Kebutuhan pangan berupa beras di Indonesia terus meningkat seiring dengan peningkatan jumlah penduduk. Akan tetapi di masa datang kemampuan pertanian di Indonesia untuk menyediakan beras akan menurun seiring dengan penurunan luas lahan pertanian padi akibat adanya konversi lahan untuk pemukiman dan industri. Oleh karena itu penggunaan tanah marginal seperti tanah masam untuk pertanian padi menjadi suatu pilihan yang tidak dapat dihindari.
Tanah masam tersebar luas di Indonesia, yang meliputi tanah masam kering dan basah dengan persentase luasan berturut-turut sekitar 54% dan 18% dari total luas daratan di Indonesia (Mulyani et al. 2004). Oleh karena tanah masam kering lebih luas daripada tanah masam basah, maka tanah masam kering menjadi alternatif pilihan untuk kegiatan pertanian di masa datang. Umumnya tanah masam kering didominasi oleh tanah masam Podsolik Merah Kuning (PMK) (Mulyani et al. 2004; Prasetyo & Suriadikarta 2006). Implementasi penanaman padi secara gogo di tanah masam kering PMK akan menghadapi berbagai hambatan, terutama karena kelarutan Al yang tinggi dapat menjadi racun bagi akar tanaman, sehingga penanaman padi di tanah masam akan membutuhkan input tinggi seperti pengapuran. Akan tetapi di beberapa lokasi, teknik pengapuran tidak efisien, tidak efektif, dan membutuhkan biaya tinggi. Tidak efisien karena makin besar tingkat kejenuhan Al di dalam tanah PMK maka makin banyak kapur yang diperlukan untuk mencapai pH tanah mendekati netral. Tidak efektif karena tanah harus diberi kapur lagi setiap mulai menanam. Membutuhkan biaya tinggi karena ketersediaan kapur terbatas di beberapa daerah seperti di Kalimantan dan Sumatra, dan harganya tidak terjangkau petani (Prasetyo & Suriadikarta 2006). Pendekatan lain adalah mengeksplorasi dan memanfaatkan genotipe padi yang toleran terhadap cekaman Al. Genotipe padi unggul dan toleran terhadap cekaman Al salah satunya dapat dikembangkan melalui teknik rekayasa genetika dengan mengintroduksikan gen toleran Al baik yang berasal dari genotipe padi yang toleran Al maupun dari spesies tanaman lainnya.
Indonesia memiliki plasma nutfah padi gogo dengan derajat toleransi cekaman Al yang beranekaragam. Keanekaragaman derajat toleransi cekaman Al ini sangat berguna bagi program pemuliaan tanaman padi. Potensi yang
terkandung di dalam plasma nutfah padi dapat dimanfaatkan untuk merakit genotipe padi baru yang memiliki sifat unggul, dapat beradaptasi serta tumbuh baik di tanah masam berkelarutan Al tinggi, baik secara konvensional maupun dengan rekayasa genetika.
Salah satu plasma nutfah padi gogo lokal yang toleran terhadap cekaman Al adalah Hawara Bunar. Toleransi Hawara Bunar terhadap cekaman Al terdeteksi pada penelitian ini melalui analisis RRG (Root Re-Growth), selain juga telah dibuktikan secara lapang (Asfaruddin 1997; Farid 1997; Syakhril 1997; Sutaryo et
al. 2005) dan laboratorium dengan mengukur PAR (Panjang Akar Relatif)
(Suparto 1999). Analisis RRG dilakukan dalam waktu yang singkat, yaitu 6 hari, dan parameter yang diukur adalah pertambahan panjang akar utama setelah pemulihan dari kondisi cekaman Al. Analisis RRG yang dilakukan menggunakan larutan hara minimal (Miftahudin et al. 2002) dengan konsentrasi Al sebesar 15 ppm pada pH 4.0 selama 72 jam diikuti masa pemulihan pada larutan hara tanpa Al selama 48 jam, merupakan pilihan yang baik dan efektif untuk menyeleksi tanaman yang toleran Al dari populasi segregasi padi generasi F2. Beberapa pertimbangan mengapa karakter RRG dapat digunakan sebagai alat seleksi toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al adalah: (1) Akar kecambah tanaman padi memiliki karakteristik khusus yaitu pertumbuhan akar utama umumnya akan menurun setelah mencapai 12 cm dan akan berhenti setelah mencapai panjang 15 cm (Hoshikawa 1989). Kondisi tersebut terjadi dalam kurun waktu sekitar 2 minggu sejak dikecambahkan; (2) Karakter RRG tidak membutuhkan kontrol yang tidak mungkin dipenuhi jika menganalisis toleransi cekaman Al pada setiap tanaman dari suatu populasi segregasi awal seperti F2; (3) Keefektifan RRG didukung oleh kemudahan mengukur pertumbuhan akar utama; (4) Larutan hara minimal Miftahudin et al. (2002) memiliki kekuatan ionik dan konsentrasi ion-ion mineral yang rendah. Ion SO42- dan H2PO4- merupakan ion yang berinteraksi sangat kuat dengan Al3+ (Famoso et al. 2010), oleh karena itu konsentrasinya harus diturunkan seminimal mungkin untuk analisis toleransi cekaman Al. Kandungan ion SO42- yang sangat rendah pada larutan hara minimal menyebabkan sedikit atau hampir tidak ada Al yang terendapkan sehingga banyak Al3+ aktif yang tersedia. Selain itu, kompetitor bagi Al3+ untuk berikatan pada situs
bermuatan negatif di dinding sel dan membran plasma akar akan berkurang, sehingga kerusakan akar sebagian besar merupakan cerminan dari aktifitas Al3+ (Famoso et al. 2010).
Analisis toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al dengan parameter RRG menggunakan larutan hara minimal hanya membutuhkan konsentrasi Al sebesar 15 ppm (555 μM) untuk dapat membedakan antara genotipe padi yang toleran Al dan sensitif Al. Namun belum ada laporan mengenai analisis toleransi cekaman Al pada tanaman padi (Wu et al. 2000; Nguyen et al. 2001, 2002, 2003; Kochian et al. 2004; Famoso et al. 2011) yang menggunakan karakter RRG sebagai parameter toleransi cekaman Al. Oleh karena itu karakter RRG sebagai salah satu parameter toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al merupakan suatu kebaruan (novelty) dari penelitian ini.
Keanekaragaman derajat sifat toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al sangat berguna bagi program pemuliaan tanaman padi, karena potensi yang terkandung di dalam plasma nutfah padi dapat dimanfaatkan untuk merakit varietas padi baru yang memiliki sifat unggul dan dapat beradaptasi serta tumbuh baik di tanah masam berkelarutan Al tinggi. Gen yang menyandikan toleransi cekaman Al yang terkandung di dalam genotipe padi Hawara Bunar yang toleran Al telah diisolasi, yakni gen B11. Gen B11 berpotensi menjadi gen toleran Al karena ekspresinya diinduksi oleh Al. Ekspresi gen B11 pada Hawara Bunar yang diberi perlakukan cekaman 15 ppm Al pada pH 4.0 selama 24 jam lebih tinggi dibandingkan dengan ekspresinya pada perlakuan tanpa Al (kontrol) dan dibandingkan pada varietas padi yang sensitif Al (IR64) baik pada perlakukan 15 ppm Al maupun kontrol. Pola ekspresi yang lebih tinggi pada genotipe padi yang toleran Al, yaitu dua kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan kontrolnya dan dengan yang sensitif Al baik pada kontrol maupun perlakuan Al, menunjukkan bahwa gen B11 terlibat dalam toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al atau merupakan gen toleran Al dari padi. Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al dan ekspresinya meningkat tinggi pada tanaman yang toleran Al dibandingkan yang sensitif Al menunjukkan bahwa gen tersebut terlibat dalam toleransi
cekaman Al pada tanaman tersebut (Ezaki et al. 2000; Kochian et al. 2004; Sasaki
et al. 2004; Huang et al. 2009).
Mengisolasi, mengklon, dan mengkarakterisasi gen toleran Al dari tanaman padi akan berguna untuk (1) mengembangkan varietas padi unggul yang tidak toleran terhadap cekaman Al menjadi toleran terhadap cekaman Al dengan cara mengintroduksikan satu gen saja, yaitu gen B11 yang diekspresikan secara berlebih. Hal ini dapat mengatasi masalah linkage drag yang biasa terjadi ketika melakukan persilangan; (2) memahami mekanisme toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al; (3) piramiding beberapa gen atau mengumpulkan sifat-sifat yang baik ke dalam satu tanaman melalui rekayasa genetika; dan (4) mengembangkan tanaman selain padi yang memiliki nilai ekonomi tinggi dan toleran terhadap cekaman Al.
Introduksi dan over ekspresi gen B11 pada tembakau untuk menganalisis fungsinya terkait toleransi cekaman Al menunjukkan bahwa gen B11 dapat meningkatkan toleransi tanaman tembakau transgenik terhadap cekaman Al. Hasil tersebut membuktikan bahwa gen B11 merupakan gen toleran Al yang berhasil diisolasi dari padi lokal Hawara Bunar yang toleran Al dan merupakan kebaruan dari penelitian ini
Hasil analisis over ekspresi akan menjadi lebih kuat jika dikomplementasikan dengan analisis pembisuan gen B11. Analisis over ekspresi dan pembisuan gen (analisis RNAi) merupakan dua pendekatan untuk mempelajari fungsi suatu gen (Curtis & Grossniklaus 2003; Thakur 2003; Ryan et
al. 2011). Analisis over ekspresi gen B11 di bawah kendali promotor kuat 35S
CaMV pada tanaman tembakau telah dilakukan untuk mempelajari ekspresinya, dengan fenotipe yang diamati berupa pertambahan panjang akar tanaman tembakau transgenik saat tercekam Al. Hasil percobaan menunjukkan bahwa pertambahan panjang akar tanaman tembakau transgenik pada cekaman 8.1 ppm Al (300 uM Al) selama 3 dan 8 hari lebih panjang dibandingkan pertambahan panjang akar tanaman tembakau non-transgenik. Analisis pembisuan gen B11 dengan teknik RNAi belum dilakukan. Teknik RNAi didasarkan pada proses menghentikan ekspresi gen B11 dan melihat fenotipe yang ditimbulkannya saat tercekam Al. Analisis RNAi dilakukan dengan mengkonstruksi vektor RNAi
pembawa gen B11, memasukkannya ke tanaman padi lain yang toleran Al atau Hawara Bunar, kemudian mengukur pertambahan panjang akar utamanya saat tercekam Al dan analisis RRG sebagai parameter toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al.
Analisis fungsi gen B11 pada tembakau transgenik membuktikan bahwa gen
B11 dapat meningkatkan toleransi tanaman tembakau transgenik terhadap
cekaman Al, namun apa protein yang disandikannya belum dapat ditentukan. Ananlisis bioinformatika selanjutnya dilakukan untuk menunjang data analisis fungsi gen tersebut dengan cara memprediksi peran protein B11 dalam toleransi cekaman Al. Analisis bioinformatika memprediksi bahwa gen B11 kemungkinan berperan sebagai faktor transkripsi yang terlibat dalam aliran transduksi sinyal saat tanaman tercekam Al. Pendugaan fungsinya sebagai faktor transkripsi tersebut dikarenakan protein B11 mengandung situs fosforilasi, miristoilasi, pengikatan protein kinase, interaksi protein-protein, dan protein-DNA, serta domain faktor transkripsi bZIP dan motif seperti C2H2-zinc finger. Situs dan domain tersebut umumnya dijumpai pada protein dan atau regulator yang terlibat dalam transduksi sinyal (Trewavas 2000; Jakoby et al. 2002; Krishna et al. 2003). Kombinasi RT-PCR kuantitatif, modified yeast one-hybrid, dan mutan ganda (Yamaji et al. 2009) dapat menjadi pilihan untuk membuktikan peran gen B11 sebagai faktor transkripsi dalam meregulasi ekspresi gen tertentu terkait toleransi cekaman Al. Sampai saat ini belum ada laporan mengenai isolasi faktor transkripsi dari tanaman padi yang ekspresinya berkorelasi dengan toleransi cekaman Al. Oleh karena itu gen B11 yang diisolasi dari Hawara Bunar yang toleran Al dan diduga berperan sebagai faktor transkripsi yang terkait toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al merupakan kebaruan dari penelitian ini.
Gen B11 merupakan gen yang terlibat dalam toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al, akan tetapi parameter fisiologi yang terkait dengan gen B11 belum diketahui. Penanda molekuler yang digunakan untuk mengisolasi gen B11 tersebut telah dikembangkan menjadi penanda molekuler kodominan berdasarkan CAPS dengan memanfaatkan polimorfisme situs enzim restriksi AluI dan selanjutnya disebut penanda molekuler B11-CAPS. Segregasi penanda molekuler CAPS mengikuti rasio pewarisan gen tunggal. Penanda molekuler
B11-
CAPS dapat membedakan tanaman homozigot dominan, homozigot resesif, dan heterozigot. Potensi penanda molekuler B11-CAPS sebagai alat seleksi dapat dilakukan pada kondisi populasi padi hasil persilangan antara padi yang mengandung alel gen B11 dari tetua padi yang toleran Al dan padi yang sensitif Al dengan tujuan untuk memonitor keberhasilan introgresi gen B11 sejak generasi awal.
Posisi gen B11 secara fisik pada kromosom 3 padi berada jauh (sekitar 7.808.383 pb) dari penanda molekuler CDO1395 atau dari salah satu QTL untuk karakter toleransi cekaman Al pada kromosom 3 padi yang telah ditemukan sebelumnya oleh Nguyen et al. (2003). Hasil tersebut mengindikasikan bahwa gen B11 kemungkinan bukan merupakan salah satu gen dari QTL tersebut yang ditentukan menggunakan fenotipe panjang akar relatif dan panjang akar saat tercekam Al (Nguyen et al. 2003). Kemungkinan gen B11 merupakan salah satu gen dari QTL untuk karakter toleransi cekaman Al dengan fenotipe yang lain. Oleh karena itu perlu dilakukan analisis lebih lanjut yang bertujuan mengetahui keterpautan antara penanda molekuler B11-CAPS dengan parameter toleransi cekaman Al menggunakan fenotipe toleransi cekaman Al yang lain pada populasi padi hasil persilangan antara varietas padi IR64 yang sensitif cekaman Al dan genotipe padi Hawara Bunar yang toleran cekaman Al.
