VI. TRANSFER GEN PENYANDI HORMON PERTUMBUHAN IKAN NILA (tiGH) PADA IKAN LELE (Clarias sp) DENGAN METODE ELEKTROPORASI
ABSTRAK
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui keberhasilan introduksi gen penyandi hormon pertumbuhan (Growth Hormone, GH) pada embrio ikan lele menggunakan metode elektroporasi. Gen GH dari ikan nila (tiGH) yang dikontrol oleh promoter beta-aktin (mBP) dari ikan medaka ditransfer dengan metode elektroporasi. Konsentrasi konstruksi gen mBP-tiGH yang ditransfer adalah 65 µg/ml dan 80 µg/ml. Parameter yang diamati meliputi derajat kelangsungan hidup embrio (DKHe), derajat penetasan (DP) dan persentase individu ikan lele yang membawa mBP-tiGH. DKHe dihitung sebelum telur menetas, sedangkan DP dihitung pada saat semua telur menetas. Identifikasi ikan yang membawa
mBP-tiGH ditentukan menggunakan metode PCR dengan primer spesifik untuk gen
tiGH. Hasil penelitian dengan menggunakan elektroporasi menunjukkan bahwa nilai DKHe dan DP antara kontrol (97,5% DKHe; 94% DP) dengan perlakuan elektroporasi relatif sama 98,5% untuk DKHe, dan 91,2% DP. Ikan lele yang membawa mBP-tiGH dengan metode elektroporasi yaitu 87% untuk konsentrasi DNA 65 µg/ml dan 93% untuk konsentrasi DNA 80 µg/ml. Kesimpulan adalah bahwa tiGH dapat ditransfer pada benih ikan lele dengan metode elektroporasi. Kata kunci : transfer gen, GH, PCR, ikan lele, elektroporasi.
IV. TRANSFER OF GENE ENCODING TILAPIA GROWTH HORMONE (tiGH) IN CATFISH (Clarias Sp) BY ELECTROPORATION METHOD
ABSTRACT
This study was conducted to determine of introducing gene encoding growth hormone (GH) in catfish embryos that can improve its growth rate. GH gene of Nile tilapia, driven by medaka β-actin promoter was transferred by electroporation method. Concentration of gene construction mBP-tiGH transferred is 65 µg/ml and 80 µg/ml. The observed parameter was survival rate of embryos (SRe), hatching rate (HR), and the percentage of catfish carrier gene mBP-tiGH. SRe was counted before hatching while HR was counted at the time the embryos hatching. To identify fish carrier of mBP-tiGH, used PCR ( Polymerase Chain Reaction) method with specific primer for tiGH gene. The research result used electroporation methods shows that between control (97.5% DKHe; 94% DP) and electroporation treatment was relatively similar at range of 98,5% for SRe and 91,2% for HR. The percentage of catfish carrying tiGH gene by electroporation method was 87% for concentration of 65 µg/ml and 93% for 80 µg/ml. Conclusion that tiGH could be transferred in fry catfish transgenic produced by electroporation methods.
PENDAHULUAN
Teknologi transgenesis merupakan suatu teknik rekayasa genetik dengan cara mengintroduksi gen yang khas pada ikan untuk mendapatkan keunikan yang memiliki nilai tambah. Teknologi transfer gen telah dikembangkan untuk memperbaiki karakter kuantitatif dan kualitatif. Gen dari individu suatu spesies diisolasi, dihubungkan ke promoter (sebagai sekuens pengatur DNA atau on/off switches), diklon dan diperbanyak terutama dalam plasmid (Dunham 2004). Teknik transfer gen yang dapat diaplikasikan pada ikan ada beberapa metode antara lain adalah mikroinjeksi, elektroporasi ada 2 cara yaitu elektroporasi pada embrio yang telah dibuahi dan elektroporasi pada sperma, penggunaan vektor retroviral atau infeksi retroviral, ballistic bombardment dan transfeksi, inkubasi sperma dengan DNA (Alimuddin et al. 2003, Hostetler et al. 2003, Dunham 2004,).
Metode mikroinjeksi telah sukses dilakukan untuk memproduksi ikan transgenik dan umumnya teknik ini yang digunakan. Tetapi teknik mikroinjeksi relatif sulit jika diterapkan untuk memproduksi ikan transgenik secara massal dalam jumlah yang besar. Metode ini tidak hanya membutuhkan waktu pengerjaan yang relatif lama dan biaya laboratorium yang tinggi tetapi juga sangat dibatasi oleh jumlah telur dan fisiologi telur ikan. Nukleus dari telur ikan sangat kecil dan sukar untuk dilihat tanpa bantuan alat, membran telur atau khorion akan mengeras segera setelah pembuahan, mudah pecah, buram dan sebagainya (Lanes et al. 2009). Oleh karena itu dibutuhkan metode lain sebagai alternatif dari berbagai macam problem dengan metode mikroinjeksi yaitu elektroporasi.
Metode elektroporasi membuat teknik transfer gen menjadi lebih efisien. Metode elektroporasi dapat diaplikasikan pada transfer gen ikan dengan dua cara yaitu elektroporasi pada embrio yang telah dibuahi (Inoue et al. 1990, Sheela et al. 1999) dan elektroporasi pada sperma (Symonds et al. 1994; Tsai 2000). Menurut Tsai (2000) aplikasi elektroporasi dengan perantara sperma pada ikan memiliki beberapa keuntungan antara lain yaitu : (1) Teknik ini merupakan teknik transfer gen secara masal, (2) Teknik ini mampu mengatasi beberapa kekurangan sistem transfer gen konvensional yang disebabkan karakter telur seperti warna yang kabur/buram, menempel, melayang, pronukleus yang tidak tampak, dan korion yang keras, (3) DNA asing harus ditransfer ke dalam nukleus, jika telur hasil fertilisasi dielektroporasi dengan DNA asing, fragmen DNA
memiliki kesempatan yang lebih besar untuk ditransfer ke dalam beberapa tempat selain blastodisk karena volumenya sangat kecil dalam telur hasil fertilisasi, (4) Sperma ikan mudah ditangani karena penambahan air secara sederhana mampu untuk mengaktifkan sperma, (5) Sperma dari hewan akuatik dapat dikriopreservasi sehingga sperma dapat selalu tersedia untuk digunakan. Oleh karena itu, sperma ikan dapat digunakan sebagai vektor dalam mengintroduksi DNA asing untuk memproduksi ikan transgenik.
Metode elektroporasi merupakan metode yang menggunakan serangkaian arus listrik pendek untuk melewati membran sel sehingga DNA rekombinan dapat masuk ke dalam sel. Metode elektroporasi digunakan karena efisien, sederhana, dan membutuhkan waktu yang relatif lebih cepat, serta dapat digunakan untuk memproduksi ikan secara bersamaan atau massal (Chen et al. 1996). Sperma digunakan sebagai media transfer gen, karena pengikatan gen secara optimal dapat dilakukan oleh sperma, sperma dalam keadaan motil dan konsentrasi DNA cukup tinggi, dengan menggunakan elektroporasi menunjukkan DNA asing dapat stabil di dalam sperma. Pada ikan lele Amerika (Ictalurus punctatus) telah dilakukan teknologi transfer gen dengan menggunakan metode elektroporasi dimana telur ditempatkan dalam larutan buffer yang mengandung DNA dan diberi kejutan listrik. Jumlah telur yang diletakkan berkisar antara 15 – 50 telur dalam larutan DNA dan hasilnya sukses serta lebih efisien dibandingkan dengan mikroinjeksi. Metode elektroporasi dapat lebih baik digunakan untuk transfer DNA dalam jumlah besar pada embrio ikan yang harus dilakukan pada waktu yang singkat. Pada ikan channel catfish dapat dilakukan elektroporasi sebanyak 15 – 100 telur setiap 4 detik (Dunham 2004). Selain itu Power et al. (1992) mengatakan bahwa metode elektroporasi lebih efisien daripada mikroinjeksi dimana kelangsungan hidup berkisar antara 30 – 100% dan dengan metode elektroporasi dapat memproduksi 10 sampai 100 kali lipat dibandingkan dengan mikroinjeksi. Oleh karena itu dalam penelitian ini akan dilakukan transfer gen mBP-tiGH yang disambungkan dengan promoter ß-aktin dari ikan medaka pada ikan lele (Clarias sp.) dengan menggunakan metode elektroporasi pada sperma.
BAHAN DAN METODE
Koleksi Gamet
Induk ikan lele dipilih dari kolam pemeliharaan di Loka Riset Pemuliaan dan Teknologi Budidaya Perikanan Air Tawar Sukamandi. Induk jantan dan betina yang digunakan adalah induk ikan lele yang mempunyai ukuran 500 – 1000 gram perekor. Induk diseleksi berdasarkan tingkat kematangan gonadnya. Induk ikan lele jantan dan betina dipilih yang matang gonad dan dilakukan penyuntikan ovaprim untuk mempercepat tingkat kematangan gonad. Induk betina yang telah matang gonad disuntik ovaprim dengan dosis 0,3 ml/kg bobot ikan, sedangkan induk jantannya menggunakan dosis 0,1 ml/kg bobot ikan. Setelah 8 jam dilakukan stripping pada induk betina untuk mendapatkan telur. Induk jantan dibedah untuk diambil spermanya dan sperma diencerkan dengan larutan fisiologis dengan perbandingan 1 : 1.
Perbanyakan Konstruksi Gen
Konstruksi gen berupa plasmid mBP-tiGH berisi gen GH ikan nila (Oreochromis niloticus) dengan promoter β-Aktin (mBP) dari ikan medaka (Oryzias latipes). Perbanyakan konstruksi gen dilakukan dengan menggunakan prosedur standar (Sambrook et al. 1989). Bakteri Eschericia coli yang mengandung konstruksi plasmid mBP-tiGH diperbanyak dengan metode kultur cair . Bakteri dipanen dan dikultur dalam media cair yang mengandung Triptone 1,6%, yeast extract 1%, NaCl 0,5%, dan antibiotik kanamisin, diinkubasi menggunakan shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37oC, selama 16-18 jam. Kemudian, bakteri hasil kultur dimasukkan ke dalam microtube 1,5 ml, disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang, pelet plasmid DNA yang terbentuk diisolasi dengan kit GF-1 Plasmid DNA extraction (Version 2.1) Vivantis (Lampiran 1). Konsentrasi larutan DNA awal dihitung dengan menggunakan GeneQuant, kemudian dibuat konsentrasi larutan DNA untuk transfer gen dengan metode elektroporasi sebesar 65 dan 80 µg/ml. Pada penelitian pendahuluan dengan menggunakan metode elektroporasi konstruksi gen yang digunakan ada dua yaitu mBP-GFP dan ccBP-GFP dimana kedua konstruksi gen tersebut dilakukan perbanyakan sesuai prosedur standar.
Elektroporasi Sperma
Elektroporasi sperma dilakukan dengan menggunakan mesin Gene Pulser Xcell (Biorad, USA). Sperma diencerkan dengan menggunakan larutan fisiologis (1 : 1) sebelum dicampur dengan plasmid. Untuk mendapatkan kondisi elektroporasi yang optimal maka dilakukan penelitian pendahuluan untuk mendapatkan kisaran kuat medan listrik yang mendukung motilitas dan kelangsungan hidup spermatozoa yang tinggi sehingga tetap memiliki kemampuan untuk membuahi sel telur. Kisaran kuat medan listrik yang digunakan ada tiga yaitu 125, 250 dan 375 V/cm dengan jumlah kejutan listrik 1, 3, 5 dan 7. Elektroporasi dilakukan dengan tipe kejutan square wave dengan kuat medan listrik ada tiga perlakuan dengan luas kuvet yang digunakan 0,2 cm, panjang kejutan (pulse length) 30 milidetik serta interval kejutan (pulse interval) 0,1 detik. Jumlah DNA yang dicampurkan ke dalam sperma dihitung berdasarkan konsentrasi awal DNA. Volume total dari larutan sperma tersebut dicampur dengan plasmid sebanyak 200 mikroliter. Larutan sperma yang telah dielektroporasi tersebut digunakan untuk membuahi telur sebanyak 200 – 300 butir.
Motilitas dan Kelangsungan Hidup Spermatozoa
Kualitas sperma hasil elektroporasi diukur dengan menentukan derajat motilitasnya. Satu tetes sperma diteteskan dengan menggunakan mikropipet diatas gelas objek kemudian ditutup dengan gelas penutup. Pada tepi gelas penutup diteteskan akuades lalu dilihat pergerakan spermatozoa setelah terkena air di bawah mikroskop dengan pembesaran 10X40. Penilaian motilitas didasarkan pada kriteria banyaknya sperma yang bergerak maju (progresif) dengan skor yang diberikan sesuai pergerakan sperma (Tabel 6).
Kuantitas sperma yang hidup setelah elektroporasi diamati melalui pewarnaan eosin. Sperma diteteskan di atas gelas objek dan ditambahkan eosin 2%, kemudian dicampur secara merata dan dibuat preparat ulas yang tipis. Preparat ulas dibiarkan kering udara kemudian dibilas dengan akuades. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10X40 dengan 3 bidang pandang. Spermatozoa yang hidup ditandai dengan kepala sperma yang
berwarna merah muda dan berbentuk bulat, sedangkan kepala sperma yang mati berwarna hitam dan berbentuk tidak beraturan (Gambar 9).
Tabel 5. Kriteria penilaian motilitas spermatozoa (Dewi 2010)
Kriteria Skor
> 70% spermatozoa bergerak cepat dengan arah maju dengan pergerakan ekor bervariasi
5,0 55-70% spermatozoa bergerak maju dan beberapa menunjukkan
gerakan cepat
4,0 40-55% spermatozoa bergerak maju dan beberapa menunjukkan
gerakan cepat
3,0
25-40% spermatozoa menunjukkan gerakan arah maju 2,0
10-25% spermatozoa menunjukkan gerakan arah maju 1,0
1-10% spermatozoa bergerak maju, kebanyakan spermatozoa tidak bergerak
0,5
Semua spermatozoa tidak bergerak 0,0
Gambar 15. Spermatozoa ikan lele yang diamati dengan pembesaran 10X40 , A = spermatozoa hidup, B = spermatozoa mati
Penetasan Telur dan Pemeliharaan Larva
Telur hasil elektroporasi dipindahkan dalam akuarium inkubasi berukuran 80 X 60 X 40 cm yang telah diberi biru metilena, kemudian diberi aerasi sedang. Wadah dilengkapi dengan heater agar temperatur air stabil pada suhu 28oC. Telur yang tidak dibuahi dan mengalami deformasi dapat dengan mudah dikenali, kemudian dibuang pada 4-5 jam setelah mikroinjeksi dan elektroporasi.
Telur-telur yang telah diinjeksi dan dielektroporasi akan menetas pada jam ke-24 setelah pembuahan.
Pemeliharaan larva dilakukan dengan pemberian pakan alami berupa
Artemia secara ad libitum yang dimulai pada hari ke-2 hingga ke-4. Pada hari ke-3 larva mulai diberi pakan alami cacing rambut yang dicacah hingga halus sampai larva ikan lele berumur 14 hari. Setelah itu larva ikan lele mulai diberi pakan buatan secara at satiation.
Identifikasi Individu Membawa Transgen
Individu ikan transgenik founder (F0) yang membawa gen GH diidentifikasi menggunakan metode PCR dengan cetakan DNA genomik yang telah diekstraksi dari sirip ekor pada saat baru menetas dan setelah berumur 12 minggu. Isolasi DNA genomik dilakukan menggunakan DNA Purification Kit
(Puregene, Minneapolis, USA). Prosedur yang digunakan adalah : sampel sirip ekor ikan lele dimasukkan ke dalam tabung mikro, ditambahkan 200 µl cell lysis solution, 2 µl Proteinase K (20 mg/ml) dan selanjutnya dihomogenasi menggunakan vorteks. Inkubasi dilakukan pada suhu 55oC selama semalam.
RNase sebanyak 2 µl (4 mg/ml) ditambahkan ke dalam larutan dan diaduk dengan hati-hati dengan cara membolak-balik tabung mikro. Larutan diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit dan disimpan dalam suhu 4oC selama 5 menit. Sebanyak 200 µl protein precipitation solution (Puregene, Minneapolis, USA) ditambahkan ke dalam larutan, diaduk perlahan, dan selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikro berisi isopropanol, lalu tabung mikro dibolak-balik sebanyak 50x dengan hati-hati dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 – 15 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 300 µl Etanol 70% dingin. Sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang dan pelet DNA dikering-udarakan. DNA yang diperoleh dilakukan pengecekan dengan melihat pita band pada DNA yang telah diekstraksi dengan elektroforesis pada gel agarose 0,8%. PCR dilakukan sesuai dengan prosedur sebelumnya pada bab III.
Analisis Data
Parameter yang diamati meliputi derajat kelangsungan hidup embrio (DKH-e), derajat penetasan (DP) dan persentase embrio mengekspresikan transgen (PEMG). Derajat kelangsungan hidup embrio adalah persentase jumlah embrio yang hidup dibandingkan jumlah embrio awal. Perhitungan dilakukan 20 jam setelah fertilisasi, dimana embrio belum menetas dengan rumus perhitungan sebagai berikut:
Derajat penetasan adalah persentase jumlah embrio yang menetas dibandingkan jumlah embrio awal. Perhitungan dilakukan ketika larva telah menetas secara keseluruhan dengan rumus perhitungan sebagai berikut :
Persentase individu mengekspresikan gen mBP-tiGH diperoleh dari perbandingan jumlah individu yang mengekspresikan gen mBP-tiGH dengan jumlah total individu yang hidup dan dilakukan analisis DNA. Perhitungan dilakukan setelah diperoleh individu benih ikan lele membawa gen mBP-tiGH
dengan rumus perhitungan sebagai berikut :
PIMG = Jumlah ikan yang membawa gen tiGH x 100%
HASIL DAN PEMBAHASAN
Motilitas dan Kelangsungan Hidup Spermatozoa Setelah Elektroporasi
Derajat motilitas dari sperma yang akan dipergunakan untuk membuahi telur ikan lele diamati di bawah mikroskop dan skor yang diberikan menggunakan kriteria penilaian motilitas spermatozoa setelah sperma dielektroporasi. Sedangkan kelangsungan hidup spermatozoa setelah dielektroporasi diamati di bawah mikroskop setelah sperma diwarnai dengan eosin. Untuk mendapatkan kondisi elektroporasi yang optimal pada sperma ikan lele, maka dilakukan uji pendahuluan untuk mendapatkan kuat medan listrik yang optimal. Hasil pengujian berbagai kondisi kuat medan listrik terhadap motilitas dan kelangsungan hidup spermatozoa dapat dilihat pada Tabel 6 dan 7.
Tabel 6. Motilitas dan kelangsungan hidup spermatozoa ikan lele setelah elektroporasi pada kondisi kuat medan listrik yang berbeda
Kuat medan listrik (V/cm) Indeks Motilitas (Skor) Kelangsungan hidup spermatozoa (%) Kontrol (0) 4 91,47 ± 2,82 250 4 88,51 ± 7,24 500 3 88,39 ± 5,27 750 2 55,49 ± 3,09 1000 1 32,03 ± 6,04 1250 0 0,00 ± 0,00
Tabel 7. Motilitas spermatozoa yang dielektroporasi pada beberapa tingkat kombinasi kuat medan listrik dan jumlah kejutan
Kuat medan listrik (V/cm)
Indeks Motilitas (Skor) Kelangsungan hidup spermatozoa Jumlah kejutan 1 Jumlah kejutan 3 Jumlah kejutan 1 Jumlah kejutan 3 Kontrol (0) 4 4 98,28 ± 2,12 96,70 ± 1,27 250 4 4 90,29 ± 1,82 92,45 ± 2,62 500 3 3 90,89 ± 3,35 74,85 ± 2,16 750 2 0,5 55,48 ± 3,94 59,65 ± 3,67 1000 1 0 32,03 ± 6,24 0,00 ± 0,00 1250 0 0 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Berdasarkan hasil penelitian pendahuluan, perlakuan elektroporasi dengan jumlah kejutan 3 dan kuat medan listrik 250 V/cm memberikan hasil kelangsungan hidup spermatozoa yang tertinggi yaitu 92,45 ± 2,62 dan indeks
motilitas dengan skor 4. Selanjutnya dilakukan penelitian dengan menggunakan konstruksi gen ccBP-GFP dan mBP-GFP dengan menggunakan jumlah kejutan sebesar 3 dan kuat medan listrik dari 125 V/cm, 250 V/cm dan 375 V/cm. Hasil pengujian berbagai kondisi kuat medan listrik terhadap indeks motilitas antara konstruksi gen ccBP-GFP dan mBP-GFP terdapat hasil yang optimal pada kuat medan listrik 125 V/cm dengan hasil indeks motilitas 4 (Tabel 8). Dari hasil penelitian tersebut kemudian dilakukan pengujian dengan kuat medan listrik 125 V/cm dengan jumlah kejutan yang berbeda yaitu 3, 5 dan 7, diperoleh hasil yang terbaik untuk konstruksi gen ccBP-EGFP dan mBA-GFP adalah 5 (Tabel 9). Tabel 8. Motilitas spermatozoa ikan lele yang dielektroporasi pada beberapa
tingkat kuat medan listrik dengan jumlah kejutan 3 Kuat medan listrik
(V/cm)
Indeks motilitas (skor)
ccBP-GFP mBP-GFP Kontrol 125 250 375 4 4 4 3 4 4 4 3
Ket : ccBP-GFP = cyprinus carpio ß-Actin- Green Fluorescent Protein, mBP-GFP = medaka ß- Actin- Green Fluorescent Protein
Tabel 9. Motilitas spermatozoa ikan lele yang dielektroporasi pada tingkat kuat medan listrik 125 V/cm dengan beberapa jumlah kejutan
Jumlah kejutan listrik
Indeks motilitas (skor)
Kontrol ccBP-GFP mBP-GFP 3 5 7 4 4 4 4 4 3 4 4 3
Ket : ccBA-GFP = cyprinus carpio Beta Actin- Green Fluorescent Protein, mBP-GFP = medaka Beta Actin- Green Fluorescent Protein
Sperma yang dielektroporasi pada kuat medan listrik 125 V/cm dengan perlakuan jumlah kejutan listrik 3, 5 dan 7 mempunyai motilitas yang tidak berbeda antara jumlah kejutan 3 dan 5, sedangkan pada jumlah kejutan 7 mempunyai motilitas lebih rendah dari 3 dan 5. Selanjutnya untuk mengetahui derajat pembuahan dan derajat penetasan sperma yang telah dielektroporasi dilakukan proses pembuahan dari sperma yang telah diberi perlakuan jumlah kejutan 3 dan kuat medan listrik ada empat perlakuan (0, 125, 250 dan 375 V/cm). Hasil pengujian berbagai kondisi kuat medan listrik terhadap derajat pembuahan dan derajat penetasan telur antara konstruksi gen ccBP-GFP dan mBP-GFP dapat dilihat pada Gambar 16 dan 17.
Derajat pembuahan (%)
0 20 40 60 80 100 120 140 0 125 250 375 mB A c c B A
Kuat medan listrik (V/cm)
Gambar 16. Derajat pembuahan telur ikan lele yang dibuahi oleh spermatozoa yang dielektroporasi pada beberapa tingkat kombinasi kuat medan listrik. Derajat penetasan (%) 0 20 40 60 80 100 120 0 125 250 375 mB A c c B A
Kuat medan listrik (V/cm)
Gambar 17. Derajat penetasan telur ikan lele yang dibuahi oleh spermatozoa yang dielektroporasi pada beberapa tingkat kombinasi kuat medan listrik.
Pada penelitian ini sperma ikan lele yang telah dilakukan perlakuan elektroporasi masih memiliki kemampuan untuk membuahi telur. Nilai derajat pembuahan yang tertinggi diperoleh pada perlakuan 125 V/cm untuk konstruksi gen mBP-GFP dan pada perlakuan 250 V/cm untuk konstruksi gen ccBP-GFP. Sedangkan nilai derajat penetasan yang tertinggi diperoleh pada perlakuan 125 V/cm untuk konstruksi gen mBP-GFP dan ccBP-GFP. Telur yang telah dibuahi oleh sperma yang dielektroporasi pada 125 V/cm dengan jumlah kejutan 5 kali menunjukkan derajat pembuahan dan derajat penetasan yang terbaik. Berdasarkan hasil penelitian pendahuluan tersebut dapat diperoleh kondisi elektroporasi yang optimal yang akan dipergunakan untuk mentransfer gen
mBP-tiGH dengan metode elektroporasi. Kondisi elektroporasi yang optimal untuk transfer gen mBP-tiGH yaitu kuat medan listrik 125 V/cm, panjang kejutan (pulse
mBP ccBP
ccBP mBP
length) 30 milidetik, jumlah kejutan (number of pulse) 5 kali serta interval kejutan (pulse interval) 0,1 detik.
Selanjutnya dilakukan transfer gen mBP-tiGH dengan kondisi elektroporasi berdasarkan penelitian pendahuluan. Larva yang telah diperoleh dari hasil transfer gen dengan metode elektroporasi dilakukan pengamatan tentang derajat kelangsungan hidup embrio (DKHe), derajat penetasan (DP) telur ikan lele dan persentase ikan lele yang membawa gen mBP-tiGH.
Pada metode transfer gen dengan menggunakan metoda elektroporasi derajat kelangsungan hidup embrio dan derajat penetasan antara embrio yang dilakukan pembuahan dengan sperma yang mengalami perlakuan elektroporasi relatif sama dibandingkan dengan kontrol (Tabel 10). Hal ini sesuai dengan pernyataan dalam Power et al. (1992) bahwa metode elektroporasi lebih efisien daripada mikroinjeksi dimana kelangsungan hidup berkisar antara 30 – 100% dan dengan metode elektroporasi dapat memproduksi 10 sampai 100 kali lipat dibandingkan dengan mikroinjeksi. Selain itu dengan menggunakan metode elektroporasi dimana sperma digunakan sebagai media pembawa gen sehingga pada saat melakukan proses pembuahan tidak berpengaruh terhadap kelangsungan hidup embrio. Berdasarkan hasil penelitian ini transfer gen
mBP-tiGH dengan menggunakan metode elektroporasi melalui sperma lebih efektif untuk memproduksi ikan lele transgenik dibandingkan dengan menggunakan metode mikroinjeksi (Gambar 18 dan 19).
Tabel 10 . Derajat kelangsungan hidup embrio (DKHe), derajat penetasan (DP) dan persentase ikan lele yang membawa gen mBP-tiGH (PIMG) dengan metode elektroporasi
Perlakuan ∑ telur (butir) DKHe (%) DP (%) PIMG (%) Kontrol Elektroporasi-1 Elektroporasi-2 300 300 300 97,5 98,5 97,3 94,0 91,2 81,6 0 87 93
Smitherman et al. (1996) telah melakukan transfer gen pada Ictalurus punctatus dan Clarias gariepinus dengan menggunakan metode mikroinjeksi dan elektroporasi, hasilnya gen asing tersebut telah diekspresikan dan diturunkan dimana transgenik Ictalurus punctatus mengandung gen GH salmon dan pertumbuhannya 20 – 40% lebih cepat dibandingkan dengan kontrol. Power
(1992) mengatakan bahwa metode elektroporasi lebih efisien daripada mikroinjeksi dimana kelangsungan hidup berkisar antara 30 – 100%. Metode elektroporasi dapat lebih baik digunakan untuk transfer DNA dalam jumlah besar pada embrio ikan yang harus dilakukan pada waktu yang singkat. Pada ikan
catfish dapat dilakukan elektroporasi sebanyak 15 – 100 telur setiap 4 detik. M K1 K2 P1-1 P1-2 P2-1 P2-2
◄ 250 bp
Gambar 18. Deteksi insersi gen mBP-tiGH pada larva ikan lele yang baru menetas dengan metode elektroporasi. M merupakan Marker DNA 100 kb, K2 adalah kontrol negatif ulangan 1, K1 adalah kontrol negatif ulangan 2, P1-2 adalah konsentrasi 60 µg/ml ulangan 1, P1-1 adalah konsentrasi 60 µg/ml ulangan 2, P2-1 adalah konsentrasi 80 µg/ml ulangan 1 P2-2 adalah konsentrasi 80 µg/ml ulangan 2 hasil amplifikasi PCR larva ikan lele yang baru menetas. Aplikasi kejutan listrik pada suspensi sel menginduksi polarisasi komponen membran sel dan mengembangkan potensi tegangan di seluruh permukaan membran. Pada saat perbedaan potensil antara bagian dalam dan luar membran sel melewati titik kritis, komponen membran direorganisasi ke dalam pori dalam area terlokalisasi, dan kemudian sel menjadi permeabel terhadap masuknya makromolekul (Knight,1981; Knight & Scrutton, 1986). Ukuran pori dapat diubah melalui berbagai panjang kejutan (dalam milidetik), kuat medan listrik (dalam Volts/sentimeter), dan kekuatan ionik media (Tsong, 1983). Berdasarkan penelitian Cheng et al. (2002), motilitas sperma ikan ayu menurun sampai 50% setelah 120 detik ketika dikejut dengan voltase 9 kV. Symonds et al. (1994) mendemontrasikan bahwa aktivitas sperma chinook salmon menurun dari 82% menjadi 2% pada saat sperma dielektroporasi dengan kuat medan listrik yang meningkat dari 625 V/cm menjadi 1000 V/cm.
◄
250 bp◄
250 bp◄
250 bp◄
250 bpGambar 19. Deteksi insersi gen mBP-tiGH pada benih ikan lele umur 90 hari dengan metode elektroporasi. M merupakan Marker DNA 100 kb, P1.1- P1.15 adalah sampel individu hasil amplifikasi PCR benih ikan lele dengan perlakuan konsentrasi DNA 65 µg/ml, P2.1- P2.15 adalah sampel individu hasil amplifikasi PCR benih ikan lele ikan dengan perlakuan konsentrasi DNA 80 µg/ml, K+ adalah kontrol positif dengan plasmid mBP-tiGH dan K- adalah kontrol negative tanpa cetakan DNA.
Pada umur 30 hari jumlah benih yang diperoleh dari hasil transfer gen dengan metode elektroporasi dilakukan pengukuran pertumbuhan panjang dan berat secara individu. Distribusi pertumbuhan berat benih ikan lele berumur 30 hari antara perlakuan tidak berbeda (Gambar 20).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0-0,5 0,6-1,0 1,1-1,5 1,6-2 2,1-3
Berat benih (gram)
J u m la h i n d iv id u ( e k o r) Ulangan 1 Ulangan 2 (a) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0-0,5 0,6-1,0 1,1-1,5 1,6-2 2,1-3
Berat benih (gram)
J u m la h i n d iv id u ( e k o r) Ulangan 1 Ulangan 2 (b) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0-0,5 0,6-1,0 1,1-1,5 1,6-2 2,1-3
Berat benih (gram)
J u m la h i n d iv id u ( e k o r) Ulangan 1 Ulangan 2 ( c)
Gambar 20. Distribusi berat individu benih ikan lele umur 30 hari hasil introduksi gen mBP-tiGH dengan konsentrasi yang berbeda, (a) = 60 µg/ml, (b) = 80 µg/ml dan (c ) = kontrol.
Penelitian Sin et al. (2000) pada sperma salmon menunjukkan bahwa kondisi elektroporasi optimal pada sperma salmon adalah pada kuat medan listrik 800 sampai 1000 V/cm, lama waktu kejutan 27,4 msec dan 2 kejutan. Motilitas sperma pasca elektroporasi bergantung pada voltase, panjang kejutan, jumlah kejutan dan kekuatan ionik buffer (Symonds et al. 1994). Menurut Lanes et al. (2009), jika sperma diinkubasi oleh DNA eksogen tetapi tidak dielektroporasi, efisiensi Sperm Mediated Gene Transfer (SMGT) untuk produksi ikan trangenik rendah atau bahkan tidak ada. Hasil penelitian Zhong et al. (2002) pada ikan koan menunjukkan bahwa sperma ikan koan yang dicampur dengan plasmid pCAhLFc dan diinkubasi selama 10 – 30 menit dan dicampurkan ke telur untuk fertilisasi buatan, memiliki efisiensi transfer gen antara 2,2 – 4,3%. Adapun tingkat keberhasilan transfer gen diantara benih yang diperoleh dari telur yang difertilisasi oleh sperma yang dielektroporasi yaitu antara 19,6 – 46,8%. Pada sperma ikan zebra (Danio rerio) yang diinkubasi dengan DNA asing memiliki kapasitas untuk mengambil DNA asing. Pengambilan/pemasukan DNA asing dapat ditingkatkan melalui elektroporasi. Peningkatan DNA asing oleh spermatozoa ikan zebra meningkat 1 – 2 kali lipat setelah dielektroporasi dengan kuat medan listrik 500, 1000, dan 1500 V/cm. Peningkatan kuat medan listrik menyebabkan penurunan motilitas sperma, bahkan pada kuat medan listrik yang tinggi menyebabkan sperma menggumpal (Patil & Khoo, 1996).
KESIMPULAN
Transfer gen pada ikan lele dapat dilakukan dengan menggunakan metode elektroporasi. Metode elektroporasi lebih efektif dalam proses transfer gen penyandi hormon pertumbuhan pada ikan lele.
