KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
A. TUJUAN PERCOBAAN : 1. Menentukan komposisi eluen yang tepat dengan metode cincin terkonsentrasi.
2. Menentukan nilai Rf dari zat warna pada
tanaman dengan menggunakan pelat KLT. B. DASAR TEORI
Kromatografi lapis tipis (KLT) atau Thin Layer Chromatography
(TLC) dalah salah satu jenis kromatografi cair-cair dan berdasarkan
mekanisme pemisahannya termasuk kromatografi adsorpsi serta jika ditinjau dari konfigurasinya termasuk kromatografi planar. Dasar pemisahan kromatografi lapis tipis adalah perbedaan kecepatan migrasi di antara fasa diam yang berupa padatan dan fasa gerak yang merupakan campuran solven (eluen) yang dikenal dengan pelarut pengembang campur. Fasa diam yang digunakan adalah lapisan tipis adsorben yang disalurkan pada sebuah pelat dari kaca, aluminium foil tebal, atau plastik. Sebagai adsorben dapat digunakan silika gel, aluminium, atau selulosa.
Pelat KLT dibuat dengan mencampurkan adsorben dengan suatu bahan pengikat, seperti kalium sulfat (gips), polivinil alkohol, atau kanji dan air sehingga menjadi suatu bubur kental. Kemudian bubur kental disalutkan ke pelat secara merata dengan ketebalan 0,1 – 0,25 mm untuk tujuan analitik atau sekitar 1 – 2mm untuk KLT preparatif. Setelah itu pelat dikeringkan dan dipanaskan dalamoven pada suhu 110°C untuk mengaktifkan adsorben tersebut. Pengovenan ini dimaksudakan agar pelat lebih kering lagi dan molekul air yang terikat dipelat terlepas sehingga pelat dapat mengikat molekul lain dan noda yang didapatkan tampak jelas.
Analisis dengan KLT yaitu 1. Persiapan pelat
Untuk pengujian cincin terkonsentrasi, pelat diberi tanda titik dengan pensil untuk tempat menotolkan noda dan tiap titik memiliki jarak yang sama panjangnya satu sama lain. Dan untuk penentuan Rf, pelat diberi
tanda garis sebagai dengan pensil yang berjarak 1 cm dari bagian bawah dan 0,5 cm dari bagian atas. Pada pemberian tandadan garis ini tidak
menggunakan tinta melainkan menggunkan pensil karena jika menggunakan tinta nanti tintanya bisa ikut berpendar atau memancarkan warna sebab tinta terdiri dari berbagai macam warna.
2. Pemilihan pelarut pengembang (eluen)
Pemilihan eluen tergantung pada jenis analit yang akan dipisahkan. Eluen yang menyebabkan seluruh noda yang ditotolkan pada pelat naik sampai batas atas pelat (solvent front) tanpa mengalami pemisahan berarti eluen terlalu polar. Sebaliknya jika noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak berarti eluen kurang polar. Untuk menguji kesesuain eluen dengan analit digunakan metode cincin terkonsentrasi yang memberikan gambar sebagai berikut
Hasil kromatografi yang diadapat dari penggunaan eluen yang kurang polar, polar dan eluen yang sesuai adalah
Kurang polar Normal Terlalu polar Noda
sampel Lapisan luar pelarut (solvent front)
Kurang polar Kurang polar Terlalu
3. Persiapan “Chamber”
Chamber yang digunakan dapat berupa bejana, gelas, atau botol dari
kaca dengan dasar rata. Bagian dalam chamber dilapisi dengan kertas saring sampai seluruh dinding chamber tertutup oleh kertas saring tetapi bagian atas chamber tidak tertutup kertas saring sekitar 2 –3 cm. Kemudian eluenyang digunkan dimasukkan kedalam chamber sebanyak 5 mL untuk menjenuhi kertas saring dengan uap eluen tersebut dan selama proses penjenuhan chamber harus ditutup dengan pelat kaca sampai kertas saring basah seluruhnya. Kertas saring tidak boleh melebihi tinggi gelas karena uapnya dapat keluar melalui kertas saring yang berada di luar gelas sehingga chamber tidak jenuh lagi dan noda tidak naik. Jika kertas saring terlalu kecil maka chamber tidak akan jenuh semuanya sehingga noda sulit naik atau berkembang.
4. Tahap penotolan dan tahap pengembangan
Untuk pengujian cincin terkonsentrasi, pada sebuah pelat ditotolkan beberapa noda sampel yang sama kemudian setiap noda ditotolkan eluen yang berbeda. Sedangkan untuk penentuan Rf, pada sebuah pelat
ditotolkan beberapa noda yang sama di batas bawah pelat. Kemudian pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan. Penempatan pelat dilakukan dengan hati-hati sehingga lapisan tipis fasa diam pelat tidak bersentuhan dengan kertas saring di dalam chamber dan noda yang ditotolkan tidak terkena pelarut. Setelah pelat diletakkan dengan benar,
chamber ditutup dan dibiarkan eluen merambat naik secara kapiler.
Setelah eluen mencapai batasatas pelat, maka pelat segera diangkat dan noda yang terbentuk ditandai dengan pensil, kemudian diukur Rf-nya.
Jika tidak ada noda yang terlihat maka pelat disemprot dengan pereaksi penimbul warna seperti ditizon, ninhidrin, kalium kromat, amonium sulfida, dan sebagainya. Atau dengan cara menyinari pelat dengan lampu ultra violet atau menjenuhkan pelat dengan uap iodium.
Cara menghitung Rf adalah
eluen jarak pelat bawah batas dengan noda jarak = f R
n x x S 2 2 =
∑
−C. ALAT DAN BAHAN
a. Pelat kaca yang berukuran 5x 2 cm dan 3 x 5 cm b. Pipa kapiler
c. Pinset panjang
d. Corong pemisah 100 mL
e. Gelas yang memiliki dasar rata, lurus, diameter ± 10 cm dan tinggi ± 7 cm
f. Kertas saring Whatman selebar bagian dalam gelas dan setinggi 2-3 cm dibawah mulut gelas
g. Gelas ukur 10 mL h. Erlenmeyer 100 mL i. Kaja arloji
j. Pelat kaca k. Pelat cat air l. Metanol
m. Daun pandan betawi yang
D. CARA/ALUR KERJA 1. Persiapan Sampel
Sampel: pandan betawi
2. Persiapan pelat
25 gr pandan betawi yang sudah dihaluskan
25 mL metanol
+ 25 mL diklorometan • Direndam
• Diambil filtratnya (diperas dengan tangan yang sudah memakai sarung tangan) setelah larutan berwarna cukup tua.
• Filtrat dimasukkan ke dalam corong pemisah.
• Campuran dikocok baik-baik dengan arah sama sambil sekali-sekali dibuka tutupnya.
• Campuran didiamkan sampai terbentuk dua lapisan.
• Lapisan bawah diambil dan digunakna sebagai pigmen sampel.
Pelat 3 X 5 cm
Pelat 2 X 5 cm • Dioven
• Diberi beri titik-titik dengan pensil untuk tempat menotolkan noda dengan jarak ± 1 cm dan sehingga dapat memuat 6 titik
• Diberi batas dengan pensil. Batas bawah ± 1 cm dan batas atas 0,5 cm
3. Persiapan Eluena dan Tahap Penotolan dan Pengembangan Sampel a. untuk cincin terkonsentrasi
b. Untuk penentuan Rf
Metanol diklorometana
• Dicampur ke dalam vial-vial dengan perbandingan metanol : diklorometan sebagai berikut: A. 3 : 7 B. 4 : 6 C. 5 : 5 D. 6 : 4 E. 7 : 3 F1. 8 : 2 F2. 2 : 8 Kertas saring
+ 5 mL campuran metanol dan diklorometana
• Dimasukkan ke dalam gelas hingga menutupi seluruh dinding gelas tetapi tidak melebihi bagian atas gelas.
• Ditutup dengan pelat kaca sampai kertas saring basah seluruhnya.
Hasil Hasil
4. Tahap penotolan dan pengembangan sampel a. untuk cincin terkonsentrasi
b. untuk penentuan Rf
• Sampel ditotolkan 2-3 kali dengan pipa kapiler pada enam titik yang telah diberi tanda dengan pensil tadi sampai warnanya cukup jelas. Noda yang ditotolkan harus pada tempat yang sama.
• Diberi kode A-F untuk setiap noda
• Campuran pada vial A-F ditotolkan pada noda
• Dibandingkan eluen mana yang cocok untuk sampel.
Pelat 3 X 5 cm
Pelat 2 X 5 cm
• Sampel ditotolkan pada batas bawah pelat KLT 2-3 kali hingga noda cukup jelas. • Pelat kaca dibuka.
• Pelat KLT dimasukkan ke dalam gelas dengan hati-hati dengan menggunakan pinset sampai posisi pelat bagian bawah menyentuh dasar gelas (tidak boleh miring). Noda jangan sampai terkena eluen.
• Segera ditutup kembali gelas tersebut dan dibiarkan mengembang sampai eluen tersebut menyentuh batas atas pelat.
• Saat eluen menyentuh batas atas pelat, pelat KLT diambil dengan hati-hati.
• Noda diamati dan diberi tanda pensil, dikeringkan.
• Ditutup denga selotip agar noda tidak memudar warnanya.
• Harga Rf setiap komponen yang
dihasilkan oleh pemisahan dihitung.
Hasil Hasil
E. DATA HASIL PENGAMATAN 1.Cincin terkonsentrasi Jenis A B C D E F Kunyit C C T T C C Pandan C T C T C C Keterangan : K : kurang polar C : cukup polar T : terlalu polar
Kunyit : yang cukup polar adalah = E, F Pandan : yang cukup polar adalah = C, E
Jadi eluen yang di gunakan adalah E dengan perbandingan metanol dan diklorometana adalah 7 : 3.
2. Penentuan Rf
Rf1 Rf2 Rf3 Rf4 Rf5 Rf6
I II Rata2 I II Rata2 I II Rata2 I II Rata2 I II Rata I II Rata2 Kunyit 0,2 06 0,206 0,206 0,338 0,3 52 0,345 0,4 85 0,4 85 0,485 0,6 32 0,647 0,639 Pandan 0,5 0,529 0,5145 0,588 0,6 03 0,595 0,6 17 0,6 47 0,542 0,6 76 0,676 0,676 0,7 65 0,79 4 0,77 9 0,82 4 0,838 0,831
F. DISKUSI DAN PEMBAHASAN
Pada percobaan KLT ini dilakukan dengan beberapa tahap dan digunakan dua jenis sampel yaitu kunyit dan daun pandan betawi. Pada masing-masing sampel ini diambil ± 15gr ekstrak, kemudian pada ekstrak daun pandan ditambahkan 25 ml metanol dan pada ekstrak kunyit ditambahkan etanol sebagai pelarut. Fungsi dari masing-masing pelarut ini adalah untuk mengekstrak zat warna pada sampel, yang ditunjukkan dengan perubahan warna semakin tua. Hijau tua pada pandan dan kuning tua pada kunyit.
Setelah diperoleh warna yang cukup tua, masing-masing sampel ini dimasukkan dalam corong pemisah yang berbeda dan masing-masing ditambahkan 25 ml diklorometan. Diklorometan ini berfungsi sebagai pengikat pengotor pada sampel. Setelah terbentuk lapisan, dimana lapisan bawah merupakan fase organik dan bagian bawah atas merupakan air dan pengotor. Lapisan bawah (fase organik) ini diambil dan digunakan sebagai pigmen sampel, yang merupakan pigmen murni dari pandan dan kunyit.
Pada tahap kedua merupakan tahap persiapan pelat. Pelat yang digunakan pada percobaan ini berupa pelat aluminium, dengan ukuran 3x5 cm. Pada salah satu permukaan pelat ini terdapat lapisan tipis suatu adsorben yang berfungsi sebagai media pemisahan (fase diam). Adsorben ini berupa serbuk halus yang diubah menjadi bubur (slurry) berair dan direkatkan pada pelat, untuk membantu perekatan pada pelat, surry ini ditambahkan zat pengikat yang berupa gips, barium sulfat, polivinil alkohol atau kanji. Adsorbenini mempunyai gugus OH yang dapat bereaksi dengan uap air diudara, akibatnya silika adsorben dapat menjadi jenuh dan tidak dapat digunakan lagi. Oleh karena itu sebelum dipakai adsorben ini diaktivasi terlebih dahulu untuk menghilangkan kandungan airnya dengan cara memanaskannya dalam oven. Selanjutnya pada pelat ini dibuat enam titik-titik kecil dengan jarak antara masing-masing 1 cm dan titik dibuat dengan pensil untuk menghindari kemungkinan ikut terlarut bila mengunakan bolpoint saat ditotolkan pelarut.
Tahap berikutnya, masing-masing titik pada pelat satu ditotolkan sampel dari daun pandan dan pada pelat dua ditotolkan sampel dari kunyit. Sebelumnya masing-masing titik diberi tanda A, B, C, D, E, dan F. Selanjutnya pada masing-masing titik-titik sampel ditambahkan pelarut pengembang (eluen) yang terdiri dari metanol dan diklorometana. dengan perbandingan :
A = 3:7
Bersifat urang polar B = 4:6
C = 5:5
Bersifat cukup polar D = 6:4
E = 7:3 F1 = 8:2
Bersifat terlalu polar F2 = 8:2
Berdasarkan percobaan ini dihasilkan data :
Jenis A B C D E F Kunyit K C T T C C Pandan K T C T C K Keterangan : K : kurang polar C : cukup polar T : terlalu polar
• Data 1 Tabel Cincin Terkonsentrasi
Dapat diketahui setelah diuji dengan eluen A, B, dan C ternyata sampel kunyit kurang polar. Hal ini dapat dilihat dari bercak sampel yang
dihasilkan setelah ditambahkan eluen. Setelah penambahan eluen pada sampel kunyit, bercak yang dihasilkan kurang mengembang, hal ini dikarenakan eluen A, B, dan C kurang polar dari sampel. Akan tetapi bercak yang dihasilkan oleh eluen A lebih lebar dari eluen B, dan bercak eluen B lebih lebar dari eluen C. sehingga dapat diketahui eluen A lebih polar dari B dan B lebih polar dari C. Pada tiga totolan sampel kunyit berikutnya dengan eluen D, E dan F menghasilkan luas bercak yang hampir sama dan ketiga-tiganya cukup polar.
Selanjutnya pada sampel pandan dilakukan pengujian sebanyak dua kali. Pada pengujian pertama dapat diketahui pada sampel A, B, C, D dan E bersifat cukup polar. Pada sampel A, B, C, D dan E memiliki bentuk cincin yang tidak bulat sempurna. Hal ini dapat disebabkan pada penotolan sampel yang kurang merata dan penotolan eluen pada sampl tidak tepat pada titik sampel. Cincin F terbebtuk cincin yang lebih sempurna, dimana bercak dapat mengembang dengan sempurna saat ditetesi eluen. Hal ini menunjukkan pelarut (eluen) F bersifat polar.
Pada tahap penentuan Rf digunakan eluen E dengan perbandingan metanol terhadap diklorometana adalah 7:3. pada percobaan ini digunakan dua buah pelat pada masing-masing tepi atas dan bawah diberi batas 0,5 cm dan 1 cm dengan pensil. Selanjutnya pada masing-masing pelat pada batas bawah ditotolkan pigmen kunyit dan pandan cina, Pelat ini dimasukkan dalam gelas yang telah berisi eluen. Gelas yang digunakan harus berinding dan berdasar rata. Hal ini untuk menghindari pelat agar tidak miring sehingga diperoleh bercak sampel yang tegak lurus yang memeprmudah dalam menentukan jarak perpindahannya. Akan tetapi sebelum eluen dimasukkan dalam gelas, pada sekeliling tepi sebelah dalam pada gelas dilapisi dengan kertas saring, kemudian eluen dimasukkan dan ditutup dengan kaca. Kertas saring ini digunakan sebagai indikator jenuh tidaknya eluen. Apabila eluan jenuh maka seluruh kertas saring akan basah. Perubahan ini dapat diamati melalui tutp kaca. Setelah semua kertas basah, pelat yang telah ditotolkan sampel dimasukkan dalam gelas dengan menggunakan pinset. Dan selanjutnya eluen yang merupakan fasa gerak akan merambat naik hingga ujung atas pelat. Secara bersamaan zat terlarut (sampel) akan terangkut dengan laju yang
bergantung pada kelarutannya dalam fasa gerak.pada jalur perpindahn ini terdapat noda/warna sampel ang terpendar, dimana pada sampel kunyit terbentuk dua noda warna yang berbeda. Noda ini merupakan jarak perpindahan zat terlarut. Pada sampel satu (kunyit) dihasilkan noda 1 dan noda 2 pada jarak 0.7, 1.15, 1.65, dan 2.15 cm sedangkan pada sampel yang kedua (kunyit) dihasilkan noda 1 dan 2 pada jarak 0.7, 1.2, 1.65 dan 2.7 cm. Pada sampel pandan diperoleh noda pada sampel satu yaitu pada jarak 1.7, 2, 2.1, 2.3, 2.6, da 2.8cm. pada sampel dua diperoleh jarak pada 1.8, 2.05, 2.2, 2.3, 2.7 dan 2.85 cm. Seharusnya jarak noda yang ditempuh pada sampel satu dan dua pada pigmen kunyit dan pandan adalah sama. Hal tersebut di sebabkan karena jumlah sampel yang ditotolkan tidak sama dan cara penotolan yang tidak sempurna sehingga baik pada kunyit maupun pada pandan betawi terdapat sampel yang ditotolkan terlalu polar sehingga menyebabkan jarak antara pandan dan kunyit tidak sama.
Berdasarkan data yang diperoleh dapat diketahui Rf dari masing-masing noda yang dihasilkan. Rf merupkan perbandingan antara jarak perpindahan zat dengan jarak perambatan larutan eluen.
Berdasarkan perhitungan dari data yang diperoleh didapatkan nilai Rf. berdasarkan persamaan Rf =
B A
dengan : A = jarak perpindahan sampel
B = jarak perambatan Eluen
Diperoleh Rf pada sampel kunyit dan pada pandan sebagai berikut
Sampel Rf Warna Kunyit 1 0,206 kuning 2 0,345 Coklat kuningan 3 0,485 Coklat kekuningan 4 0,639 Kuning muda Pandan 1 0,514 Hijau kuning 2 0,595 Hijau kuning ++* 3 0,632 Hijau kuning +++ 4 0,676 Hijau kebiruan 5 0,779 Hijau daun 6 0,831 Kelabu
Nilai Rf dan beberapa pigmen secara teoritis adalah sebagai berikut:
Pigmen Rf Warna dibawah cahaya biasa
Feofitin a 0.93 Kelabu
Feofitin b 0.80 Coklat kekuningan Klorofil a 0.60 Hijau biru Klorofil b 0.35 Hijau kuning
Feoforbida a 0.18 Kelabu
Feoforbida b 0.70 Coklat kuning Klorofida a 0.30 hijau biru Klorofida b 0.20 Hijau kuning
Berdasarkan tabel diatas dapat diketahui : 1. Kunyit
a. noda 1 dengan warna coklat kuning merupakan pigmen feoforbida b dengan nilai Rf teoritis 0,700 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,206
b. noda 2 dengan warna coklat kekuningan merupakan pigmen feofitin b dengan nilai Rf teoritis 0,800 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,345
c. noda 2 dengan warna coklat kekuningan merupakan pigmen feofitin b dengan nilai Rf teoritis 0,900 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,485
d. noda 2 dengan warna coklat kekuningan merupakan pigmen feofitin b dengan nilai Rf teoritis 0,950 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,639
2. Pandan
a. noda 1 dengan warna hijau kuning merupakan pigmen klorofil b dengan nilai Rf teoritis 0,350 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,514
b. noda 2 dengan warna Hijau kuning ++merupakan pigmen Klorofil b dengan nilai Rf teoritis 0,35 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,595
c. noda 3 dengan warna Hijau kuning +++ merupakan pigmen Klorofil b dengan nilai Rf teoritis 0,350 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,632
d. Noda 4 dengan warna hijau biru merupakan pigmen Klorofil a dengan nilai Rf teoritis 0,600 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,676.
e. noda 5 dengan warna kelabu merupakan pigmen feoforbida b dengan nilai Rf teoritis 0,930 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,779
f. noda 5 dengan warna kelabu merupakan pigmen feoforbida b dengan nilai Rf teoritis 0,960 dan berdasarkan percobaan nilai RF yang didapatkan adalah 0,831
G. SIMPULAN
1. Komposisi eluen yang tepat dengan metode cincin terkonsentrasi adalah perbandingan metanol dan diklorometan 7 : 3.
2. Nilai Rf dari zat warna pada Kunyit dengan menggunakan pelat KLT
adalah Rf1 = 0,206, Rf2 = 0,345, Rf2 = 0,485, dan Rf2 = 0,639. Sedangkan
nilai Rf pada Pandan dengan mengunakan KLT adalah Rf1 = 0,514, Rf2 =
0,595, Rf3 = 0,632, Rf4 = 0,676, Rf5 = 0,779 dan Rf5 = 0,77
H. TUGAS / JAWABAN PERTANYAAN
1. Apakah yang terjadi jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT terlalu polar atau kurang polar? Mengapa?
Jawab:
Jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT terlalu polar, maka seluruh noda yang ditotolkan pada pelat akan naik sampai batas atas pelat tanpa mengalami pemisahan. Sebaliknya, jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT kurang polar, maka noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak.
2. Apa fungsi kertas saring pada percobaan penentuan Rf?
Berfungsi untuk menjenuhkan gelas dengan uap pelarut setelah dibasahkan dengan uap dari campuran pelarut pengembang.
3. Mengapa permukaan pelat KLT tidak boleh rusak? Jawab:
Agar warna pada sampel dapat terpisah dengan baik.
4. Mengapa pelat KLT yang digunakan harus dikeringkan dulu dalam oven?
Jawab:
Agar pelat bebas dari molekul-molekul air yang terikat. Jumlah air yang terikat sangat berpengaruh pada pemisahan, karena air terikat sangat kuat pada adsorben sehingga menghambat terjadinya kesetimbangan dengan molekul-molekul analit
5. Mengapa batas atas dan batas bawah pelat harus diberi tanda dengan pensil?
Jawab:
Karena warnanya tidak dapat menyebar pada pelat, dan tidak mempengaruhi warna pada sampel yang diujikan. Namun jika menggunakan pulpen, maka tinta pulpen warnanya akan menyebar dan mempengaruhi warna pada sampel.
I. DAFTAR PUSTAKA
Sianita, Maria Monica. 2006. Kromatografi. Surabaya : Departemen Pendidikan Nasional, FMIPA, UNESA.
Soebagio, dkk. 1999. Kimia Analitik II. Malang : Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Negeri Malang.
