisping dan Amtsberg (1988), menyatakan bahwa pada sapi yang terinfeksi Enterobacter aerogenes dapat menyebabkan abortus dan mastitis. Klebsiella sp adalah bakteri Gram negatif, berbentuk batang pendek, menfermentasi gula-gula dan motil. Bakteri ini dapat menyebabkan abortus. Menurut Gillespie dan Timoney (1981), abortus terjadi karena berhubungan dengan bentuk enterik dan septikemik penyakit.
Tabel 2. Total jumlah isolat bakteri pada sapi aceh fertil dan sapi aceh repeat breeding (RB)
Sapi
penelitian Jumlah
sampel Jumlah positif %
positif Jumlah
negatif % negatif
Total jumlah isolat
Sapi fertil 3 3 100 0 0 6
RB 3 3 100 0 0 10
Pada penelitian ini, seluruh sapi, baik pada K1 maupun K2 seluruhnya positif terinfeksi bakteri seperti yang disajikan pada Tabel 2. Infeksi bakteri pada sapi fertil, juga dilaporkan oleh Das et al. (1996). Infeksi uterus pascapartus dihasilkan dari kontaminasi uterus dengan bakteri selama proses kelahiran (Azawi et al., 2007), sehingga beberapa hewan normal juga dapat mengandung infeksi (Sharma et al., 2008; Shukla dan Sharma, 2005). Beberapa peneliti sebelumnya bisa memperoleh mukus serviks steril yang lengkap dari beberapa sapi yang normal (Chandrakar et al., 2002; Mane et al., 2009). Pada sapi RB, infeksi bakteri pada penelitian ini lebih tinggi dari laporan Singh dkk. (1988). Singh et al. (1998) melaporkan hasil positif sebesar 62,2% RB dari sapi yang diperiksa. Jumlah sapi RB positif pada penelitian ini hampir sama dengan laporan lainnya (Dholakia et al., 1987).
Tabel 3. Hasil pertumbuhan bakteri pada sapi aceh fertil dan sapi aceh repeat breeding
Parameter Repeat breeding Grup kontrol
n (%) n (%)
Jumlah sampel positif ada isolat bakteri 3 100 3 100
Jumlah sampel bebas isolat bakteri 0 0 0 0
Jumlah sampel dengan isolat bakteri tunggal 0 0 0 0 Jumlah sampel dengan dua isolat bakteri 0 0 3 100 Jumlah sampel dengan tiga isolat bakteri 3 100 0 0
Isolat bakteri ditemukan pada setiap samper dari sapi RB maupun sapi normal. Kelompok sampel yang memiliki dua jenis isolat bakteri yaitu 100% pada sapi normal dan kelompok sampel yang memiliki tiga jenis isolat bakteri yaitu 100%
pada sapi RB (tabel 3). Dari hasil WST (White side test) yang dilakukan oleh Bhat dkk. (2014), telah diduga bahwa hanya 15,00% sapi kelompok kontrol yang menunjukkan infeksi dan sisanya 85,00% sapi adalah bebas dari infeksi; namun mayoritas sapi RB menunjukkan infeksi sebanyak 71,25% dan hanya 28,75% hewan bebas dari infeksi.
Pada penelitian yang dilakukan oleh Toelihere (1981) dan Partodihardjo (1987), bakteri yang berhasil diisolasi dan diidentifikasi termasuk bakteri non- spesifik. Secara normal bakteri non-spesifik tidak menyebabkan gangguan saluran reproduksi sapi betina. Tetapi bila ada luka-luka, maka bakteri ini akan menjadi patogen dan menyebabkan peradangan, yaitu vaginitis, servisitis, maupun endometritis. Akibat infeksi bakteri-bakteri ini, sapi sudah beberapa kali dikawinkan tidak bunting juga. Setelah terjadi infeksi bakteri, tubuh hewan akan berusaha untuk mengeluarkan bakteri. Reaksi tersebut di antaranya adalah dihasilkannya eksudat yang umumnya memiliki pH rendah, temperatur lokal meningkat dan lebih buruk lagi bila terjadi indurasi jaringan, sehingga kondisi lokal tidak sesuai bagi ovum, spermatozoa maupun konseptus.
Umumnya, infeksi uterus non-spesifik dianggap menjadi penyebab utama RB (Sharma et al., 1988) yaitu bertambahnya jumlah mikroorganisme dan/atau
virulensnya menyebabkan servisitis atau endometritis dari bermacam tingkat yang dapat menyebabkan kematian embrio dan masalah RB (Elliot et al., 1968). Prevalensi infeksi uterus lebih tinggi pada sapi persilangan daripada sapi lokal. Sapi yang diinseminasi buatan menderita infeksi uterus lebih tinggi daripada sapi yang dikawinkan secara alami. Namun, persentase bakteri yang ditemukan dalam sampel yang sakit lebih tinggi daripada sampel yang tidak sakit. Hal ini juga diamati bahwa sapi tua paling rentan terhadap gangguan reproduksi yang berbeda dan infeksi uterus dibandingkan sapi muda (Azizunnesa, 2011).
Eksperimen 2.
Rata-rata suhu dan kelembaban pada Mei-Juni adalah 29,5±1,29 dan 88±5,78.
Jika dikonversi pada temperature humidity index (THI) maka tergolong kategori 4 (cenderung stres). Kinerja reproduksi sapi aceh pada kondisi tersebut yang mendapat perlakuan dengan dua protokol sinkronisasi berahi yang berbeda disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Kinerja reproduksi sapi aceh pada kondisi stres panas lingkungan yang mendapat perlakuan dengan protokol sinkronisasi berahi dengan PGF2α dan ovsynch
Parameter reproduksi Perlakuan
K1, Mei-Juni, prostaglandin K2, Mei-Juni, ovsynch Kinerja Berahi
- Intensitas berahi - Onset berahi - Durasi berahi Angka konsepsi (%)
4,5±1,07a 38,50±12,8a 40,10±30,16a
40
4,8±0,68a 31,76±22,40a 22,87±20,88a
40
Late embryonic mortality, 50 0
LEM (%)
Rata-rata level progesteron
(ng/ml) sapi bunting (hari ke-5) 2,4±0,42a 4,20±1,40b Rata-rata level progesteron
(ng/ml) sapi LEM (hari ke-5) 1,93 -
a Superskrip yang berbeda pda kolom yang sama memperlihatkan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Berdasarkan Tabel 4, terlihat intensitas berahi sapi aceh tidak berbeda nyata (P>0,05) antara K1 dan K2. Meskipun secara statistik intensitas berahi pada kedua kelompok tidak berbeda nyata, tetapi terdapat kecenderungan peningkatan intensitas berahi pada K2 dibandingkan K1. Chenault et al. (1990) dan Rettmer et al. (1992) menyatakan bahwa pemberian GnRH meningkatkan LH dan FSH dalam sirkulasi darah selama 2-4 jam. Hal ini berkaitan dengan perkembangan folikel dominan. Hormon GnRH menstimulus pelepasan FSH yang berkaitan dengan perkembangan folikel.
Folikel yang berkembang tersebut kemudian mensekresikan estrogen yang berkaitan dengan intensitas birahi. Kondisi ini kemungkinan menyebabkan intensitas berahi yang dihasilkan K2 cenderung lebih tinggi dibandingkan K1. Semakin tinggi kadar estrogen, semakin tinggi intensitas birahi sapi tersebut. Hal ini mendukung pendapat Lyimo et al.
(1999), bahwa intensitas estrus berkaitan dengan kadar hormon estradiol dalam darah sapi dengan korelasi sebesar 0,7.
Onset berahi sapi aceh antara K1 dan tidak berbeda nyata (P>0,05) seperti yang disajikan pada Tabel 4. Onset berahi cenderung lebih lama K1 jika dibandingkan dengan K2. Hal ini sesuai dengan laporan Rasyad (2008), bahwa onset berahi lebih cepat pada perlakuan GnRH. Peningkatan FSH diduga lebih lambat tercapai jika diinjeksi PGF2α tunggal dibandingkan dengan yang diinjeksi dengan kombinasi PGF2α dan GnRH. Hal ini sesuai dengan pendapat Larson et al. (2006) bahwa metode ovsynch dengan pemberian GnRH kedua akan mempercepat terjadinya induksi berahi. Durasi berahi sapi aceh antara K1 dan K2 tidak berbeda nyata (P>0,05) seperti yang disajikan pada Tabel 4. Menurut Britt (1993), faktor-faktor yang memengaruhi durasi berahi meliputi bangsa,
umur, dan musim. Rata-rata lama berahi sapi betina dewasa adalah 17,8 jam dan 15,3 jam pada sapi dara.
Angka konsepsi hasil penelitian ini lebih tinggi dibandingkan hasil penelitian sebelumnya dengan menggunakan protokol sinkronisasi yang sama (Aali et al., 2008;
Ghuman et al., 2014). Aali et al. (2008) melaporkan bahwa angka konsepsi dengan protokol ovsynch adalah sebesar 31% pada sapi Holstein. Ghuman et al. (2014) melaporkan bahwa angka konsepsi sebesar 30% pada kerbau yang mendapat perlakuan sinkronisasi dengan metode ovsynch. Jika dibandingkan dengan sapi lain, angka konsepsi penelitian ini relatif sama dengan laporan Forro et al. (2012) yang melaporkan bahwa angka konsepsi sebesar 44,4% pada sapi peranakan Friesian Holstein (FH) yang mendapat protokol sinkronisasi dengan ovsynch.
Laporan angka konsepsi sapi aceh dengan protokol sinkronisasi dengan PGF2α dan progesteron telah dilaporkan oleh Siregar et al. (2015). Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa angka konsepsi yang lebih tinggi dibandingkan hasil penellitian ini. Siregar et al. (2015) memperoleh angka konsepsi sebesar 80,0 dan 80,0% pada sapi yang mendapat perlakuan sinkronisasi berahi masing-masing dengan CIDR-B dan PGF2α. Perbedaan hasil penelitian ini kemungkinan disebabkan perbedaan waktu perlakuan. Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei-Juni, ketika suhu dan kelembapan di Provinsi Aceh mencapai puncak tertinggi sehingga kemungkinan menyebabkan stres panas lingkungan dan berdampak pada angka konsepsi.
Kegagalan kebuntingan pada penelitian ini diduga disebabkan oleh kegagalan fertilisasi atau kematian embrio sebelum hari ke-25 (early embryonic mortality) dengan persentase sebesar 60%. Hasil ini sesuai dengan laporan Diskin et al. (2011) bahwa kematian embrio terutama terjadi sampai hari ke-16 setelah perkawinan. Pada sapi potong, dilaporkan bahwa tingkat fertilisasi hasil inseminasi buatan adalah 90- 100% (Sreenan et al., 2001). Oleh karena itu, dapat diduga bahwa kegagalan kebuntingan pada penelitian ini sebagian besar berhubungan dengan kematian embrio dini yang berkaitan dengan stres panas lingkungan pada saat perlakuan. Protokol ovsynch terbukti juga tidak dapat meningkatkan angka konsepsi sapi aceh
dibandingkan perlakuan dengan PGF2α (40 vs 40%). Hasil ini mendukung pendapat Vassilev et al. (2005) bahwa angka kebuntingan dan kematian embrio dini tidak dipengaruhi oleh sinkronisasi ovulasi dengan metode ovsynch.
Persentase kasus kematian embrio pada penelitian ini mencapai 50% pada K1.
Hasil ini jauh lebih tinggi dibandingkan laporan sebelumnya. Vassilev et al. (2005) melaporkan bahwa insidensi kematian embrio dini yang diobservasi sampai hari ke- 35 adalah sebesar 5,45-13,2%. Fricke et al. (1999), Mee et al. (1994), dan Vasconcelos et al. (1997) melaporkan insidensi kematian embrio adalah sebesar 10- 16% pada sapi yang telah menunjukkan hasil positif bunting pada hari ke-28.
Penyebab tingginya insiden kematian embrio pada penelitian ini kemungkinan berhubungan dengan stres panas lingkungan ketika penelitian dilakukan. Rata-rata suhu dan kelembapan pada saat penelitian masing-masing adalah 29,5±1,29º C dan 88±5,78. Menurut indeks THI, kondisi tersebut telah masuk ke dalam kategori stres.
Ghanem dan Nishibori (2015) menyatakan bahwa stres panas dapat menghambat fungsi endokrin yang ditandai dengan penurunan intensitas estrus LH preovulatori yang pada akhirnya akan menurunkan fertilitas. Wolfenson (2006) menyatakan bahwa stres pada musim panas menyebabkan kerusakan fungsi folikuler yang diikuti dengan sub-optimal fungsi CL. Sub-optimal fungsi luteal setelah inseminasi buatan berhubungan dengan rendahnya sekresi progesteron atau regresi luteal dini. Situasi ini mengakibatkan terjadinya kematian embrio.
Pada penelitian ini, kelompok K2 tidak mengalami kematian embrio setelah hari ke-25, yang menunjukkan bahwa protokol ovsynch dapat mencegah terjadinya gangguan tersebut sehingga angka kebuntingan setelah hari ke-25 menjadi lebih tinggi dibandingkan K1. Peningkatan angka kebuntingan ini berhubungan dengan kemampuan GnRH meningkatkan konsentrasi progesteron melalui pembentukan korpus luteum asesoris (Pursley et al., 2012). Hal ini serupa dengan yang dilaporkan oleh Yildiz et al. (2009), yang melaporkan bahwa pemberian GnRH pada hari ke-9 pasca-inseminasi dapat meningkatkan angka kebuntingan dibandingkan dengan kontrol masing-masing adalah 77,7 dan 50,0%.
