PAPER REKAYASA GENETIKA TRANSFORMASI
OLEH:
EGI NURYADIN P2BA12005
TIA AGUSTRIANI MAESYAROH P2BA12009
WAHYUNI SETYANINGSIH P2BA12014
KHUSNUL P2BA12020
MARSAHIP P2BA12024
PROGRAM PASCASARJANA ILMU BIOLOGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO 2013
TRANSFORMASI
Teknologi transfer gen dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak langsung (Herman, 1996). Contoh transfer gen secara langsung adalah penembakan eksplan gen dengan gene gun atau divortex dengan silicon carbide (karbid silikon) dan perlakuan pada protoplas tanaman dengan elektroporasi atau dengan polyethylene glycol (PEG). Sedangkan transfer gen secara tidak langsung adalah melalui vector Agrobacterium.
1. Transfer gen secara langsung
A. Penembakan partikel (particle bombardment)
Teknik paling modern dalam transformasi tanaman adalah penggunaan metode penembakan partikel atau gene gun. Metode transfer gen ini dioperasikan secara fisik dengan menembakkan partikel DNA-coated langsung ke selatau jaringan tanaman (Klein et al., 1988). Dengan cara demikian, partikel dan DNA yang ditambahkan menembus dinding sel dan membran, kemudian DNA melarut dan tersebar dalam sel secara independen. Telah didemonstrasikan bahwa teknik ini efektif untuk mentransfer gen pada bermacam-macam eksplan.
Penggunaan penembakan partikel membuka peluang dan kemungkinan lebih mudah dalam memproduksi tanaman transgenik dari berbagai spesies yang sebelumnya sukar ditransformasi dengan Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil seperti padi, jagung, dan turfgrass.
B. Karbid silicon
Metode transfer gen lain yang kurang umum digunakan dalam transformasi tanaman tetapi telah dilaporkan berhasil mentransformasi jagung dan turfgraas adalah penggunaan karbit silikon. Suspensi sel tanaman yang akan ditransformasi dicampur dengan serat karbid silikon dan DNA plasmid dari gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf kemudian dilakukan pencampuran dan pemutaran dengan vortex (Kaeppler et al., 1990). Serat silicon carbide berfungsi sebagai jarum injeksi mikro (microinjection) untuk memudahkan transfer DNA ke dalam sel tanaman.
Metode transfer DNA yang umum digunakan pada tanaman monokotil adalah elektroporasi dari protoplas, perlakuan polyethylene glycol (PEG) pada protoplas dan kombinasi antara dua perlakuan tersebut (Joersbo dan Brunstedt, 1991). PEG memudahkan presipitasi DNA dan membuat kontak lebih baik dengan protoplas, juga melindungi DNA plasmid mengalami degradasi dari enzim nuclease (Mass dan Werr, 1989). Sedangkan elektroporasi dengan perlakuan listrik voltase tinggi menyebabkan permiabilitas tinggi untuk sementara pada membran sel dengan membentuk pori-pori sehingga DNA mudah penetrasi ke dalam protoplas. Integritas membran kembali membaik seperti semula dalam beberapa detik sampai semenit setelah perlakuan listrik. Jagung dan padi telah berhasil ditransformasi melalui elektroporasi dengan efisiensi antara 0,1-1%. Kelemahan penggunaan protoplas sebagai explant untuk transformasi adalah sulitnya regenerasi dari protoplas, dan ekstra komplikasi, serta variasi somaklonal akibat panjangnya periode kultur. 2. Transfer gen secara tidak langsung
Dari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui media vektor Agrobacterium tumefaciens paling sering digunakan untuk mentransformasi tanaman dikotil. A. tumefaciens mampu mentransfer gen ke dalam genom tanaman melalui eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf discs) atau bagian lain dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi beregenerasi tinggi (Hinchee et al., 1988; Mullins et al., 1990). Gen yang ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing). Segmen spesifik DNA plasmid Ti disebut DNA T (transfer DNA) yang berpindah dari bakteri ke inti sel tanaman dan berintegrasi ke dalam genom tanaman. Karena A. tumefaciens merupakan patogen tanaman maka Agrobacterium sebagai vektor yang digunakan untuk transformasi tanaman adalah bakteri dari jenis plasmid Ti yang dilucuti virulen-sinya (disarmed), sehingga sel tanaman yang ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang mampu beregenerasi akan membentuk suatu tanaman sehat hasil rekayasa genetik. Tanaman tersebut akan menurunkan DNA T yang disarmed dan gen asing (dari sifat yang diinginkan) ke keturunannya. Teknik transformasi melalui media vector Agrobacterium pada tanaman dikotil telah berhasil tetapi sebaliknya tidak
umum digunakan pada tanaman monokotil. Meskipun demikian, beberapa peneliti melaporkan bahwa beberapa strain Agrobacterium berhasil mentransformasi tanaman monokotil seperti jagung dan padi. Transformasi menggunakan Agrobacterum lebih banyak digunakan daripada menggunakan penembak biolistik karena penggunaan Agrobacterium menghasilkan proporsi yang lebih besar transgen terekspresi dengan jumlah lokus yang lebih rendah (Ishida et al., 1996; Zhao et al., 1998).
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri tanah gram positif yang bersifat fitopatogen pada tanaman dikotil. Bakteri ini secara alami mempunyai kemampuan untuk mentransfer potongan DNA atau disebut T-DNA (transfer T-DNA) ke dalam genom tanaman dan menyebabkan terbentuknya tumor (crown gall). Tumor ini merupakan sumber makanan atau sebagai sumber karbon bagi Agrobacterium (Rajesh et al. 2008).
Terdapat tiga komponen genetik penting terlibat dalam proses pembentukan tumor (Tzfira et al. 2004). Pertama, gen virulen kromosom (chromosomal virulence), yang terdapat pada kromosom Agrobacterium dan berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman. Kedua, sekelompok gen virulen (vir) yang terdapat dalam plasmid Ti (Tumor inducing), berukuran 200 kb yang berperan dalam menginduksi transfer dan integrasi DNA. Ketiga, daerah DNA yang juga terletak pada plasmid Ti (Daerah T-DNA, dibatasi oleh LB (left border) dan RB (right border), mengandung gen penting bagi Agrobacterium (Matthews et al. 2001, Zhou et al. 2003, Sha et al. 2004). Daerah T-DNA mengandung gen iaaH, iaaM, dan ipt yang menyandikan enzim-enzim penting dalam biosintesis auksin dan sitokinin, yaitu zat penting untuk pembelahan sel sehingga terjadi pembelahan sel yang tidak terkontrol dan menyebabkan terbentuknya tumor (Rajesh et al. 2008).
Efisiensi transformasi menggunakan Agrobacterum dipengaruhi oleh strain Agrobacterium. Perbedaan antar-strain Agrobacteium ditentukan oleh tipe kromosom dan tipe Ti-plasmid. Tipe kromosom dalam sel bakteri Agrobacterum a.l. terdiri dari octopine, nopaline, dan chrysopine; sedangkan tipe Ti-plasmid a.l. terdiri dari octopine, nopaline, chrysopine, dan succcinamopine. Grant et al. (2003) melaporkan bahwa strain KYRT1 tiga kali lebih efisien daripada AGL1 dalam transformasi kacang kapri.
METODE
Bahan utama yang perlu disediakan yaitu bakteri Escherichia coli DH5α (E. coli DH5α) mengandung gen cry1Ab pada plasmid Psbb A. tumefaciens EHA105 pembawa p Cambia130.
DNA plasmid diisolasi dari kedua bakteri tersebut dengan metode lisis alkali (Sambrook et al., 1989 dalam Listanto et al, 2010).
Kualitas dan kuantitasnya dicek dengan elektrofloresis pada gel agarose 0,8% dan dianalisis dengan program QuantityOne™ (Biorad).
Gen cry1Ab diisolasi dengan memotong plasmid pSBB dengan enzim restriksi HindIII.
Hasil potongan dipisahkan dengan agarose elektroforesis.
DNA gen cry1Ab diisolasi dari gel agarose dengan metode Freeze ‘N Spin (Biorad).
Plasmid pCambia1301 dipotong dengan enzim restriksi HindIII serta dihilangkan gugus fosfatnya dengan metode defosforilasi menggunakan alkaline phos-phatase.
Fragmen pCambia yang telah terdefosforilasi diligasi dengan gen cry1Ab menggunakan enzim ligase.
Hasil ligasi ditransformasi ke dalam E. coli dan A. tumefaciens.
Transformasi ke dalam E. coli menggunakan metode kejutan panas (Sambrook et al. 1989 dalam Listanto et al, 2010), sedangkan transformasi ke dalam A. tumefaciens dilakukan dengan metode kejutan dingin (An et al. 1988 dalam Listanto et al, 2010) atau tri-parental mating.
Hasil transformasi ditumbuhkan pada media yang mengandung kanamisin 50 mg/l.
Gambar 1. Proses infeksi alami dari Agrobacterium tumefaciens. Sel berwarna coklat adalah sel Agrobacterium dan warna hijau adalah sel tanaman. Senyawa induser yang dikeluarkan tanaman saat luka akan mengaktifkan gen vir A dan G untuk selanjutnya mengaktifkan gen-gen vir lainnya sehingga proses transfer daerah T-DNA dari Agrobacterium ke dalam sel tanaman terjadi. (sumber: http://www.rasmusfrandsen.dk/atmt. htm).
DAFTAR PUSTAKA
Grant, J.E., L.M.J. Thomson, M.D.Pither-Joyce, T.M. Dale, and P.A. Cooper. 2003. Influence of Agrobacterum tumefaciens strain on the production of transgenic peas (Pisum sativum L.). Plant Cell Rep. 21:1207-1210.
Herman M 2010. Aplikasi teknik rekayasa genetik dalam perbaikan sumber daya genetik tanaman untuk ketahanan cekaman biotik. Bul Plasma Nutfah Vol 16(1):172.
Hinchee, M.A.W., D.V. Connor-Ward, C.A. Newell, R.E. MC. Donell, S.J. Sato, C.S. Gasser, D.A. Fischoff, D.B. Re, R.T. Fraley, and R.B. Horsch. 1988. Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium mediated DNA transfer. Bio/Tech. 6:915-922.
Ishida, Y., H. Saito, S. Ohta, Y. Hiei, T. Komari, T. Kumashiro. 1996. High efficiency transformation of maize (Zea Mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnol 14: 745-750.
Joersbo, M. and J. Brunstedt. 1991. Electroporation mechanism and transient expression, stable transformation and biological effects in protoplast. Physiologia Plantarum 81:256-264.
Klein, T.M., M. Fromm, A. Weissinger, D. Tomes, S. Scahaa, M. Sletten, and J. Sanford. 1988. Transformation of maize cells using hign velocity microprojectile. Proc. Natl. Aca. Sci. USA. 85:4305-4309.
Listanto E, Habib R, Liberty, Tri J. Santoso, Saptowo J. Pardal, Ida H. Somantri, Altosar, dan M. Herman. 2010. Konstruksi dan Kloning Plasmid pCambia1301 dengan Gen Cry1Ab. Prosiding
Mass, C. and W. Werr. 1989. Mechanism and optimized conditions for PEG mediated DNA transfection into plant protoplast. Plant Cell Rept. 8:148-151.
Matthews PR. Ming-Bo W, Waterhouse PM, Thornton S, Fieg SJ, Gubler F, Jacobsen JV. 2001. Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transformation with adjacent "twin T-DNAs" on a standard Agrobacterium transformation vector. Mol Breed 7:195-202
Mullins, M.G, F.C. Tang, and O. Facciotti. 1990. Agrobacterium mediated genetic transformation of grape vines: transgenic plants of Vitis rupestris Schwwlw and buds of Vitis vinefera L. Bio/Tech. 8:1041- 1045.
Rajesh S, Krishnaveni S, Sudhakar D, Raveendran M, Sivakumar P, Gnanam R, Manickam A. 2008. Agrobacterium-mediated transformation on indica rice (Oryza sativa L.), IR64 with mungbean LEA protein gene for water-stress tolerance. Am J Plant Physiol 3(3):101-110
Sha Y, Li S, Pei Z, Luo L, Tian Y, He C. 2004. Generation and flanking sequence analysis of a rice T-DNA tagged population. Theor Appl Genet 108:306-314 Tzfira T, Li JX, Lacroix B, Citovsky V. 2004. Agrobacterium T-DNA integration:
molecules and models. Trends Genet 20:375-383.
Zhao, Z.Y., W. Gu, T. Cai, L.A. Tagliani, D.A. Hondred, D. Bond, S. Krell, M.L. Rudert, W.B. Bruce, D.A. Pierce. 1998. Molecular analysis of T0 plants transformed by Agrobacterium and comparison of Agrobacterium-mediated transformation with bombardment transformation in maize. Maize Genet. Coop. Newslett. 72: 34-37.
Zhou HY, et al. 2003. Generating marker-free transgenic tobacco by Agrobacterium-mediated transformation with double T-DNA binary vector. Acta Bot Sin 45:1103-1108
