IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Uji Aktivitas Selulolitik
4.1.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif
Aktivitas selulolitik beberapa isolat A. niger dan Trichoderma diuji pada
media agar CMC. Adanya aktivitas selulolitik ditandai dengan terbentuknya zona bening disekeliling koloni cendawan (Gambar 6). Pewarna Congo Red
berinteraksi secara kuat dengan polisakarida yang mengandung ikatan β-(1,4) dan β-(1,3) glikosidik membentuk kompleks warna-glukan (Teather & Wood 1982). Zona bening yang terbentuk mengindikasikan tidak adanya kompleks warna-glukan akibat terjadinya hidrolisis ikatan glikosidik CMC. Sedangkan daerah yang masih berwarna merah mengindikasikan masih adanya kompleks warna-glukan yang mengindikasikan tidak terjadi hidrolisis substrat CMC.
Rata-rata nisbah selulolitik terbesar ditunjukkan oleh isolat A. niger KB12
sebesar 0.47 dan terkecil ditunjukkan oleh isolat Trichoderma IPB12 sebesar 0.02
(Tabel 3). Besarnya nisbah selulolitik ini seringkali tidak berkorelasi dengan besarnya aktivitas selulase. Hal ini kemungkinan disebabkan adanya variasi kecepatan pertumbuhan cendawan.
Gambar 6 Aktivitas selulolitik yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekeliling koloni setelah inkubasi 24 jam pada suhu ruang. (a)
A. niger, (b) Trichoderma.
Tabel 3 Nisbah selulolitik A. niger dan Trichoderma setelah 24 jam inkubasi
pada suhu ruang
Isolat Rata-rata diameter koloni (cm) Rata-rata diameter zona bening (cm) Rata-rata nisbah selulolitik
Aspergillus niger IPB1 20.25 28.08 0.37±0,011
A. niger IPB4 19.92 23.50 0.18±0,078 A. niger IPB5 20.17 23.83 0.18±0,019 A. niger KB12 15.67 23.00 0.47±0,056 A. niger TSR12 18.33 25.08 0.37±0,042 A. niger TSR13 17.58 21.33 0.22±0,076 A. niger TSR52 17.75 24.50 0.38±0,033 Trichoderma reesei 29.33 30.33 0.03±0,001 Trichoderma IPB2 30.00 31.00 0.03±0,001 Trichoderma IPB9 32.67 34.17 0.05±0,028 Trichoderma IPB11 24.00 25.83 0.08±0,007 Trichoderma IPB12 33.17 34.00 0.02±0,007
4.1.2 Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif
Rata-rata aktivitas spesifik tertinggi ditunjukkan oleh isolat A. niger IPB1
sebesar 5.74 U/mg dan terkecil ditunjukkan oleh isolat Trichoderma IPB2 sebesar
1.31 U/mg (Tabel 4). Beberapa isolat A. niger dan Trichoderma, seperti A. niger
IPB1, A. niger TSR52, A. niger IPB5, A niger KB12, A. niger TSR12, A. niger
TSR13 menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan isolat T. reesei
yang merupakan standar aktivitas enzim selulase. Elshafei et al. (1990)
melaporkan bahwa aktivitas enzim endoglukanase A. terreus lebih tinggi
dibandingkan Trichoderma viride yang merupakan standar aktivitas enzim
selulase, sedangkan Pothiraj et al. (2006) melaporkan aktivitas enzim
endoglukanase A. niger lebih tinggi dibandingkan A. terraus. Namun demikian
pembandingan secara langsung hasil ini sulit dilakukan karena banyaknya faktor yang mempengaruhi, seperti komposisi media dan pemilihan substrat yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim (Sharma et al. 1986).
Banyak faktor terlibat dalam kinerja suatu enzim, seperti suhu dan pH. Pada penelitian ini digunakan metode yang umum digunakan untuk sistem enzim selulase T. reesei (Ghose 1987) sehinggga tidak menutup kemungkinan aktivitas
beberapa isolat A. niger pada uji ini belum mencapai aktivitas optimalnya.
Beberapa laporan menunjukkan aktivitas enzim endoglukanase A. niger
mempunyai kisaran suhu dan pH yang luas. Suhu optimum aktivitas endoglukanase A. niger dilaporkan berkisar 40oC (Coral et al. 2002) dan 70oC
(Hong et al. 2001). pH optimum aktivitas enzim endoglukanase A. niger
dilaporkan berkisar 4.5 dan 7.5 (Coral et al. 2002), antara 6.0 dan 7.0 (Akiba et al.
1995), dan 6.0 (Hong et al. 2001).
Tabel 4 Aktivitas enzim endoglukanase A. niger dan Trichoderma pada suhu
50oC yang diukur setelah 7 hari inkubasi
Nama isolat Rata- rata biomassa (mg) Rata-rata aktivitas spesifik (U/mg) A. niger IPB1 42 5.74±0.58 A. niger TSR52 48 5.42±0.67 A. niger IPB5 37 4.96±0.24 A. niger KB12 45 4.83±1.01 A. niger TSR12 51 4.68±0.46 Trichoderma IPB11 31 4.30±0.54 A. niger TSR13 41 3.03±0.42 Trichoderma reseei 38 3.01±0.26 A. niger IPB4 43 2.73±0.38 Trichoderma IPB9 47 2.53±0.59 Trichoderma IPB12 35 2.35±0.94 Trichoderma IPB2 37 1.31±0.80
4.2 Isolasi Gen eglA A. niger IPB1 4.2.1 Isolasi RNA total
Isolasi RNA total dilakukan pada isolat yang mempunyai aktivitas spesifik tertinggi, yaitu isolat A. niger IPB1. RNA total berhasil diisolasi dari miselium A. niger IPB1 yang ditumbuhkan dalam medium induksi CMC. Kuantitas RNA total
yang dihasilkan berdasarkan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm adalah 176.4 µg tiap gram miselium. Selanjutnya berdasarkan nilai rasio OD260/OD280, yaitu sebesar 1.72, maka RNA total yang dihasilkan
mempunyai kemurnian yang cukup tinggi (Tabel 5). Manchester (1996) menyatakan bahwa kemurnian RNA yang tinggi ditunjukkan dengan nilai rasio OD260/OD280 antara 1.8 dan 2.0. Hasil elektroforesis menunjukkan RNA total
hasil isolasi mempunyai integritas yang cukup tinggi. Hal ini ditunjukkan dengan adanya dua pita yang dominan, yaitu RNA ribosomal (rRNA) 28S dan 18S (Gambar 7).
Tabel 5 Hasil isolasi RNA total Absorban Bahan λ260 λ280 λ260/ λ280 Total RNA (µg/ g miselium) Miselium A. niger IPB1 0.210 0.122 1.72 176.4
Gambar 7 Hasil isolasi RNA total A. niger IPB1 yang diisolasi dari miselium
setelah inkubasi 3 hari yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v).
4.2.2 Sintesis cDNA total
Sintesis cDNA dilakukan menggunakan RNA total yang telah diisolasi sebagai cetakan melalui proses transkripsi balik. Proses ini menggunakan primer oligo(dT) sehingga hanya mRNA yang akan disintesis menjadi cDNA karena adanya ekor poli(A) pada ujung 3’. Sebagai kontrol keberhasilan sintesis cDNA, dilakukan amplifikasi terhadap gen aktin menggunakan primer spesifik (ActF dan ActR2).
Hasil amplifikasi gen aktin dengan cDNA sebagai cetakan menghasilkan satu pita DNA yang berukuran 123 bp (Gambar 8). Hasil ini menunjukkan bahwa sintesis cDNA total telah berlangsung dengan baik. Selain itu, hasil ini juga menunjukkan RNA yang dihasilkan tidak terkontaminasi oleh DNA genom. Adanya kontaminasi oleh DNA akan ditunjukkan dengan adanya dua pita DNA yang dihasilkan, yaitu pita berukuran 123 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi cDNA dan pita berukuran 223 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi DNA
rRNA 28S
genom. Pada DNA genom terdapat intron antara ekson1 dan ekson2 sehingga fragmen yang dihasilkan lebih besar.
Gambar 8 Hasil amplifikasi gen aktin dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 3% (b/v). Lajur 1. Penanda ΦX174RF DNA/HaeIII Fragments; 2. Gen aktin
4.2.3 Isolasi gen eglA
Hasil sintesis cDNA selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk mengisolasi gen eglA. Isolasi gen eglA dilakukan dengan amplifikasi
menggunakan PCR dengan primer spesifik EAF dan EAR. Amplifikasi gen eglA A. niger IPB1 menghasilkan pita sekitar 750 bp sesuai dengan hasil prediksi dari
database (Gambar 9).
Gambar 9 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan
elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. eglA hasil PCR
4.2.4 Pengklonan gen eglA
Gen eglA hasil isolasi disisipkan dalam plasmid pGEM-T Easy, ditengah
gen lacZ dengan bantuan enzim ligase. Hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke
dalam E. coli galur DH5α yang selanjutnya ditumbuhkan dalam media seleksi
yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. Keberhasilan pengklonan gen eglA
dapat diketahui dengan terbentuknya koloni putih (Gambar 10).
310 bp 194 bp 123 bp 1 2 118 bp 750 bp 750bp 1000 bp 1 2
Koloni E. coli galur DH5α yang dapat tumbuh pada media yang
mengandung ampisilin adalah koloni yang mengandung plasmid pGEM-T Easy.
Plasmid ini mempunyai gen resistensi ampisilin yang mengekspresikan β -lactamase yang merusak cincin β-lactame sehingga bakteri yang mengandung
plasmid ini dapat hidup dalam media yang mengandung ampisilin. Adanya gen
eglA yang menyisip ke dalam gen lacZ dibuktikan dengan warna koloni yang
putih. Gen lacZ merupakan gen yang menyandi β-galaktosidase yang mengubah
substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Adanya penyisipan gen eglA pada gen lacZ mengakibatkan ekspresi gen lacZ terganggu dan
β-galaktosidase tidak diekspresikan, sehingga tidak ada perubahan warna pada substrat X-gal dan koloni yang dihasilkan berwarna putih.
Gambar 10 Koloni E. coli hasil transformasi yang ditumbuhkan dalam media
selektif yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG.
Gambar 11 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan
elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. eglA hasil PCR
4.2.5 Verifikasi pengklonan gen eglA
Untuk memastikan bahwa sisipan pada gen lacZ adalah gen eglA maka
dilakukan verifikasi dengan menggunakan PCR-koloni menggunakan primer
Koloni putih Koloni biru 1 2 750 bp 1000 bp 750 bp 1 ml
spesifik eglA maupun pemotongan DNA plasmid dengan enzim EcoRI.
PCR-koloni pada PCR-koloni putih menghasilkan pita yang berukuran sekitar 750 bp yang sesuai dengan ukuran eglA (Gambar 11).
DNA plasmid dari koloni putih diisolasi dan selanjutnya di potong dengan menggunakan EcoRI. Enzim ini dipilih karena situs pemotongannya mengapit
sisipan sehingga diharapkan pemotongan akan menghasilkan dua pita, yaitu DNA sisipan dan vektor pembawanya. Hasil pemotongan DNA plasmid menunjukkan adanya dua pita yang berukuran sekitar 3000 bp dan 750 bp (Gambar 12). Ukuran sekitar 3000 bp sesuai dengan ukuran pGEM-T Easy, yaitu sebesar 3015 bp,
sedangkan ukuran sekitar 750 bp sesuai dengan ukuran produk amplifikasi eglA.
Dari dua hasil verifikasi ini dapat dipastikan bahwa DNA yang menyisip dalam gen lacZ plasmid pGEM-T Easy adalah gen eglA A. niger IPB1.
Gambar 12 Hasil pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan EcoRI yang
dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. Plasmid rekombinan yang dipotong; 3. Plasmid rekombinan yang tidak dipotong
4.3 Pengurutan dan Karakterisasi Gen eglA A. niger IPB1 4.3.1 Pengurutan gen eglA dan deduksi asam aminonya
Pengurutan gen eglA A. niger IPB1 pada pGEM-T Easy dilakukan
menggunakan ABI Prism 3100 versi 3.7 dengan primer sp6 dan T7 (Lampiran 4). Dari hasil pengurutan diperoleh gen eglA A. niger IPB1 sebesar 720 bp yang
menyandi 239 asam amino (Gambar 13).
1 2 3 vektor 750 bp 1000 bp 3000 bp sisipan
Gambar 13 Urutan nukleotida eglA A. niger IPB1 dan deduksi asam aminonya
4.3.2 Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino eglA A. niger IPB1 dengan database di GenBank
Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino eglA A. niger IPB1
dengan database di GenBank dilakukan menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Hasil penyejajaran nukleotida menunjukkan
sekuen eglA A. niger IPB1 mempunyai kemiripan 99% dengan sekuen 14 dari
paten WO2004018662 (E-value 3.7e-152 ), 98% dengan sekuen 1 dari paten WO9713853 (E-value 1.7e-151 ), WO9713862 (E-value 1.7e-151 ), US6190890 ( E-value 1.7e-151 ), US6306635 (E-value 1.7e-151 ), dan 97% dengan sekuen 13 dari paten WO2004018662 (E-value 4.5e-149) dan eglA Aspergillus niger CBS 513.88
(E-value 1.1e-148) yang semuanya merupakan gen endoglukanase dari Aspergillus niger. Sementara itu hasil penyejajaran urutan asam amino menunjukkan urutan eglA mempunyai kemiripan 99% dengan endoglukanase A atau eglA dari Aspergillus niger A. niger (E-value 7.1e-127) , 87% dengan endoglukanase A atau
cekA dari Aspergillus kawachi (E-value 1.9e-126 ), 81% dengan endoglukanase A Sequence ID : EglA_niger Nuk AA atgaagctccccgtgacacttgctatgcttgcggccaccgccatgggccagacgatgtgc 60 M K L P V T L A M L A A T A M G Q T M C 20 tctcaatatgacagtgcctcgagccccccatattcagtgaaccagaacctctggggcgag 120 S Q Y D S A S S P P Y S V N Q N L W G E 40 taccaaggcaccggcagccagtgtgtatatgtcaacaaactctccagcagtggtgcatcc 180 Y Q G T G S Q C V Y V N K L S S S G A S 60 tggcacaccgaatggacctggagcggtggtgagggaacagtgaaaagctactctaactct 240 W H T E W T W S G G E G T V K S Y S N S 80 ggcgttacatttaacaagaagctcgtgagtgatgtatcaagcatccccacctcggtggaa 300 G V T F N K K L V S D V S S I P T S V E 100 tggaagcaggacaacaccaacgtcaacgccgatgtcgcgtatgatcttttcaccgcagcg 360 W K Q D N T N V N A D V A Y D L F T A A 120 aatgtggaccatgctacttctagcggtgactatgaactgatgatttggcttgcccgctac 420 N V D H A T S S G D Y E L M I W L A R Y 140 ggcaacatccagcccattggcaagcaaattgccacggccacagtgggaggcaagtcctgg 480 G N I Q P I G K Q I A T A T V G G K S W 160 gaggtgtggtatggcagcaccacccaggccggtgcggagcagaggacatacagcttcgtg 540 E V W Y G S T T Q A G A E Q R T Y S F V 180 tcggaaagccctatcaactcatacagtggggccatcaatgcatttttcagctatctcact 600 S E S P I N S Y S G A I N A F F S Y L T 200 cagaaccaaggctttcccgccagctctcagtacttgatcaatctgcagtttggaactgag 660 Q N Q G F P A S S Q Y L I N L Q F G T E 220 gcgttcaccgggggcccggcaaccttcacggttgacaactggaccgccagtgtcaactag 720 A F T G G P A T F T V D N W T A S V N - 239
dari Aspergillus terreus (E-value 6.9e-113) dan 75% dengan endoglukanase atau celA dari Aspergillus oryzae (E-value 4.8e-105) (Lampiran 5 dan 6).
BLAST merupakan program pencari similaritas suatu urutan nukleotida atau asam amino dengan database yang berbasis local alignment, yaitu
penyejajaran pada suatu segmen sekuen yang lebih pendek dengan derajat similaritas yang sangat tinggi. Similaritas mengindikasikan homologi suatu gen atau protein. Jika kedua urutan gen atau protein homolog maka dapat dikatakan bahwa keduanya mempunyai leluhur, fungsi dan struktur yang sama. Dua gen atau fragmen DNA dikatakan homolog jika 70% urutan nukleotidanya atau 25% urutan asam aminonya identik (panjang urutan minimal 100) (Claviere & Notredame 2003). Berdasarkan hal diatas maka dapat dipastikan bahwa eglA merupakan gen eglA dari Aspergillus niger.
Gambar 14 Peta situs pemotongan eglA dengan menggunakan program NEBcutter
4.3.3 Analisis situs pemotongan gen eglA
Analisis situs pemotongan enzim restriksi endoglukanase digunakan untuk membuat peta situs pemotongan enzim restriksi (peta restriksi) pada suatu gen atau fragmen DNA. Peta restriksi ini bermanfaat dalam menentukan enzim-enzim restriksi apa saja yang dapat digunakan dalam kegiatan manipulasi suatu gen atau
fragmen DNA. Pada analisis peta pemotongan gen eglA terlihat tidak terdapat
situs pemotongan EcoRI yang digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari
plasmid pGEM-T Easy sebagai vektornya (Gambar 14). Hasil ini sekaligus dapat
digunakan untuk verifikasi keberhasilan pengklonan gen eglA pada plasmid
pGEM-T Easy. Selain itu terdapat beberapa situs pemotongan yang terdapat pada
gen eglA dan situs pengklonan (MCS) pGEM-T Easy, seperti ApaI, NcoI, PstI
dan NsiI, sehingga enzim-enzim ini tidak dapat digunakan untuk mengeluarkan
DNA sisipan dari plasmid, karena akan memotong DNA sisipan juga (Gambar 14).
Gambar 15 Perbandingan domain EglA dari berbagai organisme berdasarkan
database pfam
4.3.4 Analisis domain EglA
Analisis domain EglA dilakukan menggunakan program Pfscan
berdasarkan database Pfam. EglA memiliki katalitik domain yang termasuk dalam A. niger (Glyco hydro 12: 82-239)
T. reesei (Glyco hydro 12: 81-234)
S. lividans (Glyco hydro 12: 111-261; CBM 2 : 279-378)
kelompok Glikosida hidrolase famili 12 (GH12) pada posisi asam amino ke-82 sampai asam amino ke-239 (Gambar 15). Arsitektur EglA A. niger ini sama
dengan arsitektur beberapa anggota famili GH12 lainnya, seperti Cel12A T. reesei
dan Cel12A B. Licheniformis. Arsitektur jenis ini hanya mengandung katalitik
domain dan tidak mengandung carbohydrate binding moduls (CBM).
Secara umum, kelompok glikosida hidrolase terdiri dari dua domain utama, yaitu katalitik domain dan carbohydrate binding moduls (CBM) yang
dihubungkan oleh suatu linker yang kaya akan prolin (Gambar 16). Posisi domain
katalitik maupun domain CBM dapat terdapat pada C-terminal maupun N-terminal. Posisi ini tidak menentukan spesifisitas suatu enzim (Gilkes et al. 1991).
Peran domain CBM pada enzim sampai saat ini masih belum jelas. Namun demikian Hashimoto (2006) menyatakan peran utama CBM meningkatkan efisiensi fungsi katalisis enzim-enzim karbohidrase walaupun dengan mekanisme yang belum jelas.
linker
Gambar 16 Domain umum selulase yang terdiri dari domain katalitik dan CBM yang dihubungkan oleh daerah penghubung (linker)
GH12 merupakan salah satu famili glikosida hidrolase yang mempunyai aktivitas endoglukanase dan xyloglukan hidrolase. Mekanisme katalisisnya adalah
retaining dengan Glutamat (Glu) sebagai basa nukleofil maupun donor protonnya.
Sampai saat ini GH12 mempunyai sekitar 151 anggota dengan 7 arsitektur yang berbeda. Sebagian besar anggota mempunyai arsitektur tanpa domain CBM. Sementara itu arsitektur dengan kombinasi antara katalitik domain dan domain CBM, seperti pada Cel2B S. lividans hanya sedikit.
Berdasarkan perbandingan struktur homolog dengan struktur endoglukanase lain yang sudah diketahui, residu-residu yang berperan dalam fungsi katalitik EglA A.niger IPB1 maupun pengikatan substratnya dapat
dideduksikan (Gambar 17). Glu116 diprediksi berperan sebagai nukleofil dan Glu204 diprediksi berperan sebagai donor proton. Pada famili GH12, posisi
Catalytic domain CBM
nukleofil ini berdekatan dengan dua residu yang sangat terkonservasi, yaitu Asp99 dan Met118 (Zechel et al. 1998; Sandgreen et al. 2003).
Situs pengikatan glikosil diprediksikan tersusun atas beberapa residu dengan rantai samping aromatik, seperti Trp, Tyr dan Phe (Sandgreen et al. 2003).
Mengacu pada beberapa residu yang terlibat dalam pengikatan substrat pada famili GH 12 (Goegedebuur et al 2002), residu Trp (posisi 22, 49, 51, 85, 120,
144), Tyr (61, 98, 115) dan Phe (163, 179) pada A. niger IPB1 diprediksi berperan
dalam pengikatan substrat glikosil.
Gambar 17 Kesejajaran urutan asam amino empat enzim GH 12. Posisi residu nukleofil dan donor proton ditunjukkan dengan tanda anak panah hitam dan putih secara berturut-turut.
4.3.5 Analisis hidrofobisitas EglA
Analisis hidrofobisitas dilakukan untuk mengetahui profil hidrofobisitas dari suatu urutan asam amino. Analisis ini digunakan untuk untuk menentukan apakah suatu protein termasuk protein yang larut dalam air atau protein membran (Zhao & London 2006). Profil hidrofobisitas berdasarkan skala Kyte & Doolittle menunjukkan secara keseluruhan EglA mempunyai nilai hidrofobisitas yang
1 10 20 30 40 50
| | | | | |
A.niger GQ-TMCSQYDSAS-SPPYSVNQNLWGEYQGTGS-QCVYVNKLSSSGASWHTEWTWSGGEG
B.licheniformis SS-SNPSDKLYFK-NKKYYIFNNVWGADQVSGWWQTIYHN--SDSDMGW--VWNWPSNTS
T.reesei AQ-TSCDQWATFT-GNGYTVSNNLWGASAGSGF-GCVTAVSL-SGGASWHADWQWSGGQN
S.lividans ADTTICEPFGTTTIQGRYVVQNNRWG---STAP-QCVTATDTGFRVTQADGSAPTNGAPK
60 70 80 90 100 | | | | |
A.niger TVKSYSN---SGVTF-NKKLVSDVSSIPTSVEWKQDNTNVNADVAYDLFTA
B.licheniformis TVKAYPSIVSGWHWTEGYTAGSGF-PTRL-SDQKNINTKVSYSI-SANGTYNAAYDIWLH
T.reesei NVKSYQN---SQIAIPQKRTVNSISSMPTTASWSYSGSNIRANVAYDLFTA
S.lividans SYPS---VFNGCHYTN---CSPGTDLPVRLDTVSAAPSSISYGFVDGAV-YNASYDIWLD
110 120 130 140 150 160 | | | | | |
A.niger ANVDHAT--SSGDYELMIWLARYGNIQPIGKQIATATVGGKSWEVWYGSTTQAGAE-QRT
B.licheniformis -NTNKASWDSAPTDEIMIWLNNT-NAGPAGSYVETVSIGGHSWKVYKGYIDAGGGKGWNV
T.reesei ANPNHVT--YSGDYELMIWLGKYGDIGPIGSSQGTVNVGGQSWTLYYGYN----GA-MQV
S.lividans PTA-RT--DGVNQTEIMIWFNRVGPIQPIGSPVGTASVGGRTWEVWSGGN----GS-NDV
170 180 190 200 210 | | | | |
A.niger YSFVSESPINSYSGAINAFFSYLTQNQGFPASSQYLINLQFGTEAFTGGPATFTVDNWTA
B.licheniformis FSFIRTANTQSANLNIRDFTNYLADSKQWLSKTKYVSSVEFGTEVF-GGTGQINISNWDV
T.reesei YSFVAQTNTTNYSGDVKNFFNYLRDNKGYNAAGQYVLSYQFGTEPFTGS-GTLNVASWTA
relatif negatif (hidrofilik) sehingga diprediksi kuat merupakan protein yang larut dalam air (Gambar 18). Selain itu terlihat adanya satu segmen transmembran pada N terminal (berdasarkan nilai kepercayaan yang direkomendasikan pada skala Kyte & Doolittle, yaitu 1.6). Adanya satu segmen transmembran pada daerah N-terminal mengindikasikan bahwa protein tersebut disekresikan (Clavarie & Notredame 2003). Hasil ini dikuatkan dengan analisis menggunakan TMHMM (Gambar 19) yang menyimpulkan bahwa EglA A. niger IPB1 merupakan protein
di luar sel.
Gambar 19 Prediksi segmen transmembran (TMHMM)
4.3.6 Kekerabatan EglA A.niger IPB1 dengan endoglukanase anggota famili GH12 lainnya berdasarkan struktur asam aminonya.
Analisis filogenetik dilakukan untuk menggambarkan hubungan kedekatan gen eglA A. niger IPB1 dengan gen-gen endoglukanase famili GH 12 lainnya.
Analisis ini dilakukan dengan membandingkan gen eglA A. niger IPB1 dengan
gen lainnya berdasarkan nilai kesamaan sekuennya. Analisis kesamaan EglA A.niger IPB1 berdasarkan urutan asam aminonya dilakukan terhadap beberapa
endoglukanase dari anggota famili GH12. EglA A. niger IPB1 mempunyai
kesamaan tertinggi, 99%, dengan endoglukanase A A. niger database. EglA juga
menunjukkan kesamaan yang tinggi dengan endoglukanase kelompok Aspergillus
lainnya, yaitu 63% dengan A.aculaetus dan 60% dengan A. kawachi. Sementara
itu kesamaan eglA A. niger IPB1 dengan kelompok bakteri dan archaea adalah
kecil. A. niger IPB1 mempunyai kesamaan 18% dengan S .lividans dan 15%
dengan P. furiosus. Kesamaan antar anggota famili GH12 ini merupakan hasil
penyejajaran keseluruhan urutan gen GH12 yang meliputi daerah dengan similaritas tinggi dan daerah beragam. Hasil penyejajaran menunjukkan daerah yang mempunyai similaritas tinggi terletak pada domain katalitik sedangkan diluar domain katalitik sangat bervariasi (Lampiran 7).
Pohon filogenetik yang menggambarkan tingkat kekerabatan endoglukanase beberapa anggota famili GH12 dikonstruksi menggunakan program PHYLIP berdasarkan hasil multiple sequence alignment famili GH12
dengan program T-COFFEE yang mempunyai tingkat akurasi tinggi (Edgar & Badzoglou 2006). Secara garis besar, gen-gen endoglukanase terlihat mengelompok sesuai dengan taksonnya, yaitu bakteri, cendawan dan archaea (Gambar 20). Kelompok cendawan terbagi menjadi tiga subfamili, yaitu subfamili1 yang terdiri dari kelompok Ascomycetes (A. aculeatus, A. kawachi, A. niger, Fusarium equiseti, Bionectrica ochroleuca, T. viride, T. reesei), subfamili2
yang terdiri dari beberapa kelompok Ascomycetes (A. oryzae dan A. nidulans) dan
Oomycetes (Phytophthora sojae dan Phytophthora ramomum), dan subfamili3
terdiri dari kelompok Basidiomycetes (Phanerochaete crhysosporium dan Polyporus arcularius).
Gambar 20 Pohon filogenetik beberapa endoglukanase anggota famili GH12
Fungi Bakteri Archaea Ascomycetes Ascomycetes & Oomycetes Basidiomycetes *
