HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi IgY Anti Salmonella Enteritidis pada Telur Ayam
Antibodi spesifik terhadap S. Enteritidis pada serum ayam dan telur dideteksi dengan menggunakan uji agar gel presipitasi (AGP). Keberadaan antibodi spesifik terhadap S. Enteritidis ditandai dengan pembentukan garis presipitasi pada agar gel (Gambar 3).
Gambar 3 Hasil uji agar gel presipitasi IgY anti S. Enteritidis.
3a : Serum, 3b : Kuning telur. a : Antigen, b1-b6 : Antibodi c : Garis prepitasi.
Antibodi mulai terdeteksi minggu kelima dan tidak terdeteksi lagi pada minggu keenam setelah imunisasi pertama (Tabel 2). Setelah dilakukan pengulangan imunisasi (booster), satu minggu kemudian IgY di dalam serum terdeteksi lagi. Sedangkan IgY di dalam telur mulai terdeteksi dua minggu setelah
booster. IgY di dalam serum dan telur masih terdeteksi sampai minggu kedua
belas setelah imunisasi pertama.
Injeksi dosis pertama akan menghasilkan antibodi spesifik yang muncul di dalam serum, pemaparan pertama ini membangkitkan respon primer. Injeksi dengan sel-sel bakteri akan memunculkan reaksi antibodi sepuluh sampai empat belas hari pasca injeksi (Bellanti 1993). Beberapa faktor yang berpengaruh terhadap terbentuknya antibodi adalah imugenesitas, kualitas, bentuk dan
3a 3b a b1 b2 b3 b4 b5 b6 c a c b1 b2 b3 b4 b5 b6
kelarutan stimulan, species hewan yang diinjeksi, rute imunisasi dan sensifitas assay. Titer antibodi tertinggi terhadap toksoid bakteri gram positif bertahan selama dua sampai tiga bulan.
Aplikasi imunisasi secara intravena diharapkan dapat segera memicu pembentukan antibodi di dalam darah. Pengulangan imunisasi plus adjuvant secara intramuscular pada mingggu kedua, ketiga dan keempat diharapkan dapat merangsang pembentukan antibodi dalam jumlah yang banyak dan secara konsisten tetap terbentuk. Adjuvant berfungsi sebagai molekul protein pembawa antigen untuk membentuk komplek lebih besar sehingga menjadi lebih imugenik.
Adjuvant juga memperlambat pelepasan dan degradasi antigen (efek depot)
sehingga memberikan waktu yang cukup sistem imun untuk merespon antigen. Penggunaan adjuvant juga merangsang makrofag melalui aktivasi dan meningkatkan proses fagositosis dengan cara mempengaruhi limfosit melepaskan monokin ( Behn et al. 1996).
Tabel 2 Hasil uji AGP IgY pada serum dan telur ayam
Minggu Serum Telur
1 2 3 4 1 2 3 4 I* - - - - td td td td II* - - - - td td td td III* - - - - td td td td IV* - - - - td td td td V - + + + td td td td VI + - - - td td td td VII** + + + - - - - - VIII + + + + - - - - IX + + + + + + + + X + + + + + + + + XI + + + + + + + + XII + + + + + + + + Keterangan :
* : waktu imunisasi, ** : imunisasi ulang, td : tidak dilakukan koleksi telur
Ekstraksi, Purifikasi dan Karakterisasi IgY dari Kuning Telur
IgY anti S. Enteritidis dikoleksi dari kuning telur ayam yang menunjukkan reaksi positif pada uji AGP. Ekstraksi dari kuning telur bertujuan untuk memisahkan protein dari lemak telur. Metode ekstraksi yang dipilih adalah pemisahan kuning telur dengan menggunakan Poly Ethylene Glycol-Amonium sulfat (Polson et al. 1980). PEG digunakan untuk memisahkan lemak, mempresipitasi dan mengendapkan IgY agar tidak mempengaruhi tahap pemurnian berikutnya, misalnya dengan kromatografi penukar ion atau kromatografi afinitas (Harris dalam Mustopa 2004). Amonium sulfat sering digunakan untuk memisahkan protein dalam larutan. Protein dalam larutan akan membentuk ikatan hidrogen dengan air, ketika amonium sulfat ditambahkan ke dalam larutan tersebut, maka amonium sulfat akan menjadi kompetitor untuk berikatan dengan air. Hal ini menyebabkan rendahnya molekul air dari protein, menurunnya daya larut dan menyebabkan presipitasi protein (Harlow & Lane 1998).
Garam yang berlebih di dalam larutan ekstrak IgY dapat dihilangkan dengan cara dialisis. Dialisis IgY ditempatkan ke dalam kantung plastik (membran) semipermiabel yang direndam dalam larutan PBS pH 8 selama 24 jam pada suhu 4 oC. Molekul yang berukuran kecil akan keluar melalui membran dan molekul yang berukuran besar akan tertahan di membran dialisis. Selanjutnya, hasil ekstraksi IgY dipurifikasi secara kromatografi dengan teknik fase purification
liquid chromatografi (FPLC) menggunakan AKTA TM explorer 10S dengan kolom Hi Trap TM IgY Purification (Amersham pharmacia biotech) (Anonim 2006).
Fraksi yang ditampung dan digunakan untuk uji selanjutnya adalah fraksi dengan puncak tertinggi yaitu fraksi ke-3, ke-4 dan ke-5 (Gambar 4). Hasil purifikasi IgY dipekatkan dengan PEG 6000, kemudian didialisis dalam larutan PBS pH 8 selama 24 jam dengan tujuan menarik sisa-sisa garam yang mungkin tersisa. Setelah itu IgY diidentifikasi kandungan proteinnya menggunakan spektrofotometer UV dengan metode Bradford dan diperoleh hasilnya yaitu fraksi ke-3 sebesar 6.9 mg/ml, fraksi ke-4 sebesar 6.58 mg/ml dan fraksi ke-5 sebesar 5.01 mg/ml. Zhang (2003) menyatakan bahwa, dalam sebutir telur ayam mengandung 100 sampai 150 mg IgY,sedangkan Schade et al. (1996) melaporkan
dalam penelitian ECVAM, bahwa jumlah antibodi unggas dalam sebutir telur yaitu 50 sampai 100 mg/ml. Mustopa (2004), menyatakan bahwa konsentrasi IgY tertinggi dari Escherichia coli Enteropatogenik (EPEC) K1.1 yang dipurifikasi menggunakan teknik kromatografi pertukaran ion DEAE-Sephacel adalah sebesar 8.1 mg/ml. Perbedaan jumlah IgY yang dihasilkan dipengaruhi oleh metode ekstraksi yang digunakan.
Gambar 4 Kromatografi hasil FPLC IgY anti S. Enteritidis.
Untuk meyakinkan fraksi tersebut merupakan protein (IgY) yang diharapkan, dilanjutkan pengujian SDS-PAGE untuk menentukan berat molekul dari protein. Profil pita IgY hasil pemurnian menggunakan kromatografi (FPLC) yang dianalisis menggunakan SDS-PAGE dengan pewarnaan comassie blue disajikan pada Gambar 5. Metode SDS-PAGE digunakan untuk mendeteksi keberadaan protein dari larutan hasil purifikasi berdasarkan atas ukuran dari protein. SDS adalah detergen anionik yang mampu bereaksi dengan bagian hidrofobik dari protein . Dengan pemanasan maka seluruh bagian polipeptida akan terselimuti sehingga menjadi tidak bermuatan (Hames & Rickwood dalam Suartha 2006). Profil pita protein setelah pemurnian pada sumur ke-2 dan ke-3 (fraksi ke-3 dan fraksi ke-4 dari hasil FPLC) menunjukkan adanya pita protein dengan berat molekul 180 kDa merupakan protein IgY utuh. Tidak adanya pita protein yang
lain menandakan tidak adanya cemaran protein lain. Hal ini menunjukkan purifikasi dengan metode FPLC mendapatkan sampel protein (IgY) murni.
Verdoliva et al. (2000) menyatakan bahwa, kemurnian IgY dengan metode FPLC lebih tinggi dibandingkan dengan metode dialisis karena protein dipisahkan dengan spesifik berdasarkan ukuran protein, hidrofobisitas, afinitas dan muatan listrik. Beberapa peneliti juga melaporkan berat molekul dari IgY berkisar antara 160 kDa sampai 180 kDa (Zhang 2003), kadang-kadang pada SDS-PAGE didapatkan dua pita protein dengan berat molekul 70 kDa untuk rantai berat dan 21 kDa untuk rantai ringan (Hatta dalam Suartha 2006).
Gambar 5 Hasil SDS-PAGE IgY anti S. Enteritidis setelah pemurnian FPLC. 1: Marker umum (Bio-Rad), 2 : Marker IgY (Promega),
3-4 : hasil FPLC.
Aktifitas Biologis IgY sebagai Anti adhesi
Uji hambat adhesi menggunakan dosis IgY anti S. Enteritidis 100 µg/ml yang diinkubasikan pada sel epitel pipi (0.5 x 106 sel/ml), kemudian diinfeksikan dengan bakteri utuh S. Enteritidis (0.5 x 108 sel/ml). Sementara sebagai kontrol dilakukan uji adhesi (tanpa menggunakan IgY). Nilai adhesi kontrol adalah 61 sel bakteri/sel epitel pipi, sementara nilai anti adhesi adalah 35 sel bakteri/sel epitel
pipi (Gambar 6). Ini berarti IgY anti S. Enteritidis mempunyai kemampuan untuk menghambat perlekatan bakteri S. Enteritidis pada sel epitel pipi. Proses infeksi bakteri selalu diawali dengan proses adhesi. Adhesi merupakan tahap inisiasi dari proses kolonisasi. Ada tiga faktor yang mendukung perlekatan bakteri terhadap sel inang yaitu tropisme sel, spesifitas species dan spesifitas genetika. Disamping itu ada faktor non spesifik seperti ikatan kimia yang terbentuk antara komponen permukaan bakteri dan sel inang yang spontan secara termodinamika mempengaruhi proses perlekatan tersebut (Beachey dalam Mustopa 2004).
Nilai Adhesi Anti S.Enteritidis 61 35 0 10 20 30 40 50 60 70 Tanpa IgY 100 ụg
Perlakuan Dengan IgY
J u m lah S e l B a kt er i
Gambar 6 Nilai adhesi IgY anti S. Enteritidis.
Pada penelitian ini menunjukkan bahwa adanya adhesi S. Enteritidis pada permukaan sel epitel pipi dan bisa dilihat pada Gambar 7. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa, IgY mampu berikatan dengan antigen yang terdapat pada permukaan bakteri S. Enteritidis dan menyebabkan penurunan kemampuan adhesif bakteri tersebut ke permukaan sel epitel pipi. Burges dalam Mustopa (2004) menyatakan bahwa, immunoassay antibodi monoklonal lebih spesifik karena antibodi monoklonal biasanya diarahkan pada satu epitop dari antigen target. Antibodi terhadap toksin (antitoksin) bekerja dengan cara memblok bagian aktif toksin sehingga kemampuannya dalam menginfeksi sel-sel inang menjadi lemah. Hasil penelitian ini menunjukkan adanya peluang tentang penggunaan IgY dalam pencegahan diare akibat infeksi bakteri S. Enteritidis.
Gambar 7 Adhesi dan anti adhesi S. Enteritidis pada sel epitel pipi menggunakan pewarnaan Giemsa dengan mikroskop 1000x. a : adhesi , b : anti adhesi S. Enteritidis.
Fagositosis dan Peran IgY sebagai Opsonin
Preinkubasi bakteri S. Enteritidis dengan IgY selama 60 menit menyebabkan kapasitas fagositosis meningkat secara nyata. Dalam penelitian ini, perlakuan tanpa pemberian IgY diperoleh nilai aktifitas makrofag sebesar 34% dan kapasitas fagositosis sebesar 4.8 sel bakteri per sel epitel pipi. Sementara perlakuan dengan pemberian IgY diperoleh nilai aktifitas makrofag sebesar 56% dan kapasitas fagositosis sebesar 5.1 sel bakteri per sel epitel pipi (Gambar 8).
Nilai Aktifitas dan Kapasitas Fagositosis Anti S. Enteritidis 34 56 4,8 5,1 0 10 20 30 40 50 60 Tanpa IgY 100 ug
Perlakuan dengan IgY
Aktifitas Fagositosis (%) Kapasitas Fagositosis
Gambar 8 Nilai aktifitas dan kapasitas fagositosis anti S. Enteritidis.
Proses fagositosis secara garis besar dibagi dalam dua tahap, yaitu fase perlekatan dan fase ingesti. Selama fase perlekatan, terjadi sentuhan kuat oleh partikel dan fagositosis melalui proses tanpa dorongan. Fase ingesti merupakan proses penelanan partikel dan kemudian partikel dimasukkan ke dalam sitoplasma yang terinvaginasi (Kuby 1997). Adanya proses fagositosis S. Enteritidis oleh sel makrofag dapat dilihat pada Gambar 9.
Bila kepada bakteri tersebut diberikan antibodi spesifik terhadap kapsulnya yang tersusun oleh polisakarida, maka bakteri tersebut akan diselimuti sehingga dapat mempermudah fagositosis oleh sel fagosit (Kuby 1997). Semua jenis antibodi atau faktor-faktor serum lain, yang mampu membuat setiap selubung mikroorganisme maupun partikel sehingga lebih sensitif untuk difagositosis, dinamakan opsonin. Dan prosesnya dinamakan opsonisasi. Opsonisasi menyebabkan bakteri lebih dikenal oleh makrofag sehingga aktifitas fagositosis lebih besar.
Gambar 9 Respon fagositosis sel makrofag peritonium terhadap bakteri S. Enteritidis didalam sitoplasma sel fagosit terhadap banyak bakteri menggunakan pewarnaan Giemsa dengan mikroskop 1000x. a : tanpa IgY (kontrol) b : dengan penambahan IgY
