Aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh Bacillus lentus yang hidup pada
landak laut di perairan pantai Lombok Barat, Nusa Tenggara Barat
(Antibacterial activity of Bacillus lentus inhabiting sea urchin
from West Lombok coast, West Nusa Tenggara)
Ernin Hidayati, Bambang Fajar Suryadi
Program Studi Biologi, Fakultas MIPA Universitas Mataram Jalan Majapahit No. 62 Mataram 83125
Telp.0370-646506, Fax. 0370-646506
ABSTRACT
The increasing use of antibiotics resulted in increasing to antibiotics resistance of pathogenic microbes. The efforts of searhcing new antibiotics should be continued. Bacillus has long been known as producers of antibiotics, but most isolates obtained from terrestrial habitats. This research has been carried out optimization of the growth of Bacillus lentus inhabiting sea urchins from West Lombok coast. Four kinds of growth media were used in this study: Nutrient Broth, Nutrient Broth supplemented with NH4Cl, sterile distilled water and sterile distilled water supplemented with NH4Cl.
Supernatant of the growth media were tested by Kirby-Bauer method against bacterial test (Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas mirabilis, Klebsiella pneumoniae, and Escherichia coli). The growth of Bacillus lentus was not statistically significantly different in media supplemented with NH4Cl compared with no supplemented NH4Cl. This bacteria
produced antibacterial substances when grown in all of four media, but the production higher in media without NH4Cl. Antibacterial substances are produced in exponential and stationary phases of growth.
Antibacterial substances can inhibit the growth of bacterial test. Key words: Bacillus lentus, antibacteia, sea urchin, fermentation media
PENDAHULUAN
Meningkatnya penggunaan antibiotik
mengakibatkan terjadinya peningkatan resistensi mikrob patogen terhadap antibiotik yang sudah ada. Resistensi antibiotik tersebut merupakan salah satu alasan untuk terus mencari jenis antibiotik baru. Menurut Pelaez (2006), produk alami mikrob merupakan sumber antibiotik terbesar saat ini dan sangat penting sebagai sumber utama untuk masa yang akan datang. Bacillus adalah salah satu genus bakteri yang banyak menghasilkan senyawa antibiotik. Antibiotik yang dihasilkan Bacillus biasanya berupa senyawa peptida, antara lain basitrasin, gramisidin, sirkulin, dan polimiksin. Bacillus penghasil antibiotik pada umumnya diisolasi
dari tanah (Yilmaz et al. 2005; Aslim et al. 2002). Bacillus dari lingkungan yang berbeda kemungkinan dihuni oleh strain yang berbeda sehingga perlu dilakukan pencarian strain Bacillus penghasil antibiotik baru dari lingkungan yang berbeda.
Mikrob laut merupakan penghasil senyawa bioaktif baru yang potensial dibidang industri dan farmasi. Banyak senyawa antibiotik yang selama ini diperkirakan dihasilkan oleh invertebrata laut ternyata diproduksi oleh mikrob simbionnya (Hunter-Cevera et al. 2005; Zhang et al. 2005). Antibiotik yang dihasilkan oleh mikrob laut mempunyai kemampuan yang tinggi. Hal ini karena adanya efek pengenceran oleh air laut (Pelaez 2006). Penelitian yang dilakukan Kanagasabhapathy et al. (2004)
LAPORAN HASIL PENELITIAN
2010
menunjukkan bahwa Bacillus yang hidup di permukaan tubuh invertebrata laut menghasilkan senyawa kimia yang memiliki potensi antibakteri.
Nusa Tenggara Barat, khususnya pulau Lombok, mempunyai wilayah laut yang sangat luas. Kekayaan sumber daya hayati yang dimiliki sangat beragam, termasuk kekayaan jenis-jenis mikrob yang hidup di laut. Suryadi dan Febrianti (2009) telah mengisolasi 3 isolat Bacillus spp. dari tubuh landak laut yang hidup di perairan pantai Lombok Barat. Dalam penelitian ini telah dilakukan optimasi pertumbuhan dan uji antibakteri dari senyawa yang dihasilkan oleh B. lentus yang merupakan salah satu dari ketiga isolat yang hidup pada landak laut tersebut.
MATERI DAN METODE
Isolat B. lentus dan bakteri uji
B. lentus yang digunakan merupakan bakteri yang diisolasi dari saluran pencernaan landak laut yang hidup diperairan pantai Mentigi, Lombok Barat. Enam bakteri uji yang digunakan adalah
Gram positif (Streptococcus viridans,
Staphylococcus aureus, dan Bacillus cereus) dan Gram negatif (Pseudomonas mirabilis, Klebsiella pneumoniae, dan Escherichia coli). Bakteri tersebut merupakan isolat klinis koleksi Laboratorium Biomedik Rumah Sakit Umum Mataram, Lombok Barat.
Media aktivasi dan pertumbuhan B. lentus
Kultur stok B. lentus disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 6 menit. Bagian pelet dikultur pada medium Nutrient Agar (NA) dalam cawan petri dan diinkubasi selama 24 jam pada 35ºC. Media yang digunakan untuk peremajaan isolat adalah NA dan Pepton Kompleks.
Pembuatan kultur starter
Kultur starter dibuat dengan cara mengambil 1 loop kultur dari kultur peremajaan lalu dimasukkan kedalam 50 ml Nutrient Broth yang ditambahkan NaCl 5%. Inkubasi dilakukan pada 35ºC dalam inkubator goyang dengan kecepatan goyang 125 rpm selama 18 jam.
Fermentasi dan pengukuran pertumbuhan
Ada 2 jenis media fermentasi utama yang
digunakan yaitu Nutrient Broth dengan
penambahan suplemen (NBS) dan medium suplemen yang dilarutkan dalam akuades steril (SAQ). Kedua media ini kemudian divariasikan dengan penambahan sumber nitrogen berupa NH4Cl sehingga terdapat empat jenis media
fermentasi yaitu 1) NBS, 2) SAQ, 3) NBS dengan
penambahan NH4Cl, dan 4) SAQ dengan
penambahan NH4Cl. Sebanyak 5% inokulum
(7.5 ml kultur awal) dipindahkan ke 142.5 ml media fermentasi dan diinkubasi pada 35ºC dalam inkubator goyang dengan kecepatan goyang 125 rpm selama 48 jam. Pengukuran pertumbuhan dilakukan dengan metode total plate count dengan seri pengenceran menggunakan larutan NaCl 0.9%.
Pemanenan metabolit antibakteri
Pemanenan supernatan dilakukan setiap 4 jam dari setiap perlakuan sehingga dalam waktu 48 jam telah diperoleh 12 supernatan hasil fermentasi B. lentus. Sampel supernatan disentrifugasi pada kecepatan 3200 rpm selama 30 menit sehingga diperoleh pelet dan supernatan. Supernatan diambil dengan cara memipet dan dipindahkan kedalam tabung steril yang baru.
Uji kemampuan antibakteri dari metabolit dalam supernatan
Uji kemampuan antibakteri dari metabolit
yang ada dalam supernatan dalam
menghamabat bakteri uji dilakukan dengan metode Kirby-Bauer. Isolat uji dengan kepadatan 107 sel ml-1 ditumbuhkan pada
medium Muller Hinton Agar dengan cara disebar. Kertas cakram steril yang berisi 50 μl supernatan ditempelkan di atas biakan bakteri uji lalu diinkubasi pada 35ºC. Cakram antibiotik komersil digunakan sebagai kontrol positif. Pengukuran indeks zona bening dilakukan setelah 24 jam dengan cara membagi diameter zona bening dengan diameter koloni bakteri uji.
HASIL DAN DISKUSI
Kemampuan B. lentus dalam menghambat bakteri uji
B. lentus menghasilkan antibakteri yang dapat menghambat pertumbuhan keenam bakteri uji. Hal ini terlihat dari terbentuknya zona bening disekitar pertumbuhan koloni bakteri uji (Gambar 1). Zona bening tersebut merupakan zona dimana terjadinya hambatan pertumbuhan bakteri uji oleh senyawa antibakteri yang terkandung dalam supernatan B. lentus. Karakter zona hambat yang terbentuk terlihat seperti zona hambat oleh kontrol positif. Diameter zona hambat yang terbentuk dapat lebih luas dibandingkan dengan zona hambat oleh kontrol positif. Aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh B. lentus mengindikasikan spektrum luas karena
dapat menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif yang diujikan meskipun dengan kepekaan yang berbeda-beda.
Pertumbuhan B. lentus pada media dengan penambahan NH4Cl sebagai sumber nitrogen
B. lentus dapat tumbuh dengan baik pada keempat media yang digunakan (Gambar 2). Pola pertumbuhan yang mirip terlihat pada keempat media yaitu tercapainya fase stasioner diikuti oleh penurunan jumlah sel pada saat inkubasi 24. Glukosa yang terdapat dalam keempat media pertumbuhan tersebut dapat digunakan sebagai sumber energi oleh B. lentus untuk mendukung pertumbuhannya sampai sekitar 24 jam dan terlihat menurun setelah itu. Hal ini mengindi-kasikan bahwa penambahan sumber nitrogen berupa NH4Cl ke dalam media NBS (Gambar 2B)
dan SAQ (Gambar 2D) tidak menunjukkan pengaruh signifikan terhadap pertumbuhan B. lentus. Meskipun demikian, dari kurva pertumbuhan menunjukkan jumlah sel yang relatif masih tinggi dan kecenderungan meningkat kembali setelah inkubasi 24 jam pada media yang ditambahkan NH4Cl (Gambar 2 B dan D). Hal ini
menunjukkan bahwa NH4Cl dapat
memper-panjang daya tahan hidup B. lentus.
Pada umumnya, meskipun glukosa dalam media pertumbuhan telah habis digunakan, bakteri akan tetap hidup karena sumber nitrogen organik dalam media dapat digunakan juga sebagai sumber energi bila sumber karbon utama telah habis. Pada penelitian ini, peningkatan tahan hidup B. lentus pada media yang ditambahkan NH4Cl kemungkinan terjadi
melalui mekanisme yang berbeda terutama yang berhubungan dengan kemampuan regulasi
NH4Cl terhadap aktivitas [NAD(P)+]
transhidrogenase.
Seperti yang dikemukakan oleh Chien (2008), bahwa tidak semua jenis sumber
nitrogen dapat mendukung pertumbuhan
mikrob, tergantung pada jenis dan konsentrasi sumber nitrogen yang diberikan, kondisi pertumbuhan, serta jenis strain mikrob. Pada beberapa jenis bakteri seperti Klebsiella sp.,
penambahan NH4Cl pada medium
pertumbuhannya dapat meningkatkan
pertumbuhan bakteri tersebut baik secara anaerob maupun aerob. Hasil penelitian lain menunjukkan bahwa NH4Cl mempunyai efek
stimulan pada tahap awal germinasi spora B.cereus (Preston & Douthit, 1988).
Produksi antibakteri oleh Bacillus lentus
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa produksi antibakteri oleh B.lentus lebih tinggi pada media NBA dan SAQ tanpa penambahan NH4Cl. Secara kualitatif, luas
diameter zona hambat dan ketahanan zona yang terbentuk pada bakteri uji umumnya lebih tinggi, kecuali pada E. coli dan P. mirabilis. Pada E. coli dan P. mirabilis, antibakteri yang dihasilkan oleh B.lentus yang ditumbuhkan pada medium NBS dengan penambahan NH4Cl
(Gambar 3A) mempunyai pengaruh yang lebih baik dalam menghambat pertumbuhan kedua bakteri tersebut dibandingkan antibakteri dari medium NBS tanpa penambahan NH4Cl
(Gambar 3B).
Gambar 1. Zona bening yang terbentuk disekitar koloni bakteri uji menandakan adanya hambatan pertumbuhan bakteri uji oleh senyawa antibakteri (dalam cakram kuning) yang dihasilkan oleh Bacillus lentus. Diameter zona bening tersebut lebih besar dibandingkan zona bening yang dihasilkan oleh kontrol positif (dalam cakram putih).
A
B
C
D
Gambar 2. Pola pertumbuhan Bacillus lentus pada medium NBS (A), NSB dengan penambahan NH4Cl (B), SAQ (C), dan SAQ dengan penambahan NH4Cl (D)
dengan inkubasi pada 350C dan kecepatan goyang 125 rpm.
Senyawa antibakteri mulai dihasilkan oleh B. lentus sejak fase pertumbuhan awal sampai fase logaritmik dengan aktivitas tertinggi rata-rata dihasilkan pada akhir fase logaritmik yaitu setelah inkubasi 12 jam. Aktivitas produksi antibakteri kemudian menurun setelah inkubasi 24 jam.
Pemilihan media pertumbuhan yang tepat merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan produksi metabolit sekunder asal mikrob secara komersial. Oleh sebab itu, seleksi jenis nutrien
dan konsentrasinya sangat penting dilakukan selama pertumbuhan sel dan produksi metabolit (Kumar & Jana, 2009). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa jenis nutrien tertentu dengan konsentrasi tertentu dapat memacu atau sebaliknya menghambat pertumbuhan dan produksi metabolit, sehingga kajian mengenai produksi antibakteri selalu melibatkan kegiatan optimasi media produksi.
Seperti halnya karbon dan fosfat, nitrogen juga berperan sebagai modulator sintesis
Waktu inkubasi
Waktu inkubasi
Waktu inkubasi
A
B
C
D
Gambar 3. Diameter zona hambat bakteri uji yang dihasilkan oleh senyawa antibakteri Bacillus lentus dari sampel supernatan yang diambil pada waktu inkubasi berbeda. Inkubasi perlakuan uji dilakukan pada 350C selama 24 jam.
Sampel supernatan diperoleh dari medium NBS (A), NSB dengan penambahan NH4Cl (B), SAQ (C), dan SAQ dengan penambahan NH4Cl (D).
antibiotik. Berbagai jenis dan konsentrasi sumber nitrogen diketahui menghasilkan variasi yang sangat tinggi terhadap aktivitas antimikrob yang dihasilkan oleh berbagai strain Bacillus spp. (El-Banna & Quddoum 2007; Muhammad et al. 2009). Beberapa hasil penelitian melaporkan bahwa berbagai strain Bacillus mempunyai
kemampuan yang lebih rendah dalam
memproduksi antibiotik bila ditumbuhkan pada media yang ditambahkan NH4Cl dibandingkan
dengan media yang ditambahkan sumber nitrogen lain seperti KNO2, Ca(NO3)2, dan NaNO2 (El-
Banna & Quddoum 2007). Rendahnya kemampuan produksi antifungi juga terjadi pada Mycena leptocephala yang ditumbuhkan pada media yang ditambahkan NH4Cl dan
NaNO3 dibandingkan jika ditumbuhkan pada
media yang ditambahkan ekstrak yeast (Vahidi et al. 2004).
Antibiotik merupakan salah satu metabolit sekunder. Sintesis antibiotik seringkali direpresi oleh nutrien atau substansi lain yang berhubungan dengan percepatan pertumbuhan, misalnya glukosa dan ion amonium. Mikrob
Waktu inkubasi B. lentus Waktu inkubasi B. lentus
akan mulai mensintesis antibiotik pada saat level nutrien atau substansi tersebut menurun (Lancini & Parenti 1982). Oleh sebab itu, umumnya antibiotik disintesis setelah akhir fase logaritmik atau saat memasuki fase stasioner. Berdasarka n hasil penelitian ini diduga bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh B. lentus
kemungkinan bukan termasuk golongan
antibiotik. Selain itu, senyawa dalam supernatan yang diambil dari waktu inkubasi lebih dari 24 jam atau pada fase stasioner dan kematian juga menunjukkan adanya aktivitas antibakteri. Oleh sebab itu, diduga bahwa B. lentus menghasilkan lebih dari dua macam senyawa antibakteri.
Bacillus diketahui memproduksi berbagai substansi antimikrob yang termasuk golongan peptida dan lipopeptida (Abriouel et al. 2011). Bakteriosin adalah antimikrob dari golongan peptida yang diproduksi oleh banyak jenis Gram positif, termasuk Bacillus, kelompok bakteri asam laktat (LAB), dan Actinomycetes. Beberapa jenis bakteriosin yang dihasilkan oleh Bacillus antara lain cerein oleh B.cereus (Naclerio et al. 1993), linocin M18 oleh Brevibacterium linens M18 (Valdes-Stauber & Scherer 1994), subtilosin oleh B. subtilis (Sutyak et al. 2008), dan megacin A oleh B. megaterium 216. Adapun B. lentus memang diketahui memproduksi bakteriosin berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Sharma et al. (2006). Abriouel et al. (2011) menyebutkan bahwa bakteriosin dari kelompok Bacillus memiliki spektrum yang lebih luas dibandingkan dengan bakteriosin yang diproduksi oleh LAB.
Berdasarkan hasil yang diperoleh dalam penelitian ini, perlu dilakukan penelitian lanjutan karena beberapa alasan. B. lentus memproduksi senyawa antibakteri yang potensial karena dapat menghasilkan diameter zona hambat melebihi diameter zona hambat yang dihasilkan oleh kontrol positif. Selain itu, antibakteri yang dihasilkan berspektrum luas meliputi bakteri Gram positif dan negatif. Pengecekan juga perlu dilakukan terhadap jenis atau golongan
antibakteri yang dihasilkan. Kelompok
antimikrob seperti bakteriosin mempunyai aplikasi yang sangat luas, bukan hanya sebagai antimikrob, tetapi juga dapat diaplikasikan dibidang industri pangan sebagai aditif dan preservatif pangan, bahkan berbagai riset apikasi bakteriosin mengarah pada terapi berbagai penyakit.
SIMPULAN
Bacillus lentus menghasilkan senyawa
antibakteri yang dapat menghambat
pertumbuhan Streptococcus viridans,
Staphylococcus aureus, B.acillus cereus,
Pseudomonas mirabilis, Klebsiella
pneumoniae, dan Escherichia coli. Antibakteri tersebut diproduksi pada fase eksponensial dan stasioner. Penambahan sumber nitrogen berupa NH4Cl ke dalam media NBS dan SAQ tidak
berpengaruh secara signifikan terhadap
pertumbuhan B. Lentus tetapi dapat
memperpanjang daya tahan hidup bakteri tersebut. Adapun produksi antibakteri oleh B.lentus lebih tinggi pada media NBA dan SAQ tanpa penambahan NH4Cl.
PUSTAKA
Abriouel H, Franz CMAP, Omar NB, Galvez A (2011) Diversity and applications of Bacillus bacteriocins. FEMS Microbiol. Rev, 35: 201-232.
Aslim B, Saglam N, Beyatli Y (2002) Determination of some properties of Bacillus isolated from soil, Turk. J. Biol, 26:41-48.
Chien CC (2008) Taurine serves as sole source of nitrogen for aerobic and anaerobic growth by Klebsiella sp., World J. Microbiology Biotechnology 24:895-898. El-Banna NM, Quddoum SS (2007) Effect of
nitrogen source on the antimicrobial activity of the bacilli air flora. Annals of Microbiology, 57(4):669-671.
Hunter-Cevera J, Karla D, Buckley M (2005) Marine Microbial Diversity: The Key to Earth’s Habitability. American Society of Microbiology, Boston.
Kanagasabhapathy M, Nagata K, Fujita Y, Tamura T, Okamura H, Nagata S (2004) Antibacterial Activity of The Marine
Sponges Psammapsilla purpurea:
Importance Of its Surface- Associated Bacteria.
Kumar J, Jana K (2009) Cell growth prediction for Bacillus licheniformis through artificial neural network at simultaneous multiple variation in concentration of nutrients in media. J of Science, engineering dan Technology Kathmandu University, 5(2):78-87. Lancini G and F Parenti (1982) Antibiotic: An
Muhammad SA, Ahmad S, Hameed A (2009) Antibiotic production by thermophilic Bacillus specie SAT-4. J Pharm Science, 22(3):339-345.
Naclerio G, Ricca E, Sacco M, De Felice M (1993) Antimicrobial activity of a newly identified bacteriocin of Bacillus cereus. Appl Environmental Microbiology, 59(12): 4313–4316.
Pelaez F (2006) The historical delivery of antibiotics from microbial natural products;
Can history repeat?. Biochemical
pharmacology 71, 981-990. www.
elsevier.com/locate/ biochempharm.
Preston RA, Douthit HA (1988) Fungtional relationships between L- and D-alanine, inosine and NH4Cl during germination of
spores of Bacillus cereus T. J Gen Microbiology, 134(11):3001-10.
Sharma N, Kapoor G, Gautam N, Neopaney B (2006) Characterization of a partially purified bacteriocin of Bacillus sp. MTTC 43 isolated from rhizosphere of radish (Raphanus sativus) and its application as a potential food biopreservative. J of Scientific and Industrial Research, 88:881-886.
Suryadi BF, Febrianti N (2009) Aktivitas
antimikrobia bakteri Bacillus yang
bersimbiosis dengan landak laut di Pantai Lombok Barat. Laporan Penelitian Hibah Bersaing. Universitas Mataram, Mataram.
Sutyak KE, Wirawan RE, Aroutcheve AA, Chikindas ML (2008) Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptide subtilosin from the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens. J Applied Microbiology, 104(4):1067-1074.Vahidi H, Kobarfard F, Namjoyan F (2004) Effect of cultivation conditions on growth and antifungal activity of Mycena leptocephala. African J of Biotechnology, 3(11):606-609. Valdes-Stauber N, Scherer S (1994) Isolation and characterization of linocin M18, a bacteriocin produced by Brevibacterium linens. Applied and Environmental Microbiology, 60(10):3809-3814.
Yilmaz M, Somn H, Beyatli Y (2005) Antimicrobial activities of some Bacillus spp. Strains isolated from the soil. Microbiological Research, 161:127-13 1. Zhang L, An R, Wang J, Sun N, Zhang S, Hu J,
Kuai J (2005) Exploring novel bioactive compounds from marine microbes. Current Opinion in Microbiology, 8:276-281.
