PENAMBAHAN PLASMA SEMEN SAPI DAN ANTI OKSIDAN
GLUTHATIONE UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS
SEMEN BEKU KERBAU LUMPUR (Bubalus bubalis)
(Addition of FH Bull Plasma Semen and Glutathione Antioxidant to
Improve the Quality of Buffalo Frozen Semen)
D.A.KUSUMANINGRUM,P.SITUMORANG,E.TRIWULANNINGSIH dan R.G.SIANTURI Balai Penelitian Ternak, PO Box 221, Bogor 16002
ABSTRACT
Semen can be preserved and used later by keeping it in liquid nitrogen (-196°C) for a long time. Nevertheless, frozen semen is not without problems because a substantial portion of sperm are killed during freezing process. The effect of the addition of glutathione (GSH) to the sperm tris-diluent was examined. One of the most important roles of GSH is to protect the cells against the toxic effect caused by reactive oxygen species (ROS), possibly by protecting the sperm from free radical damage. This study was conducted to determine the effect of substitution of buffalo semen with bull semen and effect of GSH antioxidant adidition in the dilluent on frozen buffalo semen. Sperm were collected from FH bull with a body weight of 570 kg, as source of semen plasma, buffalo bull with body weight of 485 kg from Baluran (East Java) and buffalo dam with a body weight of 396 kg as dummy. Briefly after evaluation, semen was diluted in Tris-Citrate buffer medium, containing 20% (v/v) egg yolk and 7.4% (v/v) glycerol to get a concentration of spermatozoa of 100 x 106 per ml. GSH was added into sperm dilluent with doses: 0 mM; 1.0 mM, 2.0 mM and 3.0 mM as
treatments: A, B, C and D, respectively. Parameters recorded were the survivability of spermatozoa by evaluating the percentage of motile, live, condition of acrosome and plasma membrane immediately after the temperature reduced to 5oC, stored at 5oC for 4 hours before and after freezing (-196°C) and thawing (35°C).
The result showed that there was no interaction between substitution of bovine semen with GSH addition. Motility and intact plasma membrane of sperm with bovine plasma semen were higher than that without bovine plasma semen (55% vs 53% and 60% vs 55.8% respectively) at 5°C. The addition of GSH of 1, 2 and 3 mM and bovine plasma semen made the motility of sperm was higher than without bovine plasma semen at 5°C (54, 55 and 51.3 vs 53, 53.8 and 50%, respectively); and after thawing (45, 40 and 40 vs 42, 38.8 and 38.8%) even though were not significantly different (P > 0.05).
Key Words: Glutathione, Viability, Spermatozoa, Free Radicals
ABSTRAK
Semen dapat diawetkan dan dimanfaatkan lebih lama dengan cara menyimpannya di dalam nitrogen cair yang bersuhu -196°C, tetapi daya fertilitasnya sedikit menurun akibat proses pembekuan tersebut. Rendahnya kualitas semen kerbau berhubungan dengan tingginya konsentrasi kalsium, fosfat teresteriifikasi dan beberapa macam fosfat dalam seminal plasma yang memecah beberapa enzim. Salah satu penyebab kerusakan membran sel spermatozoa adalah adanya radikal bebas yang dapat merusak sel spermatozoa. Glutathione (GSH) sebagai antioksidan primer diharapkan dapat mengurangi kerusakan membran plasma. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penggantian plasma semen kerbau dengan plasma semen sapi serta penambahan glutathione dalam medium pengencer sperma. Materi penelitian menggunakan seekor sapi FH yang berumur kira-kira 3,5 tahun dengan bobot badan 570 kg sebagai sumber plasma semen, seekor pejantan kerbau rawa yang berumur sekitar 3,5 tahun dengan bobot badan 485 kg dan seekor kerbau betina yang berumur sekitar 3 tahun yang berbobot 396 kg sebagai pemancing. Larutan pengencer sperma diantaranya berupa tris sitrat buffer yang mengandung 20% (v/v) kuning telur dan 7,4% gliserol. Semen diencerkan pada suhu 35°C dengan larutan pengencer yang mengandung glutathione dengan dosis 0 mM; 1.0 mM; 2.0 mM dan 3.0 mM sebagai perlakuan A, B, C dan D. Parameter yang diukur adalah persentase motilitas, persentase hidup, membran plasma utuh (MPU), tudung akrosom utuh (TAU) pada suhu 5°C (sebelum dan sesudah equilibrasi) dan setelah dibekukan dan dithawing kembali pada suhu 35°C. Rancangan percobaan yang
digunakan adalah faktorial 2 x 4 dengan lima kali ulangan. Faktor pertama adalah tanpa dan dengan plasma semen sapi dan faktor kedua adalah konsentrasi glutathione. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa % Motil dan % MPU semen kerbau yang menggunakan plasma semen sapi lebih tinggi yaitu 55% vs 53% dan 60% vs 55,8%, pada suhu 5°C dan tanpa GSH; demikian pula bila ditambahkan GSH 1, 2 dan 3 mM dan plasma semen sapi, diperoleh motilitas lebih tinggi dibandingkan tanpa penggantian plasma semen sapi baik pada suhu 5°C (54, 55 dan 51,3 vs 53, 53,8 dan 50%); maupun pascathawing (45, 40 dan 40 vs 42, 38,8 dan 38,8%), walau secara statistik tidak berbeda nyata.
Kata Kunci: Plasma Semen, Kerbau, Sapi, Glutation
PENDAHULUAN
Teknologi IB telah banyak digunakan untuk meningkatkan produksi ternak ruminansia khususnya ternak sapi perah. Penggunaan IB pada ternak potong tidak seintensif seperti yang dilakukan pada ternak sapi perah. Hal ini dipengaruhi oleh sistim manajemen yang berbeda dimana pada sapi perah umumnya pemeliharaan dilakukan secara intensif sedang pada ternak potong masih ekstensif. Hasil kebuntingan yang didapat masih sangat rendah dan bervariasi terutama pada kondisi lapangan. Hasil ini berhubungan dengan kualitas semen yang digunakan.
Daya hidup spermatozoa post-ejakulat sangat terbatas. Pendinginan maupun pembekuan semen ke -196°C telah banyak dilaporkan dalam usaha menurunkan aktivitas spermatozoa sehingga dapat menghemat pemakaian enersi metabolik yang akhirnya akan memperpanjang daya hidup spermatozoa.
Rendahnya tingkat kebuntingan merupakan salah satu problem serius dalam reproduksi. Dari beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat kebuntingan, tingginya konsentrasi seminal plasma tampak sebagai problem pada semen sapi (PICKETT et al., 1975; BAAS, 1983). Seminal plasma baik pada sapi (AVELI, 1982) maupun kerbau (AHMAD et al., 1994) tampak menurunkan persentase motilitas, dan daya hidup sperma. Semen sapi mengandung lebih banyak inhibitory factor dibanding semen kerbau (GAULI, 1978; SHANI, 1990). COCKRILL, (1974) menyatakan bahwa rendahnya kualitas semen kerbau berhubungan dengan tingginya konsentrasi kalsium, fosfat teresteriifikasi dan beberapa macam fosfat dalam seminal plasma yang memecah beberapa enzim. Penggantian plasma semen kerbau dangan plasma semen sapi dan diencerkan dengan dengan pengencer laktosa dapat meningkatkan kualitas semen beku kerbau lumpur (AMIN et al., 1999).
Glutathione adalah antioksidan primer yang bekerja dengan cara mencegah pembentukan radikal bebas baru. Antioksidan ini mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang kurang mempunyai dampak negatif sebelum radikal bebas tersebut mempunyai kesempatan untuk bereaksi (WIJAYA, 1996).
DE MATOS dan FURNUS (2000) menyatakan bahwa glutathione (GSH) adalah komponen
non protein sulphydryl, yang menyimpan cysteine dan berperan penting dalam
memproteksi sel dari kerusakan. GSH meningkat selama maturasi oosit dalam ovari menjelang waktu ovulasi dan setelah fertilisasi, GSH berpartisipasi pada dekondensasi sperma dan paralel dengan aktivitas oosit.
TRIWULANNINGSIH et al. (2005) melaporkan
bahwa persentase motilitas dalam penelitian pembekuan semen sapi dengan penambahan glutathione pada media pengencer tris-sitrat, adalah 69,5, 72, 73,5 dan 73,5% masing-masing untuk perlakuan 0,0 mM, 0,5 mM, 1,0 mM dan 1,5 mM GSH. Viabilitas spermatozoa setelah dibekukan di dalam nitrogen cair (suhu –196oC) dan dithawing kembali pada suhu 35oC, menggambarkan bahwa persentase motilitas meningkat sesuai dengan peningkatan konsentrasi glutathione di dalam pengencer walaupun tidak berbeda nyata (P > 0,05) secara statistik. Persentase motilitas dalam penelitian ini adalah 44, 45, 49 dan 53,5%; berturut-turut untuk perlakuan 0,0 mM, 0,5 mM, 1,0 mM dan 1,5 mM, berarti penambahan glutathione di dalam pengencer telah memperbaiki kualitas semen beku sapi. Viabilitas spermatozoa setelah dithawing 30 menit pada suhu 35oC menunjukkan bahwa persentase motilitas berbeda nyata (P < 0,05) antar perlakuan tanpa diberi glutathione (17,25%) dibandingkan dengan yang diberi glutathione sebesar 1,0 mM (29,0%) dan 1.5 mM (29,5%), tetapi tidak berbeda nyata (P > 0,05) dengan perlakuan 0.5 mM (26,0%). Disini dapat terlihat bahwa
pemberian glutathione dapat mengurangi kerusakan sperma sapi beku, akibat adanya radikal bebas.
Penambahan glutathione dalam medium pengencer diharapkan akan mencegah timbulnya radikal bebas yang mungkin timbul selama proses pembuatan dan penyimpanan semen cair dan beku, sehingga diharapkan akan memperpanjang daya hidup semen cair dan beku. Dengan adanya glutathione dalam medium pengencer semen diharapkan akan membantu penetrasi semen ke oosit yang pada akhirnya dapat meningkatkan persentase kebuntingan.
MATERI DAN METODE
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fisiologi Reproduksi, Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Ciawi-Bogor.
Seekor sapi pejantan FH yang berumur sekitar 3,5 tahun dengan bobot badan 570 kg, digunakan sebagai sumber plasma semen sapi. Seekor pejantan kerbau rawa yang berumur sekitar 3,5 tahun dengan bobot badan 485 kg sebagai sumber semen dan seekor kerbau rawa betina yang berumur sekitar 3,5 tahun dengan bobot badan 396 kg sebagai pemacek, berasal dari Baluran (Jawa Timur). Pakan yang diberikan berupa rumput gajah, 5 kg ampas tahu dan 6 kg konsentrat komersial. Semen sapi dan semen kerbau seminggu sekali dikoleksi secara individu dengan menggunakan vagina buatan, mengikuti metode penelitian yang sudah baku di Balitnak.
Evaluasi semen dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi secara makroskopis meliputi: bau, warna, konsistensi dan volume segera setelah semen ditampung. Sedangkan pemeriksaan secara mikroskopis meliputi, konsentrasi, motilitas, persentase hidup dan persentase membran plasma utuh (MPU) pada saat sebelum dibekukan dan setelah dibekukan dan di cairkan kembali (thawing).
Rancangan penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap pola faktorial 2 x 4, dengan lima kali penampungan semen sebagai ulangan (STEEL dan TORRIE, 1991). Faktor pertama adalah tanpa dan dengan seminal plasma sapi dan faktor kedua adalah konsentrasi gluthaione
(GSH) pada larutan pengencer spermatozoa dengan konsentrasi 0,0 mM (kontrol), 1,0 mM, 2,0 mM dan 3,0 mM. Secepatnya setelah penampungan semen dievaluasi kualitasnya dan hanya semen yang baik dari individu kerbau digunakan sebagai bahan penelitian. Semen kerbau dan sapi masing-masing disentrifus, kemudian untuk perlakuan plasma semen, maka plasma semen kerbau digantikan dengan plasma semen sapi (volume plasma semen kerbau yang dibuang digantikan dengan volume yang sama plasma semen sapi).
Pengenceran dilakukan dengan menggunakan Tris-sitrat buffer pada suhu 35oC dengan menambahkan medium pengencer A yang mengandung 20%(v/v) kuning telur dan 2,4%(v/v) gliserol sehingga diperoleh konsentrasi spermatozoa 200 x 106 per ml. Larutan yang mengandung semen tersebut didinginkan dari suhu 35oC sampai mencapai 5oC dengan menggunakan mesin pendingin (cooling machine) selama 60 menit. Selama penurunan suhu, larutan B yang berisi Tris-sitrat buffer yang mengandung 20%(v/v) kuning telur dan 12,4%(v/v) gliserol ditambahkan pada saat suhu mencapai 15oC, 10oC dan 5oC, sehingga konsentrasi akhir spermatozoa menjadi 100 x 106 per ml. Larutan semen sesuai perlakuan diperiksa viabilitasnya pada suhu 5oC, kemudian diequilibrasi selama 4 jam pada suhu tersebut. Semen dimasukkan ke dalam mini straw dan ditempatkan diatas rak, lalu diuapkan 8 cm diatas nitrogen cair selama 10 menit sebelum dicelupkan ke dalam nitrogen cair untuk disimpan. Semen diperiksa viabilitasnya setelah equilibrasi sebelum dan setelah dibekukan dan di thawing pada suhu 35oC. Semua data dianalisis dengan general linier model (GLM) dari SAS (SAS,1980).
Parameter yang diukur
Kualitas semen kerbau: % Motilitas, % spermatozoa hidup, % MPU (Membran Plasma Utuh) pada tahap sebelum pembekuan dan setelah dibekukan dan dicairkan kembali.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Rata-rata kualitas semen kerbau rawa (Tabel 1) yang digunakan dalam penelitian ini berada pada kisaran normal dan layak untuk
diencerkan dan dibekukan. Sedangkan Tabel 2 dan 3 berikut menunjukkan komposisi kimia plasma semen kerbau dan sapi.
Tabel 1. Kualitas semen segar kerbau lumpur
(Bubalus bubalis)
Parameter Nilai Warna Krem Bau Normal Konsistensi Agak kental Volume cc Gerakan massa + sampai +++
Konsentrasi 1,598 x 109
Spermatozoa hidup 82,6%
Tabel 2. Perbandingan komposisi kimia antara
plasma semen kerbau Murrah dengan plasma semen sapi.
Unsur kimia Kerbau Murrah (mg/100ml) Sapi (mg/100ml) Nitrogen non protein (NPN) 109,00 48,00 Klorida 373,00 248,00 Kalsium 40,00 25,00 Asam askorbat 4,13 14,29 Asam sitrat 489,00 720,00 Total fosfor 103,00 47,00 Indeks fruktolisis 1,44 1,99 Sumber: AMIN (1999)
Berdasarkan Tabel 2, terlihat bahwa NPN kerbau 109 mg/100 ml jauh lebih tinggi dibandingkan dengan sapi yang hanya 48,00 mg/100 ml. Komponen inilah yang mungkin menyebabkan kualitas semen beku kerbau rawa lebih rendah dibandingkan sapi, karena adanya sisa metabolisme spermatozoa. Disamping hal tersebut asam askorbat sapi 14,29 mg/100 ml dibandingkan dengan kerbau 4,13 mg/100 ml, dimana asam askorbat merupakan salah satu antioksidan alami yang dapat mempertahankan kualitas semen sapi selama proses pembekuan. Namun kandungan
klorida, kalsium dan fosfor plasma semen kerbau lebih tinggi dibandingkan dengan sapi. Volume semen kerbau hanya sekitar 1.25 ml, sedangkan pada sapi 5 – 8 ml per ejakulasi (Tabel 3).
Tabel 3. Karakteristik komponen kimia dari semen
sapi
Karakteristik komponen kimia Semen sapi Volume ejakulasi (ml) 5 – 8 Konsentrasi spermatozoa (106/ml) 800 – 2000
Spermatozoa/ejakulasi (109) 5 – 15
Sperma motil (%) 40 – 75 Morfologi spermatozoa normal
(%) 65 – 95 Protein (g/100 ml) 6,8 pH 6,4 – 7,8 Fruktosa 460 – 600 Sorbitol 10 – 140 Asam sitrat 620 – 806 Inositol 25 – 46
Glyceryl phospohoryl choline (GPC) 100 – 500 Ergothioneine 0 Sodium 225 ± 13 Potasium 155 ± 6 Kalsium 40 ± 2 Magnesium 8 ± 0,3 Khloride 174 – 320
Sumber: HAFEZ dan HAFEZ (2000)
Tabel 4 berikut memperlihatkan larutan pengencer Tris-sitrat buffer yang digunakan dalam penelitian ini. Pemberian glutathione (GSH) sebagai antioksidan diharapkan dapat mempertahankan kualitas semen kerbau selama proses pembekuan yang pada akhirnya memperbaiki kualitas semen beku kerbau rawa (Bubalus bubalis). GSH adalah tripeptida yang dapat menjaga penurunan kualitas lingkungan dalam sel dan berkolerasi positif terhadap perkembangan awal dan viabilitas embrio setelah dibekukan (TAKAHASHI et al.,1997). Salah satu fungsi GSH yang penting adalah
Tabel 4. Komposisi larutan Tris-Sitrat buffer
Bahan Larutan A Larutan B Tris (Hydroxymethyl) amino methane (g)
Asam sitrat (g) Laktosa (g) Streptomycin (mg/ml) Benzylpenicillin (IU/ml) Gliserol, % (v/v) Kuning telur, % (v/v)
Glutathione, mM (sebagai perlakuan)
2,422 1,34 1,0 1000 500 2,4 20% 0; 1,0; 2,0; 3,0 2,422 1,34 1,0 1000 500 12,4 20% 0; 1,0; 2,0; 3,0
GSH dapat memproteksi sel dari efek racun yang disebabkan oleh adanya Reactive Oxygen
Species (ROS).
Pada Tabel 5 menggambarkan viabilitas semen kerbau pada saat suhu 5°C, terlihat bahwa persentase motil (54 vs 53%) dan membran plasma utuh (63,2 vs 53,8%) pada semen kerbau yang mengandung plasma sapi dan glutathione 1 mM, cukup baik dan layak untuk dibekukan. Demikian pula motilitas dan MPU semen kerbau tanpa GSH tetapi yang menggunakan plasma sapi (55 vs 53%) dan (60,0 vs 55,8%) lebih baik dibanding tanpa penggantian plasma semen sapi, walau secara statistik antar perlakuan tidak berbeda nyata.
Hal ini menggambarkan bahwa glutathione yang diberikan mempunyai efek yang sama terhadap spermatozoa. Dapat dikatakan bahwa untuk spermatozoa yang disimpan pada suhu 5°C dan digunakan pada hari yang sama dengan saat penampungan, tidak perlu diberikan antioksidan, tetapi bila spermatozoa tersebut disimpan dalam waktu yang lebih lama, mungkin perlu diberikan antioksidan untuk
mengurangi adanya kerusakan pada membran plasma spermatozoa cair yang berakibat pada rendahnya fertilitas.
Pada Tabel 6 berikut ini menggambarkan viabilitas semen beku kerbau setelah thawing, terlihat bahwa perlakuan pemberian 1mM glutathione dan penggantian plasma semen sapi menggambarkan hasil yang terbaik dibandingkan dengan perlakuan yang lain, walaupun tidak berbeda nyata; dimana diperoleh persentase motil 45%, persentase hidup 70,6%, persentase membran plasma utuh 27,7% dan persentase tudung akrosome utuh 44,2%. Hal ini terjadi karena di dalam plasma semen sapi mengadung Vitamin C lebih tinggi dibandingkan dengan plasma semen kerbau, dimana menurut AMIN (1999) di dalam plasma semen kerbau mengandung asam askorbat 10,70 mg/100 ml, dibandingkan dengan 18,10 mg/100ml pada sapi. Seperti telah diketahui bahwa vitamin C merupakan antioksidan alami yang larut dalam air. Kandungan protein plasma semen kerbau lumpur 314 mg/100 ml dan pada sapi 694 mg/100 ml.. Hal inilah yang
Tabel 5. Pengaruh penggunaan plasma semen dan glutathione terhadap daya hidup spermatozoa pada suhu
5°C
Tanpa plasma sapi Dengan plasma sapi GSH (mMol)
% M % Hidup % MPU % M % Hidup % MPU 0 mMol 53,0 76,8 55,8 55,0 76,8 60,0 1 mMol 53,0 79,6 53,8 54,0 77,2 63,2 2 mMol 53,8 76,5 64,3 55,0 72,5 65,8 3 mMol 50,0 73,3 67,3 51,3 70,3 58,8 Rataan 52,5 76,7 59,7 53,9 74,5 61,9
Tabel 6. Pengaruh plasma semen sapi dan glutathione terhadap viabilitas spermatozoa kerbau pascathawing
GSH Plasma kerbau Plasma sapi
(mMol) % M % H %MPU %TAU % M % H %MPU %TAU
0 46,0 67,0 38,0 55,2 42,0 68,6 29,6 56,2 1 42,0 62,4 30,0 46,8 45,0 70,6 27,7 44,2 2 38,8 63,3 29,3 53,3 40,0 67,0 29,8 43,8 3 38,8 63,3 29,8 51,0 40,0 65,3 29,5 54,8 Rataan 41,7 64,1 32,0 51,5 41,9 68,1 28,9 49,7
menyebabkan kualitas semen beku kerbau lumpur yang diganti plasma semennya dengan plasma semen sapi menjadi lebih baik viabilitasnya.
Persentase hidup lebih tinggi dibandingkan persentase motilitas pada semua perlakuan, hal ini adalah normal; karena spermatozoa yang hanya bergerak perlahan-lahan, tetapi masih hidup dan masih dapat memfertilisasi oosit walaupun secara in vitro maupun ICSI (intra
cytoplasmic sperm injection) namun tidak
secara inseminasi buatan yang konvensional.
SULISTYOWATI (2000) menyatakan bahwa dampak perusakan pada protein oleh radikal bebas menyebabkan katarak, dampak pada lipid menyebabkan aterosklerosis dan dampak pada DNA menyebabkan kanker. Glutathione peroksidase merupakan golongan enzim antioksidan yang mengandung selenium yang penting dalam mengurangi hidroperoksida.
Menurut ALVAREZ dan STOREY (1982) dalam HERDIS et al. (2002) peroksidasi lipida terjadi pada spermatozoa yang disimpan lama dan dapat menurunkan daya tahan sehingga mempengaruhi pengawetan semen untuk inseminasi buatan.
KESIMPULAN
Penggunaan plasma semen sapi dan Glutathione 1,0 mM dapat memperbaiki viabilitas semen beku kerbau.
DAFTAR PUSTAKA
AHMAD,M.,Z.A.SHAH,K.M.AHMAD,A.KHAN and
M.Z. HASSAN. 1994. Liveability of buffalo spermatozoa with an without seminal plasma at 37°C. Pakistan Vet. J. 14: 2003 – 20 06.
AMIN.M.R., M.R.TOELIHERE, T.L.YUSUF dan P.
SITUMORANG. 1999. Pengaruh plasma semen
sapi terhadap kualitas semen beku kerbau Lumpur (Bubalus bubalis). JITV 4(3): 143 – 147.
AVENELL, J.A. 1982. Freezing of swamp buffalo semen. Anim. Reprod. Sci. 5: 141 – 145 BAAS,J.,P.C.MOLAN and P.SHANNON. 1983. Factor
in seminal plasmaof buffalo that affact the viability and motility of spermatozoa. J.
Reprod. Fert. 68: 275 – 280.
COCKRILL,W.R. 1974. The husbandty and health of
domestic buffalo. FAO/UN Rome.
DE MATOS D.G. and C.C. FURNUS. 2000.The importance of having high glutathione (GSH) level after bovine in vitro maturation on embryo development. Effect of beta-mercaptoethanol, cystein and cystine.
Theriogenology. 53: 761 – 771.
EARL,C.R.,J.KELLY,J.ROWE and D.T.ARMSTRONG.
1997. Glutathione treatment of bovine sperm enhances in vitro blastocyst production rates.
Theriogenology. 47: 255 (Abstract).
GANGULI, N.C. 1978. Biochemistry of semen processing buffalo reproduction and artificial insemination. Proc. of seminar sponsored by FAO/Gov India.
HERDIS,I.KUSUMA,M.SURACHMAN,M.RIZAL,I.K.
SUTAMA,I. INOUNU,B.PURWANTARA dan I. ARIFIANTINI. 2002. Peningkatan kualitas
semen beku domba Garut melalui penambahan α-tokoferol ke dalam pengencer susu skim kuning telur. JITV 7(1).
SULISTYOWATI, T. 2000. Radikal ebas dan antioksidan. Cermin Dunia Kedokteran. No. 128.
TAKAHASHI, M.,N. SAKA, Y. KANAI and OKANO. 1997. Depletion of glutathione cause DNA damage and increase of hydrogen peroxide levels in bovine embryos. Theriogenology. 47: 312 (Abstract).
TRIWULANNINGSIH,E.,P.SITUMORANG,T.SUGIARTI
R.G. SIANTURI dan D.A. KUSUMANINGRUM. 2005. Peningkatan kualitas semen beku sapi melalui penambahan glutathione pada medium pengencer sperma. Pros. UGM.
WIJAYA, A. 1996. Radikal bebas dan parameter
status antioksidan. Forum Diagnostikum No. 1. Lab. Klinik Prodia
DISKUSI Pertanyaan:
Mengapa yang digunakan hanya gluthatione tidak dibandingkan dengan anti oksidan yang lain?
Jawaban:
Karena kita akan melihat kadar gluthatione yang paling bagus terhadap kualitas semen beku kerbau lumpur
