2.1 Ikan Nila (Oreochromis niloticus)
Ikan nila (Oreochromis niloticus) merupakan jenis ikan yang diintroduksi dari luar negeri, ikan tersebut berasal dari Afrika bagian timur di Sungai Nil, Danau Tangayika, Chad, Nigeria dan Kenya, lalu dibawa oleh orang ke Eropa, Amerika, negara-negara Timur Tengah dan Asia. Benih ikan nila di Indonesia secara resmi didatangkan dari Taiwan oleh Balai Penelitian Perikanan Air Tawar tahun 1969 (Suyanto 2003). Habitat ikan nila adalah di aliran sungai dan danau. Ukuran maksimalnya adalah 60 cm. Ikan nila diklasifikasikan menurut Saanin (1984) sebagai berikut :
Filum : Chordata
Sub Filum : Vertebrata
Kelas : Osteichthyes
Sub Kelas : Acanthoptherigii
Ordo : Perchomorphi
Sub Ordo : Percoidea
Famili : Cichlidae
Genus : Oreochromis
Spesies : Oreochromis niloticus
Gambar 1 Ikan nila (Oreochromis niloticus) (Lim dan Webster 2006).
Ikan nila memiliki ciri morfologi, seperti berjari-jari keras, sirip perut torasik, letak mulut subterminal dan berbentuk meruncing. Selain itu, tanda lainnya yang dapat dilihat dari ikan nila adalah warna tubuhnya hitam dan agak keputihan. Bagian bawah tutup insang berwarna putih, sedangkan pada nila lokal, putih agak kehitaman bahkan ada yang kuning. Sisik ikan nila besar, kasar dan tersusun rapi. Sepertiga sisik belakang menutupi sisi bagian depan. Tubuhnya memiliki garis linea lateris yang terputus antara bagian atas dan bawahnya. Linea lateralis bagian atas memanjang mulai dari tutup insang hingga belakang sirip punggung sampai pangkal sirip ekor. Ukuran kepalanya relatif kecil dengan mulut berada di ujung kepala serta mempunyai mata yang besar (Kottelat et al. 1993).
2.2 Fermentasi Ikan
Fermentasi ikan adalah teknologi tradisional yang digunakan untuk mengawetkan biota air tawar dan laut, yang sangat mudah membusuk, terlokalisasi dalam produksi, dan fluktuatif per musimnya dalam penangkapannya (Campbell-Platt 2009). Fermentasi ikan merupakan salah satu metode penerapan proses fermentasi pada produk perikanan. Fermentasi adalah proses yang mikroorganisme seperti bakteri lakukan untuk mengubah substansi di dalam ikan, seperti gula menjadi alkohol dan asam (contohnya asam laktat) dan memproduksi substansi rasa seperti ester atau keton. Normalnya, fermentasi terjadi tanpa keberadaan oksigen. Tujuan fermentasi ikan itu sendiri antara lain mengawetkan ikan, membuat substansi rasa baru, atau mengubah tekstur (Mouritsen dan Mouritsen 2009).
Fermentasi yang terjadi pada produk ikan hasil fermentasi antara lain adalah fermentasi asam laktat. Fermentasi asam laktat dapat terjadi sebagai akibat aktivitas bakteri asam laktat yang dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu bakteri asam laktat homofermentatif dan heterofermentatif. Proses fermentasi dikatakan bersifat homofermentatif jika hanya menghasilkan satu jenis komponen saja sebagai hasil utamanya; dan heterofermentatif jika menghasilkan campuran berbagai senyawa atau komponen utama. Bakteri asam laktat yang tergolong homofermentatif dapat mengubah 95% dari glukosa atau heksosa lainnya menjadi
asam laktat. Karbondioksida dan asam-asam volatil lainnya juga dihasilkan, tapi jumlahnya sangat kecil (Adawyah 2007).
Produk fermentasi ikan di belahan dunia ini masih banyak ditemukan dan beberapa diantaranya merupakan makanan favorit di daerahnya masing-masing. Patis dan bagoong merupakan makanan fermentasi ikan di Filipina. Produk fermentasi dari ikan herring berasal dari Eropa (Hall 2010).
2.3 Bekasam
Bekasam merupakan produk olahan ikan dengan cara fermentasi yang rasanya asam. Olahan tersebut banyak dikenal di daerah Jawa Tengah dan Sumatera Selatan. Ikan yang dapat digunakan sebagai bekasam merupakan jenis ikan air tawar. Pengolahan bekasam di daerah Kalimantan Selatan umumnya dikenal dengan nama samu. Bahan baku berupa ikan gabus, betok, sepat siam dan sepat rawa dengan penambahan garam sekitar 15-20%, dan ditambahkan samu atau beras ginseng sebanyak 15%, kemudian difermentasi kurang lebih satu minggu sampai menghasilkan aroma dan rasa yang khas bekasam (Adawyah 2007).
2.4 Bakteri Asam Laktat (BAL)
Bakteri asam laktat meliputi grup heterogen dari mikroorganisme yang memiliki properti metabolik dari produksi asam laktat sebagai mayoritas produk akhir dari fermentasi karbohidrat. Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri Gram positif, tidak membentuk spora, katalase negatif, toleran terhadap asam, dan fakultatif anaerob. Kecuali untuk beberapa spesies, golongan BAL bersifat non patogen dengan reputasi GRAS (Generally Recognized as Safe). Bakteri asam laktat termasuk di dalamnya bakteri homofermentatif yang memproduksi sebagian besar utamanya adalah asam laktat, dan heterofermentatif yang selain memproduksi asam laktat juga memproduksi variasi yang luas dari produk fermentasi seperti asam asetat, etanol, karbon dioksida, dan asam format. Spesies tipikal BAL antara lain termasuk kedalam genera Lactobacillus, Lactococcus,
Streptococcus, Pediococcus, Oenococcus, Enterococcus, dan Leuconostoc (Mozzi et al. 2010; Klaenhammer et al. 2011).
2.4.1 Senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat
Berbagai jenis bakteri asam laktat telah diketahui dan digunakan sebagai biopreservatif alami karena zat metabolit sekunder yang dihasilkannya yang cenderung tidak berbahaya dan memiliki efek inhibitor pada bakteri lain seperti inhibitor pada bakteri enteropatogenik. Efek inhibitor utama dispekulasikan pada jalur metabolisme utama bakteri asam laktat, yang berarti jalur fermentasi. Bakteri asam laktat menggunakan jalur fermentasi untuk menghasilkan energi selular dan memproduksi asam oganik dimana pun mereka tumbuh. Hal ini juga mengakibatkan penurunan pH pada media di sekitar tempat pertumbuhannya (Theron dan Lues 2011).
Asam laktat merupakan salah satu metabolit utama dari bakteri asam laktat, namun pada bakteri heterofermentatif, bakteri asam laktat juga memproduksi asam asetat dan sebagian asam propionat dalam jumlah besar. Bakteriosin juga diproduksi oleh bakteri asam laktat sebagai substansi inhibitor bagi mikroba lain. Asam organik memicu aktivitas bakteriosin, sedangkan asidifikasi (pengasaman) yang diakibatkan asam organik meningkatkan aktivitas antibakterial baik asam organik maupun substansi inhibitor lain seperti bakteriosin (Theron dan Lues 2011).
2.4.1.1 Asam organik
Asam organik adalah tipe produk hasil metabolisme mikroorganisme. Asam organik adalah komponen organik dengan kelengkapan asam dan mengandung karbon, seperti komponen organik lainnya. Asam organik yang paling umum adalah asam karboksilat yang asiditasnya diasosiasikan dengan gugus karboksilnya –COOH. Asam jenis ini tergolong asam lemah dan tidak larut sempurna dalam air (kecuali asam format dan asam asetat). Kebanyakan asam organik memiliki keuntungan karena ukurannya yang relatif kecil sehingga dapat bergerak dengan bebas antara sel dengan sel (Theron dan Lues 2011). Struktur umum asam organik dapat dilihat pada Gambar 2.
Berbagai jenis asam organik beserta komponennya digunakan sebagai bahan tambahan pangan (food additives) yang dapat dimasukkan secara langsung pada makanan manusia. Asam organik lemah memiliki sejarah yang cukup panjang sebagai pengawet makanan karena sifat aktivitas antibakterinya. Asam
organik ini faktanya adalah preservatif yang paling umum digunakan dalam makanan, GRAS, memiliki spektrum yang luas sebagai agen antibakteri. Asam organik efektif untuk mengawetkan makanan karena selain aktivitas antibakteri, mereka juga bertindak sebagai penambah rasa asam (acidulants) dan dengan demikian mengurangi pertumbuhan bakteri dengan menurunkan pH dari produk makanan ke tingkat keasaman yang menghambat pertumbuhan bakteri (Theron dan Lues 2011).
Gambar 2 Struktur umum dari asam organik (Theron dan Lues 2011).
Asam organik yang biasanya diasosiasikan dengan bakteri asam laktat adalah asam laktat, asam propionat, dan asam asetat yang diproduksi dalam jumlah yang kecil. Asam laktat telah menunjukkan adanya aktivitas antibakteri melawan bakteri pembentuk spora, akan tetapi memiliki efek yang kecil terhadap fungi. Asam asetat dan asam propionat secara umum menghambat pertumbuhan bakteri lain lebih efektif daripada asam laktat sejak nilai pKa yang lebih tinggi dapat menyebabkan kemungkinan berdifusi melalui membran sel lain pada pH yang lebih tinggi. Keduanya telah digunakan secara luas dalam industri pangan sebagai aditif antibakteri. Selain itu telah ditunjukkan pula bahwa asam propionat lebih efektif menghambat fungi daripada asam asetat (Mayo dan van Sinderen 2010).
Asam laktat mampu melemahkan permeabilitas bakteri Gram negatif dengan merusak membran luar bakteri Gram negatif. Asam laktat merupakan molekul yang larut dalam air sehingga mampu menembus ke dalam periplasma
bakteri Gram negatif melalui protein porin pada membran luarnya. Pelindung dari permeabilitas membran luar berupa lapisan lipopolisakarida yang terletak pada permukaan membran dirusak oleh asam laktat sehingga substrat antibakteri yang lain yaitu diasetil, bakteriosin, hidrogen peroksida dan lactoperidase system dapat berpenetrasi ke dalam membran sitoplasma (Pelaez dan Orue 2010).
Gambar 3 Struktur kimia D-asam laktat (C3H6O3)
(Theron dan Lues 2011).
Selain memaksa zat antibakteri lain masuk, aktivitas antibakteri asam organik seperti asam laktat juga memiliki perannya tersendiri. Asam yang masuk melalui plasma membran sel akan terdisosiasi menjadi kation dan anion toksik. Membran sel akan luruh dan menyebabkan transportasi sel terganggu. Selain itu aktivitas air bebas (water activity) dan metabolisme sel seperti glikolisis terganggu (Theron dan Lues 2011). Struktur kimia asam laktat dapat dilihat pada Gambar 3.
2.4.1.2 Hidrogen peroksida
Hidrogen peroksida (H2O2) diproduksi oleh bakteri asam laktat sebagai hasil dari aksi flavoprotein oksidase atau nikotinamida adenin dinukleotida (NADH) peroksidase. Efek antibakteri dari H2O2 adalah hasil dari oksidasi grup sulfohydryl yang menyebabkan denaturasi sejumlah enzim, dan dari peroksidase
membran lipid meningkatkan permeabilitas membran (Kong dan Davison 1980 diacu dalam Ammor et al. 2006). Senyawa H2O2 dapat juga digunakan sebagai
prekursor untuk produksi bakterisidal radikal bebas seperti superoksida (O2-) dan
radikal hidroksil (OH-) yang dapat merusak DNA (Byczkowski dan Gessner 1988
2.4.1.3 Karbon dioksida
Karbon dioksida diproduksi terutama oleh BAL heterofermentatif. CO2
memainkan peranan penting dalam membuat lingkungan anaerobik yang
menghambat enzimatik dekarboksilase, dan akumulasi CO2 membran lipid bilayer
dapat menyebabkan disfungsi permeabilitas (Eklund 1984 diacu dalam Ammor et
al. 2006). Senyawa CO2 secara efektif dapat menghambat banyak mikroorganisme perusak makanan, terutama bakteri psikotropik Gram-negatif (Farber 1991 diacu dalam Ammor et al. 2006).
2.4.1.4 Diasetil
Diasetil diproduksi oleh strain dalam semua genera dari BAL oleh fermentasi sitrat. Diasetil menghambat pertumbuhan bakteri Gram-negatif yang bereaksi dengan pemanfaatan arginin (Jay 1986 diacu dalam Ammor et al. 2006). Bakteri negatif lebih sensitif terhadap diasetil daripada bakteri Gram-positif. Diasetil pada 344 µg/mL dapat menghambat strain Listeria, Salmonella,
Yersinia, E.coli dan Aeromonas (Jay 1982 diacu dalam Ammor et al. 2006).
2.4.1.5 Bakteriosin
Bakteriosin adalah komponen antibakteri protein yang diproduksi dari berbagai jenis bakteri, namun tidak letal bagi bakteri yang memproduksi bakteriosin tersebut. Bakteri asam laktat adalah varian yang paling penting dalam produksi bakteriosin dan substansi mirip bakteriosin. Bakteriosin yang diproduksi oleh bakteri asam laktat sangat potensial untuk dijadikan sebagai pengawet makanan alami (Simon 2001). Beberapa varian bakteriosin yang sudah dikenal dan termasuk ke dalam kategori GRAS adalah nisin, pediosin, laktisin, dan propionisin (Toldra 2010).
Antibakteri berjenis peptida (juga disebut sebagai bakteriosin), adalah zat
penting yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat. Bakteriosin komersial saat ini
diterapkan dalamberbagai sistem industri makanan untuk kontrol patogen. Zat-zat
ini juga dikenal untuk karakteristik yang menarik mereka yang membuat mereka
cocok untuk pengawetan makanan. Mereka tidak beracun untuk sel eukariotik,
mereka memiliki sedikit pengaruh pada mikroflora usus, memiliki spektrum
antibakteri yang luas, memiliki sifat bakterisida, dan toleran terhadap pH dan
seperti asam organik. Nisin adalah bakteriosin yang tersedia secara komersial
penting dan diproduksi oleh strain dari Lactococcus lactis. Nisin termasuk ke
dalam kategoriGRAS dan salah satu bakteriosin yang diizinkan dalam makanan.
Nisin telah berhasil diterapkandalam berbagai makanan, seperti produk susu dan
salad dressing (Theron dan Lues 2011).
2.4.2 Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri asam laktat
Bakteri asam laktat adalah bakteri fermentatif yang tumbuh pada media yang biasanya kaya akan kandungan gula dan protein. Suhu akan berpengaruh terhadap pertumbuhan sel dan juga pembentukan produk oleh mikroba. Hal ini berhubungan dengan jenis mikroba yang dominan selama fermentasi. Nilai pH medium merupakan salah satu parameter penting yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba. Bakteri pada umumnya tumbuh dengan baik pada pH sekitar 6,5-7,5. Asam laktat yang dihasilkan akan menurunkan nilai pH pada lingkungan pertumbuhannya (Mozzi et al. 2011)
Garam digunakan dalam proses fermentasi ikan. Pada umumnya jumlah garam yang ditambahkan dalam pembuatan bekasam berkisar antara 15 - 20% dari berat ikan segar (Murtini 1992). Konsentrasi garam yang tinggi akan menghambat pertumbuhan bakteri. Penelitian yang dilakukan oleh Ratanatriwong et al. (2009) menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi garam yang ada dalam media akan semakin menghambat pertumbuhan bakteri dalam media.
2.5 Bakteri Uji
Bakteri uji merupakan bakteri yang digunakan untuk melakukan uji aktivitas antibakteri. Bakteri uji yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri asam laktat antara lain Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Listeria
monocytogenes, Bacillus cereus, dan Staphylococcus aureus.
2.5.1 Escherichia coli
Escherichia coli adalah bakteri Gram negatif, prokariot yang paling umum
ditemukan sebagai patogen. Pada banyak hal, bakteri ini bersifat komensalis pada inang, dimana bakteri tersebut mengambil beberapa nutrisi dari inang tanpa menyebabkan simptom yang berbahaya. Namun pada beberapa kejadian spesifik, bakteri ini dapat menyebabkan berbagai penyakit pada manusia seperti enteritis, yaitu penyakit yang dapat memberikan rasa perih pada perut, atau menyebabkan
diare. Bakteri ini diidentifikasi pertama kali tahun 1885 oleh Theodor Escherich pada bayi yang mengalami inflamasi di kelenjar pencernaan (enteritis). Bakteri ini bersifat enterik, atau tahan pada kondisi di dalam gastrointestinal, serta anaerob fakultatif. Bakteri E coli yang sangat terkenal dan bersifat patogen adalah E coli O157:H7 yang menyebabkan penyakit klinis seperti diare dan kejadian luar biasa (outbreaks) foodborne di Amerika Serikat. Meskipun begitu, dikenal juga istilah E
coli enteropatogenik, enterotoksigenik, enterohemoragik, dan enteroinvasif yang
dapat menyebabkan penyakit pada manusia (Manning 2010). 2.5.2 Salmonella typhimurium
Salmonella typhimurium diklasifikasikan di bawah kelas besar dari
Enterobactericeae, yang termasuk di dalamnya patogen seperti Escherichia coli dan Shigella. Organisme yang tergolong dalam golongan ini memiliki ciri Gram negatif, berbentuk batang, non motil atau motil dengan flagel. Infeksi karena Salmonella dinamakan Salmonellosis dengan ciri-ciri sakit pada saluran pencernaan dan gastroenteritis. Serotip dari Typhimurium dan Enteriditis memiliki potensi untuk menginfeksi dan menyebabkan penyakit pada inang seperti manusia, ternak, babi, dan pengerat meskipun perpindahan inang sangat jarang terjadi. Salmonellosis adalah salah satu dari penyakit yang sering terjadi pada kasus infeksi makanan dan mudah menyebar pada makanan dan minuman yang telah terkontaminasi (Shah dan Gharbia 2010).
2.5.3 Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes merupakan bakteri Gram positif yang bersifat
fakultatif anaerob. Bakteri ini merupakan penyebab utama penyakit Listeriosis. Bakteri ini adalah salah satu dari beberapa patogen penyebab foodborne illness dengan 20 – 30 % infeksi klinis dihasilkan oleh bakteri ini. Bakteri ini bertanggung jawab terhadap sekitar 2.500 penyakit hingga 500 kematian di Amerika Serikat per tahun. Listeriosis adalah penyebab utama kematian diantara kasus bakteri patogen penyebab foodborne illness dengan rataan kematian melebihi bahkan Salmonella dan Clostridium botulinum. Sifat bakteri ini motil
2.5.4 Bacillus cereus
Bacillus cereus adalah bakteri Gram positif yang memiliki spora yang
tahan panas hingga diatas 100 oC (Graumann 2007). Strain dari bakteri ini adalah
fakultatif patogen yang dapat memproduksi dua tipe umum dari toksin. Toksin enetik yang stabil terhadap panas diproduksi dari strain bakteri yang tumbuh di makanan yang mengandung pati seperti nasi dan kentang. Penyakit yang diasosiasikan dengan makanan ini dapat dihindari dengan refrigerasi yang cukup dari makan yang telah dimasak. Enterotoksin yang labil terhadap suhu diproduksi dari strain lain, beberapa ada yang psikotropik yang tumbuh pada makanan yang berprotein (Wallace et al. 2011).
2.5.5 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram positif yang menyebabkan
berbagai macam penyakit pada manusia. Bakteri ini menginfeksi tubuh manusia melalui kulit dan menyerang berbagai jaringan tubuh manusia seperti darah (bakterimia), hati, paru-paru (pneumonia), otot, daging, tulang, mata, dan sendi. Infeksi bisa terjadi secara cepat (akut) atau lama (kronis). Sejumlah kejadian telah dilaporkan di negara UK bahwa infeksi oleh bakteri ini sekitar 2% dari total kasus infeksi penyakit dalam dan hampir 20.000 kasus bakterimia (darah) terjadi setiap tahun (Lindsay 2008).
