^ Setelah pemurnian sHeVG, analisis spektrometer electro Dari enam fraksi elusi menunjukkan pengayaan sekitar 70 kDa yang terdiri dari sHeV G pr tein (Gambar 1B).
^ Glikosilasi protein rekombinan diuji dengan inkubasi dengan PNGase F, menghasilkan pergeseran massa sekitar 7-8 kDa sHeV G dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati dalam analisis imunoblot (Gambar 1C).
^ Lebih jauh lagi, protein yang dimurnikan dianalisis oleh MS. Untuk tujuan ini, itu dicerna dengan tripsin, peptida yang dihasilkan dikenai untuk analisis sidik jari massal peptida dan 40 massa jari? spektrum cetak dianalisis secara tandem MS.Peptida spektrum meliputi 71% dari urutan dan 44,4% dari urutan Bisa dikonfirmasi dengan tandem MS (Suppl. Gambar 2A) Khususnya, N ??? dan C-termini juga diidentifikasi sebagai tag Strep (AA 1-28).
^ Terlebih lagi, fragmen tryptic N-terminal (WSHPQFEK) bias Secara jelas diidentifikasi oleh tandem MS massa 1058.505 Da (Suppl. Gambar 2B) yang menunjukkan bahwa N-terminus telah diproses seperti yang diharapkan. Peptida tryptic yang mewakili SP dari LMSAP adalah tidak terdeteksi.
^ Untuk menilai apakah konformasi sHeV G yang dimurnikan Memang memungkinkan pengikatan reseptor HeV masuk, efisiensinya dari sHeV G yang mengikat EFNB2 telah diuji. Setelah melapisi ELISA piring dengan sHeV G pada konsentrasi 2 g sHeVG / ml, EFNB2 / Fc resisten ditambahkan dalam jumlah yang meningkat dan pengikatan reseptor divisualisasikan dengan pengukuran akhir OD. sHeV G memang menangkap protein EFNB2 / Fc (Gambar 2), menunjukkan dosis tergantung interaksi EFNB2 / Fc dengan protein rekombinan sHeV G diekspresikan dalam L. tarentolae.
^ pada (Gambar 3), sHeV G secara efisien diendapkan dengan EFNB2 / Fc.Incuβ bromasi EFNB2 / Fc dengan ekstrak L. tarentolae sel yang kekurangan Gen HeV G tidak menghasilkan protein yang diendapkan. Sejak sHeV G tidak mengikat protein dynabeads, kita menyimpulkan bahwa Leishmania-mengungkapkan sHeV G berinteraksi secara khusus dengan HeV reseptor entri sel EFNB2.
^ dipilih sebagai kontrol negatif. Seperti yang ditunjukkan pada (Gambar 4), recom? Binant sHeV G terikat pada sel RK-13 dengan cara yang tergantung dosis dan tidak dapat ditentukan, sehingga mengkonfirmasikan interaksi spesifik antara reseptor seluler EFNB2 dan protein rekombinan. Sebagai konsekuensinya, sel CHO-K1 tidak mengikat protein rekombinan.
^ Untuk mengetahui potensi imunogenik sHeV G yang dimurnikan itu digunakan untuk mengimunisasi kelinci. Setelah tiga imunisasi dengan 100 dan 50 g sHeVG, serum RAb4048 diperoleh dan diuji di HeV G atau NiV G yang mengekspresikan sel HEK293T. Pengenceran serum 1: 2000 (HeV G) dan 1: 1000 (NiVG) menghasilkan isasi visual yang meyakinkan dari kedua protein, sedangkan tidak ada sinyal yang didapat pada sel transfected dengan vektor kosong sebagai kontrol negatif (Gambar 5). data menunjukkan bahwa antibodi yang diinduksi oleh sHeV G juga mengikat ke pribumi Protein HeV G
DISKUSI TITIK 2 -> BACA
