KELANGSUNGAN HIDUP Pasteurella multocida
SETELAH PENYIMPANAN JANGKA LAMA
PADA SUHU KAMAR DAN -15
°
C
(Survival of Pasteurella multocida after Long Term Storage at
Room Temperature and -15
°
C)
SITI CHOTIAH
Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 30, Bogor 16114
ABSTRACT
A wide variety of techniques are used for the preservation of microbes and it may be difficult to choose the most suitable for a particular microbes. The preservation method used should minimize loss of viability during processing and storage so that after preservation, cultures will survive for long periods. Survival of lyophilized Pasteurella multocida after long term storage at room temperature and -15°C have been evaluated for achieving the suitable and efficient monitoring in the microbial germ plasm preservation. A total of 93 lyophilized samples of 19 Pasteurella multocida collection prepared in vaccum glass ampoules, stored for more than 12 years at different temperatures were grown on specific medium and identified for the bacterial species. The results showed that 8 of 12 (66,7%) collections of Pasteurella multocida were still viable to life after storing at -15°C emperature during 15 until 24 years, whereas at room temperature during 12 until 22 years showed 4 of 19 (21,05%) collections were viable. There was an indication that survival of lyophilized Pasteurella multocida after long term stored at -15°C is better than at room temperature.
Key Words: Survival, Pasteurella multocida, Storage, Temperature
ABSTRAK
Banyak teknik telah digunakan untuk preservasi mikroba dan terkadang sulit menentukan teknik yang sesuai dan tepat untuk mikroba tertentu. Metode preservasi yang digunakan harus meminimalkan kehilangan viabilitas selama proses dan penyimpanan, sehingga setelah preservasi kultur akan hidup untuk waktu yang lama. Kelangsungan hidup Pasteurella multocida setelah penyimpanan jangka waktu lama pada suhu kamar dan -15°C telah dievaluasi untuk mendapatkan cara pemantauan yang tepat dan efisien dalam pelestarian plasma nutfah mikroba. Sebanyak 93 sampel biakan kering di dalam kemasan ampul gelas dalam kondisi vakum berasal dari 19 koleksi Pasteurella multocida yang telah disimpan lebih dari 12 tahun pada 2 suhu yang berbeda telah ditumbuhkan dalam medium khusus, kemudian diuji viabilitas, kemurnian dan diidentifikasi sampai spesies. Hasil menunjukkan bahwa 8 dari 12 (66,7%) koleksi biakan Pasteurella multocida masih bertahan hidup setelah disimpan pada suhu -15°C selama 15 sampai 24 tahun, sedangkan pada suhu kamar sebanyak 4 dari 19 (21,05%) koleksi masih bertahan hidup selama 12 sampai 22 tahun. Ini menunjukkan bahwa kelangsungan hidup koleksi biakan Pasteurella multocida lebih lama pada suhu simpan -15°C dibandingkan dengan suhu kamar.
Kata Kunci: Kelangsungan Hidup, Pasteurella multocida, Suhu Penyimpanan
PENDAHULUAN
Berbagai macam metode yang dipakai dalam preservasi mikroba yang dilakukan dalam koleksi kultur adalah metode subculture,
drying, freeze-drying dan freezing. Akan tetapi
tidaklah mudah dalam memilih metode yang terbaik untuk keperluan tertentu. Penentuan
teknik pengawetan atau penyimpanan mikroba memerlukan penelitian yang rumit, jangka waktu lama, perlu pemantauan dan dana yang besar. Hal itu berkaitan dengan dua hal penting dari tujuan pemilihan metode pemeliharaan mikroba adalah menghasilkan angka kelangsungan hidup yang maksimal dan menjaga stabilitas sifat genetiknya.
Menurut SNELL (1991) pemilihan metode preservasi mikroba ditentukan sendiri oleh koleksi kultur masing-masing berdasarkan kemampuan fasilitas yang ada dan dana yang tersedia. Metode freeze-drying dipakai dalam konservasi sebagian besar koleksi mikroba di BBalitvet Culture Collection (BCC), termasuk diantaranya adalah koleksi mikroba bakteri
Pasteurella multocida.
Pasteurella multocida merupakan bakteri
patogen pada hewan ternak menyebabkan
hemorrhagic septicemia (penyakit ngorok),
shipping fever dan atrophic rhinitis, pada
unggas menyebabkan fowl cholera (kolera unggas) dan pada kelinci percobaan menyebabkan snauffles (ADLAM dand RUTTER, 1989)
Lebih dari 12 tahun yang lalu, telah dilakukan preservasi dengan metode
freeze-drying menggunakan medium preservan 7,5%
glukosa serum (LAPAGE, et al., 1970) terhadap koleksi biakan Pasteurella multocida diBCC. Proses freeze-drying menggunakan mesin Edwards EF4 Medulyo freeze-drier (Manor Royal, Crawley, West Sussex, U K) dilakukan pada suhu –40°C dengan dua tahapan pengeringan. Pada tahapan pertama menggunakan sentrifuge sampai tekanan mencapai 6,7 mbar, tahapan ini terus berlanjut hingga mencapai tekanan 1,3 x 10-1 mbar. Kemudian koleksi disimpan di dua tempat yang berbeda yaitu pada suhu kamar dan dalam freezer suhu -15°C.
Setelah lebih dari 12 tahun dilakukan kontrol mutu (uji viabilitas, kemurnian dan reidentifikasi) terhadap koleksi mikroba yang ada di BCC, diantaranya koleksi Pasteurella
multocida. Kelangsungan hidup koleksi
Pasteurella multocida setelah penyimpanan
jangka waktu lama pada suhu kamar dan -15°C telah dievaluasi untuk mendapatkan cara pemantauan yang tepat dan efisien dalam pelestarian plasma nutfah mikroba.
MATERI DAN METODE
Biakan Pasteurella multocida
Sebanyak 69 sampel biakan plasma nutfah mikroba Pasteurella multocida di dalam kemasan ampul gelas dalam kondisi hampa udara yang berasal dari 19 koleksi yang disimpan pada suhu kamar tanpa pendingin dan
24 sampel yang berasal dari 9 koleksi yang sama dengan sebagian koleksi tersebut tetapi disimpan dalam suhu -15°C, telah digunakan sebagai bahan penelitian. Biakan-biakan mikroba tersebut merupakan koleksi pada BBalitvet Culture Collection (BCC) yang telah disimpan selama lebih dari sepuluh tahun (12 sampai dengan 24 tahun) dengan metode preservasi freeze drying menggunakan medium preservan 7,5% glukosa serum. Sampel diambil secara acak dari masing-masing tanggal proses freeze drying (nomor batch) dari setiap koleksi sebanyak 20% dari stok yang ada di BCC.
Uji pertumbuhan dan reidentifikasi
Masing-masing sampel ampul dicatat nomor koleksi dan tanggal proses freeze-drying (nomor batch). Kondisi fisik ampul diperiksa dan bagian luarnya dibersihkan dengan alkohol 70%. Membuka ampul dilakukan di dalam ruang biohazard, dengan bagian ampul yang terbuka diletakkan pada nyala api, kemudian 0,5 ml medium kaldu brain hart infusion (BHI) dimasukkan kedalam ampul, isi ampul dilarutkan. Suspensi isi ampul dipindahkan ke dalam medium kaldu BHI volume 2 ml yang disiapkan dalam tabung bijou dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 8 – 12 jam. Kultur bakteri dalam medium tersebut selanjutnya dibiakkan pada lempeng agar darah yang mengandung 5% darah domba dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 – 48 jam. Koloni murni yang tumbuh diidentifikasi menurut prosedur BARROW dan FELTHAM (2003) dan CARTER (1973). Identifikasi tahap pertama diuji dengan pewarnaan Gram, pergerakan dalam medium semi solid, pertumbuhan pada medium agar Mc. Conkey pada kondisi aerobik, aktifitas enzim katalase dan oksidase. Tahap kedua dilakukan uji terhadap: reduksi nitrat menjadi nitrit, pembentukan indol, fermentasi glukosa, hidrolisis arginin, aktifitas enzim urease, hidrolisis eskulin, hidrolisis gelatin, aktifitas enzim β galaktosidase, asimilasi glukosa, arabinosa, mannosa, manitol, N-asetil-glukosamin, maltosa, potasium glukonat, asam kaprat, asam adipat, asam malat, trisodium sitrat, asam fenil asetat, sitokhrom oksisase. Hasil reaksi dibaca menggunakan API system
yaitu API 20 NE (Bio Merieux SA, La Balmes-Les Grottes, France).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kelangsungan hidup biakan Pasteurella
multocida koleksi BCC dalam bentuk kering
setelah penyimpanan jangka lama (12 sampai dengan 22 tahun) pada suhu kamar dipaparkan
di dalam Tabel 1. Sebanyak 4 dari 19 (21,05%) koleksi biakan Pasteurella multocida masih tahan hidup setelah disimpan pada suhu kamar tanpa pendingin selama 12 sampai 22 tahun. Empat koleksi tersebut adalah 2 koleksi masih tahan hidup setelah disimpan selama 15 tahun dan 2 koleksi lainnya setelah 17 tahun, dengan prosentase masing-masing 76, 25, 20 dan 25% dari sampel yang diuji.
Tabel 1. Kelangsungan hidup biakan Pasteurella multocida koleksi BCC dalam bentuk kering setelah penyimpanan jangka lama pada suhu kamar
Jumlah sampel tahan hidup setelah dikonservasi tahun ke: Asal koleksi Nomor koleksi (BCC) Jumlah sampel (ampul) 12 13 14 15 17 18 19 20 21 22 2 0 2 0 2 0 0299 2 0 0362 2 0 2 0 0365 2 0 0850 2 0 2 0 1359 2 0 1459 2 0 1847 2 0 1848 3 0 4 0 1850 3 0 1878 3 0 2158 2 0 2205 4 3 INA 2234 4 0 0003 5 2 0005 2 0 0346 4 1 4 1 0347 2 0 0700 3 0 LN 2183 2 0 Σ 19 69 0 0 0 4 3 0 0 0 0 0
% sampel tahan hidup 0 0 0 28,6 13,6 0 0 0 0 0
Σ koleksi tahan hidup 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0
Dalam konservasi eks situ mikroba akan terjadi kematian sel-sel selama proses preservasi, dan kemudian akan hilang selama dalam penyimpanan (SNELL, 1991). Penurunan viabilitas Pasteurella multocida pada konservasi eks situ dengan metode freeze
drying dalam medium suspensi 7,5% glukosa
serum terjadi sebanyak 1,3 x 101 CFU/ml, 102 CFU/ml dan 8,2x102 CFU/ml berturut-turut masing-masing karena pengaruh proses, pengaruh penyimpanan selama 1 dan 2 bulan (CHOTIAH, 2006). Koleksi Pasteurella yang ada
di National Collection of Type Cultures,
Inggris masih tahan hidup sampai 30 tahun penyimpanan dengan metode freeze drying, walaupun sudah tidak terhitung secara logaritma (RUDGE, 1991).
Kelangsungan hidup biakan Pasteurella
multocida koleksi BCC dalam bentuk kering
setelah penyimpanan jangka lama pada suhu -15°C dipaparkan di dalam Tabel 2. Sebanyak 8 dari 12 (66,7%) koleksi biakan Pasteurella
multocida masih tahan hidup setelah disimpan
pada suhu -15°C selama 15 sampai 24 tahun. Berdasarkan kelompok umur penyimpanan maka kelangsungan hidup koleksi biakan tersebut sebanyak 100, 83,3, 100, 59, 25 dan 0% dari sampel yang diuji masing-masing
berturut-turut setelah disimpan selama 15, 17, 19, 22 dan 24 tahun.
Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa konservasi Pasteurella multocida dengan metode frezze drying memiliki ketahanan hidup lebih lama pada suhu simpan -15°C dibanding dengan pada suhu kamar tanpa pendingin. Sesuai dengan pendapat CARTER (1984) semua Pasteurella tahan hidup selama beberapa tahun setelah frezze drying (lyophilized) menggunakan mediun suspensi konvensional; dalam medium suspensi fibrilasi darah, disimpan pada suhu -40°C sampai -70°C. akan tahan dalam jangka lama; viabilitas bisa tahan sampai waktu tidak terbatas jika disimpan pada suhu -180°C (nitrogen cair).
Identifikasi terhadap 8 koleksi Pasteurella
multocida menggunakan API system yaitu API
20 NE hasilnya dipaparkan didalam Tabel 3. Sebanyak 5 dari 8 koleksi yang masih berlangsung hidup menunjukkan karakteristik 99,6% Pasteurella multocida. Sedangkan 3 koleksi lainnya menunjukkan karakrter yang sedikit lain yaitu koleksi BCC B2158 dan BCC B2183 dapat memfermentasi glukosa, sedangkan koleksi BCC B0700 tidak memproduksi indol.
Tabel 2. Kelangsungan hidup biakan Pasteurella multocida koleksi BCC dalam bentuk kering setelah penyimpanan jangka lama (15 – 24 tahun) pada suhu -15°C
Jumlah sampel tahan hidup setelah dikonservasi tahun ke: Asal koleksi Nomor koleksi (BCC B) Jumlah sampel (ampul) 15 17 19 21 22 24 0299 2 0 0365 2 0 1850 2 0 1878 2 2 2158 2 2 INA 2205 2 2 0003 2 1 0005 2 1 0346 2 2 0347 2 0 0700 2 1 LN 2183 2 2 Σ 12 24 2 5 2 2 2 0
% sampel tahan hidup 100 83,3 100 50 25 0
Σ koleksi tahan hidup 1 3 1 2 1 0
Tabel 3. Reaksi biokimia dari 8 koleksi Pasteurella multocida yang masih memiliki ketahanan hidup setelah dikonservasi lebih dari 15 tahun
Nomor koleksi BCC B Uji 1878 2158 2205 0003 0005 0346 0700 2183 Potasium nitrat L-triptopan D-glukosa L-arginin Urea
Eskulin feri sitrat Gelatin 4-nitrofenil-βD- glaktopiranosida D-glukosa L-arabinosa D-mannosa D-manitol N-asetil-glukosamin D-maltosa Potasium glukonat Asam kaprat Asam adipat Asam malat Trisodium sitrat Asam fenil asetat Oksidase + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - + Profil API 20 NE 3000 004 7000 004 3000 004 3000 004 3000 004 3000 004 1000 004 7000 004 % ID API 20 NE 96,6 59,6 96,6 96,6 96,6 96,6 47,9 59,6 KESIMPULAN
Telah dievaluasi 93 sampel biakan kering di dalam kemasan ampul gelas dalam kondisi vakum berasal dari 19 koleksi Pasteurella
multocida yang telah disimpan selama 12
sampai 22 tahun pada suhu kamar dan pada suhu -15°C selama 15 sampai 24 tahun
Kelangsungan hidup koleksi biakan
Pasteurella multocida dalam konservasi eks
situ dengan metode preservasi freeze drying akan lebih lama pada suhu simpan -15°C dibanding dengan suhu kamar.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Sdr. Agus Wahyudin dan Sdr. Sukatma teknisi Bakteriologi BBalitvet yang telah membantu dalam kegiatan penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
ADLAM,C. and J.M.RUTTER. 1989. Pasteurella and Pasteurellosis. Academic Press. Ltd London, Englan.
BARROW,G.I. and R.K.A.FELTHAM. 2003. Cowan and Steel`S Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3nd Ed. Cambridge University Press, UK. pp. 118 – 119.
CARTER, G.R. 1984. Pasteurella. In: Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Volume 1. NOEL R.KRIEG (Ed.) Williams & Wilkins, Baltomore, USA.
CARTER, G.R. 1973. Diagnostic Procedure in Veterinary Microbiology. 2nd Ed. Charles C. Thomas Publicher, Springfield, Illinois, USA. CHOTIAH,S. 2006. Pengaruh Proses Freeze Drying
dan Penyimpanan Pada Suhu Kamar terhadap Viabilitas dan Patogenisitas Plasma Nutfah Mikroba Pasteurella multocida. Bull. Plasma Nutfah. 12(1): 40 – 44.
LAPAGE,S.P.,JEAN E.SHELTON,T.G.MITCHELL and A.R.MACKENZIE. 1970. Culture collection and the preservation of bacteria. In: Methods in Microbiology. Volume 3A. Academic Press London and New York. pp. 130 – 228. RUDGE, R.H. 1991. Maintenance of Bacteria by
Freeze-drying. In: Maintenance of Microorganisms and Cultured Cells. KIRSOP, B.E. and A. DOYLE (Eds). Academic Press Limited. pp. 31 – 43.
SNELL, J.J.S. 1991. General Introduction To Maintenance Methode. In: Maintenance of Microorganisms and Cultured Cells. KIRSOP, B.E. and A. DOYLE (Eds). Academic Press Limited. pp. 21 – 30.
