Phylogenetic of Stevia based on Maturase K (matK) gene
Dyah Subositi, Harto Widodo
Balai Besar Litbang Tanaman Obat dan Obat Tradisional Badan Litbangkes, Kemenkes RI
Jl. Lawu, Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah
ABSTRAK
Genus Stevia mempunyai anggota lebih dari 150 spesies, Stevia rebaudiana merupakan spesies yang banyak diteliti karena menghasilkan senyawa glikosida. Senyawa glikosida yang dihasilkan yaitu stevioside yang mempunyai rasa manis 300 kali manis gula dan dimanfaatkan sebagai pemanis alami non kalori. Penelitian mengenai Stevia telah banyak dilakukan akan tetapi penelitian mengenai hubungan kemiripan dan kekerabatan anggota genus Stevia belum banyak dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan kekerabatan interspesifik Stevia berdasarkan gen Maturase K (MatK). Pengambilan data dalam penelitian ini adalah dengan melakukan penelusuran sekuens nukleotida 20 spesies Stevia di genbank atau situs NCBI (National Center for Biotechnology Information). Data Sequence gen matK yang diperoleh dipreparasi dengan Program File Editor (PFE) dan kemudian di-align serta menyusun hubungan kekerabatan dengan menggunakan program CLUSTALX dan PHYLIP. Visualisasi pohon filogeni dengan menggunakan program TREEVIEW, sedangkan similaritas antar anggota genus Stevia dapat diketahui dengan menggunakan program PHYDIT. Hasil penelitian menunjukkan bahwa genus Stevia berkelompok membentuk 3 klaster besar dan beberapa spesies Stevia mempunyai kemiripan sekuens nukleotida gen matK 100%.
Kata kunci: stevia, Stevia rebaudiana, filogenetik, gen maturase K
ABSTRACT
The genus of Stevia have more than 150 species and Stevia rebaudiana becomes the most conducted research object due to its glicoside content. Stevioside is the glicoside compound which posses 300 times sweeter than sugar but has no calories. There have been many research conducted on Stevia, however research about the similarity
relation and phylogenetic of the genus member of stevia is lack. This research aims to revail the interspecific
phylogenetic of stevia based on gene Maturase K (MatK). The data sampling in this research was taken by tracing the nucleotide sequences of 20 species of stevia in the gene bank or NCBI site (National Center for Biotechnology Information). The sequence data of gene matK obtained were preparated by Program File Editor (PFE) then aligned and arranged the kinship relation using program called CLUSTALX dan PHYLIP. The visualisation of phylogenic tree using TREEVIEW program, whereas the similariry between the genus member of stevia can be obtained using PHYDIT program. The research result showed that the genus of Stevia grouped into 3 main clusters dan some of stevia species having nucleotide sequence similarity of gene matK 100%.
PENDAHULUAN
Genus Stevia mempunyai anggota lebih
dari 150 spesies, akan tetapi dari jumlah
tersebut hanya Stevia rebaudiana yang banyak diteliti karena menghasilkan senyawa glikosida. Senyawa glikosida yang dihasilkan yaitu
stevioside yang mempunyai rasa manis 300 kali
manis gula dan dimanfaatkan sebagai pemanis alami non kalori (Hadia et al., 2008). Penelitian
mengenai taksonomi Stevia hanya sebatas sidik
jari DNA dan profil protein antar aksesi Stevia rebaudiana yang mengarah pada similaritas
intraspesifik. Hubungan kekerabatan antar spesies (interspesifik) dari genus Stevia belum
diteliti terutama dengan menggunakan gen
maturase K (matK). Gen matK mempunyai panjang
kurang lebih 1500 pasangan basa, terletak di
antara intron kloroplas pada gen trnK (Hilu dan Liang, 1997). Gen matK mempunyai fungsi untuk
maturase (pemasakan) yaitu splicing intron
tipe II dari RNA transcripts (Simpson, 2006).
Penggunaan matK dalam sistematik mempunyai kelebihan dibandingkan dengan gen-gen lainnya
karena gen ini mempunyai sinyal filogenetik
yang tinggi. Informasi tunggal dari sequence
matK dapat menghasilkan filogeni yang kokoh
dibandingkan dari data sets kombinasi 2-11 gen
lainnya (Barthet dan Hilu, 2007). Penggunaan
gen matK efektif untuk menyusun hubungan
kekerabatan filogenetik baik intraspesifik maupun interspesifik antar tanaman berbunga
bahkan seluruh Angiospermae (Samuel et al.,
2006).
Penyusunan hubungan kekerabatan berdasar sequence gen matK tidak harus
sequencing
objek yang diteliti karena biaya yang diperlukan relatif mahal. Sequence nukleotida dapat diakses dan diunduh secara mudah, cepat dan bebas biaya di genbank yang menyimpan hasil-hasil sekuens semua organisme. Ketersediaan data
sequence tersebut dapat dimanfaatkan secara bebas oleh berbagai kalangan untuk kepentingan dan tujuan masing-masing. Data sequence dapat dimanfaatkan untuk kepentingan sistematik yaitu untuk penyusunan hubungan kekerabatan yang diolah menggunakan program komputer.
Data sequence dapat digunakan sebagai karakter dan status karakter dalam penyusunan hubungan kekerabatan. Hubungan kekerabatan digambarkan dalam suatu diagram bercabang
yang disebut sebagai pohon filogenetik atau
cladogram. Garis percabangan pada pohon
filogenetik disebut sebagai lineages atau clades
yang menggambarkan garis evolusi atau nenek moyang berdasarkan kesamaan karakter
(Simpson, 2006). Tujuan dari penelitian ini adalah
menyusun hubungan kekerabatan antar spesies
(interspesifik) dari genus Stevia berdasarkan
gen maturase K (matK).
METODE PENELITIAN
Pengambilan data dalam penelitian ini adalah dengan melakukan penelusuran sequence
gen maturase K (matK) sebanyak 20 spesies
dari genus Stevia dan kerabat dekatnya yang digunakan sebagai outgroup yaitu Ageratum haustonianum dan Helianthus annus di genbank atau situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) yaitu www.ncbi.nlm.gov.
Berikut adalah sampel spesies yang digunakan untuk menyusun hubungan
Tabel 1. Spesies dari genus Stevia dan kerabatnya yang digunakan untuk menyusun hubungan kekerabatan filogenetik
No Nama Spesies Nomor Aksesi Panjang
Nukle-otida (bp)
1 Stevia rebaudiana AB457364 1125
2 S. origanoides AB457362 1125
3 S. reticulata AB457365 1125
4 S. filodecaballoana AB457344 1125
5 S. vellutinella AB457377 1125
6 S. latifolia AB457346 1125
7 S. occidentalis AB457359 1125
8 S. seemaniiodes AB457369 1125
9 S. perfoliata AB457363 1125
10 S. lita AB457350 1125
11 S. seemanii AB457368 1125
12 S. revoluta AB457366 1125
13 S. selleriana AB457370 1125
14 S. scabrella AB457367 1125
15 S. tephrophylla AB457375 1125
16 S. tenuis AB457374 1125
17 S. veronicae AB457378 1125
18 S. selloi AB457371 1125
19 S. alternifolia AB457332 1125
20 S. hypomalaca AB457345 1125
21 Ageratum haustonianum AF151434 1174
22 Helianthus annuus AF151469 1165
Data Sequence gen matK yang diperoleh dipreparasi dengan Program File Editor (PFE) dan kemudian di-align dengan menggunakan program CLUSTALX. Hasil alignment tersebut
digunakan untuk menyusun pohon filogeni
dengan menggunakan program PHYLIP dan
visualisasi pohon filogeni dengan menggunakan
program TREEVIEW. Similaritas antar anggota genus Stevia dapat diketahui dengan menggunakan program PHYDIT.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hubungan kekerabatan filogenetik 20
spesies dari genus Stevia berdasarkan gen
matK yang dianalisis menggunakan algoritme
Neighbour-Joining ditunjukkan oleh pohon
filogeni dalam bentuk Rectangular Cladogram
Tabel 2. Nilai Similaritas dan Perbedaan Nukleotida antar spesies dari genus Stevia dan kerabatnya berdasarkan gen matK (%)
S. perfoliat
a
S. seemaniioide
s
S.oc
cident
alis
S. orig
anoide
s
S. lit
a
S. latifolia S. h
ypomalac
a
S. filodec
aballoana
S. v
e
llutine
lla
S. r
eticulat
a
S. seemanii
S. perfoliata --- 0/1125 0/1125 1/1125 7/1125 0/1125 0/1125 1/1125 1/1125 2/1125 2/1125 42/1067 36/1067
S. seemaniioides 100 --- 0/1125 1/1125 7/1125 0/1125 0/1125 1/1125 1/1125 2/1125 2/1125 42/1067 36/1067
S. occidentalis 100 100 --- 1/1125 7/1125 0/1125 0/1125 1/1125 1/1125 2/1125 2/1125 42/1067 36/1067
S. origanoides 99.91 99.91 99.91 --- 8/1125 1/1125 1/1125 2/1125 2/1125 3/1125 3/1125 43/1067 37/1067
S. lita 99.38 99.38 99.38 99.29 --- 7/1125 7/1125 8/1125 8/1125 9/1125 9/1125 49/1067 43/1067
S. latifolia 100 100 100 99.91 99.38 --- 0/1125 1/1125 1/1125 2/1125 2/1125 42/1067 36/1067
S. hypomalaca 100 100 100 99.91 99.38 100 --- 1/1125 1/1125 2/1125 2/1125 42/1067 36/1067
S. filodecaballoana 99.91 99.91 99.91 99.82 99.29 99.91 99.91 --- 0/1125 1/1125 3/1125 43/1067 37/1067
S. vellutinella 99.91 99.91 99.91 99.82 99.29 99.91 99.91 100 --- 1/1125 3/1125 43/1067 37/1067
S. reticulata 99.82 99.82 99.82 99.73 99.2 99.82 99.82 99.91 99.91 --- 4/1125 10/1125 44/1067 38/1067
S. seemanii 99.82 99.82 99.82 99.73 99.2 99.82 99.82 99.73 99.73 99.64 --- 42/1067 36/1067
S. revoluta 99.82 99.82 99.82 99.73 99.2 99.82 99.82 99.73 99.73 99.64 99.82 42/1067 36/1067
S. alternifolia 99.82 99.82 99.82 99.73 99.2 99.82 99.82 99.73 99.73 99.64 99.82 0/1125 0/1125 0/1125 0/1125 42/1067 36/1067
S. rebaudiana 99.82 99.82 99.82 99.73 99.2 99.82 99.82 99.73 99.73 99.64 99.82 100 0/1125 0/1125 0/1125 42/1067 36/1067
S. selloi 99.82 99.82 99.82 99.73 99.2 99.82 99.82 99.73 99.73 99.64 99.82 100 100 0/1125 0/1125 42/1067 36/1067
S. veronicae 99.82 99.82 99.82 99.73 99.2 99.82 99.82 99.73 99.73 99.64 99.82 100 100 100 0/1125 42/1067 36/1067
S. tenuis 99.82 99.82 99.82 99.73 99.2 99.82 99.82 99.73 99.73 99.64 99.82 100 100 100 100 42/1067 36/1067
S. scabrella 99.91 99.91 99.91 99.82 99.29 99.91 99.91 99.82 99.82 99.73 99.91 0/1125 41/1067 35/1067
S. selleriana 99.91 99.91 99.91 99.82 99.29 99.91 99.91 99.82 99.82 99.73 99.91 100 41/1067 35/1067
S. tephrophylla 99.29 99.29 99.29 99.2 98.67 99.29 99.29 99.2 99.2 99.11 99.29 38/1067 32/1067
Ageratum
hausto-nianum 96.06 96.06 96.06 95.97 95.41 96.06 96.06 95.97 95.97 95.88 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.16 96.16 96.44 41/1165
S. filodec
0/1125 0/1125 0/1125 0/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
100 0/1125 0/1125 0/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
100 100 0/1125 0/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
3/1125 3/1125 3/1125 3/1125 3/1125 3/1125 2/1125 2/1125 9/1125 43/1067 37/1067
9/1125 9/1125 9/1125 9/1125 9/1125 9/1125 8/1125 8/1125 15/1125 49/1067 43/1067
100 100 100 0/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
100 100 100 100 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
S. filodecaballoana 0/1125 3/1125 3/1125 3/1125 3/1125 3/1125 3/1125 2/1125 2/1125 9/1125 43/1067 37/1067
100 3/1125 3/1125 3/1125 3/1125 3/1125 3/1125 2/1125 2/1125 9/1125 43/1067 37/1067
4/1125 4/1125 4/1125 4/1125 4/1125 4/1125 3/1125 3/1125 10/1125 44/1067 38/1067
99.64 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
99.64 --- 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 2/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
99.64 99.82 --- 0/1125 0/1125 0/1125 0/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
99.64 99.82 100 --- 0/1125 0/1125 0/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
99.64 99.82 100 100 --- 0/1125 0/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
99.64 99.82 100 100 100 --- 0/1125 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
99.64 99.82 100 100 100 100 --- 1/1125 1/1125 8/1125 42/1067 36/1067
99.91 99.91 99.91 99.91 99.91 99.91 --- 0/1125 7/1125 41/1067 35/1067
99.91 99.91 99.91 99.91 99.91 99.91 100 --- 7/1125 41/1067 35/1067
98.67 99.29 99.29 99.29 99.29 99.29 99.29 99.38 99.38 --- 38/1067 32/1067
96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.06 96.16 96.16 96.44 --- 41/1165
Gambar 2. Pohon Filogeni (Phylogram) berdasarkan Algoritme Neighbour-Joining (Saitou & Nei, 1987) yang menunjukkan hubungan kekerabatan 20 spesies dari genus Stevia berdasarkan gen matK
Hubungan kekerabatan antar spesies dari genus stevia dapat dikonstruksi menggunakan
sequence gen salah satunya yaitu gen maturase K (matK). Gen tersebut lebih banyak digunakan sebagai dasar penyusunan sistematik Angiospermae dibandingkan gen-gen lainnya
karena mempunyai jumlah yang lebih besar dalam hal subsitusi nukleotida, mutasi nonsynonymous
dan adanya peristiwa insersi dan delesi (indels) (Hilu et al., 2003).
Pohon filogeni pada Gambar 1. menunjukkan
yang beranggotakan 4 spesies stevia, anggota klaster II sebanyak 5 spesies stevia dan anggota klaster III sebanyak 12 spesies stevia dan
outgroup (Helianthus annuus dan Ageratum haustonianum). Hubungan kekerabatan yang paling dekat adalah Stevia rebaudiana dan S. alternifolia dan dalam outgroup itu sendiri.
Dalam penyusunan hubungan kekerabatan diperlukan adanya outgroup sebagai kontrol, pembanding atau posisi akar sebuah pohon
filogeni. Outgroup merupakan takson yang mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat dengan takson yang diteliti tetapi tidak termasuk
di dalam anggotanya (Simpson, 2006). Outgroup
yang digunakan dalam menyusun hubungan kekerabatan Stevia ini adalah Helianthus annuus
dan Ageratum haustonianum karena memiliki hubungan kekerabatan yang paling dekat dengan stevia. Genus stevia dan ageratum merupakan anggota Tribus (di bawah Subfamily) Eupatorieae, sedangkan Tribus Eupatorieae mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat dengan Helianthus yang merupakan anggota Tribus
Heliantheae. Tribus Heliantheae dan Eupatorieae merupakan anggota Subfamily Asteroideae dalam
family Asteraceae (Judd et al., 1999).
Posisi outgroup yang berada di antara taksa yang diteliti merupakan suatu penyimpangan. Hal tersebut kemungkinan disebabkan karena gen matK mempunyai tempo evolusi yang cepat.
Barthet dan Hilu (2007) menyatakan bahwa
kecepatan subsitusi dalam gen matK 3 kali lebih
tinggi pada level nukleotida dan 6 kali lebih tinggi
pada level asam amino bila dibandingkan dengan gen rbcL (Rubisco). Kecepatan tersebut juga
yang sama. Helianthus annuus dan Ageratum haustonianum mempunyai sifat lebih maju daripada genus Stevia, hal tersebut ditunjukkan dengan cabang horisontal yang lebih panjang (Gambar 2). Percabangan horisontal yang lebih panjang menunjukkan adanya perubahan sifat
menjadi lebih maju (Simpson, 2006).
Stevia tephrophylla mempunyai hubungan kekerabatan yang lebih dekat dengan outgroup
dan percabangannya lebih panjang daripada spesies Stevia lainnya (Gambar 2). Hal tersebut menunjukkan bahwa S. tephrophylla lebih maju dibandingkan dengan Stevia lainnya yang kemungkinan disebabkan adanya mutasi yang lebih tinggi pada nukleotidanya sehingga nukleotida penyusun gen matK mempunyai perbedaan yang tinggi dengan Stevia lainnya. Pada Tabel 2 menunjukkan bahwa similaritas nukleotida S. tephrophylla paling rendah bila dibandingkan dengan spesies Stevia lainnya
yaitu 98,67-99,38 %.
Selain hubungan kekerabatan, similaritas dan perbedaan nukleotida gen matK antar spesies dari genus Stevia dapat ditentukan. Similaritas nukleotida di antara spesies Stevia
sangat tinggi yaitu 98,67-100%. Anggota klaster II mempunyai similaritas nukleotida 100%, hal
tersebut kemungkinan disebabkan nukleotida penyusun gen matK anggota klaster I tidak mengalami mutasi atau mengalami mutasi dengan subsitusi nukleotida yang sama. Menurut Hilu dan Liang (1997) pada level intrafamiliar perbedaan nukleotida tidak besar yaitu 1-8%. Matriks similaritas (Tabel 2) yang menunjukkan similaritas dan perbedaan nukleotida gen matK
yang terbentuk. Semakin banyak similaritas
nukleotida maka posisi pada pohon filogeni atau
hubungan kekerabatan juga dekat.
Penggunaan gen matK sebagai dasar penyusunan hubungan kekerabatan antar spesies dari genus Stevia belum bisa menghasilkan
klasifikasi yang maksimal karena posisi outgroup
masih di antara ingroup. Oleh karena itu dasar penyusunan hubungan kekerabatan Stevia juga harus dibandingkan atau ditambah dengan penanda molekuler lainnya misalnya 18S rRNA, gen rbcL (Rubisco) atau ndhF untuk menghasilkan
hubungan kekerabatan atau klasifikasi yang
kokoh. Selain itu karakter lainnya seperti sidik
jari DNA, fitokimia dan morfologi juga digunakan
untuk melihat kongruensinya.
KESIMPULAN
Hubungan kekerabatan filogenetik interspesifik anggota genus Stevia dapat diketahui
dengan menggunakan gen maturase K (matK). Genus Stevia berkelompok membentuk 3 klaster besar dan beberapa spesies Stevia mempunyai kemiripan sekuens nukleotida gen matK 100%.
Penggunaan gen matK sebagai dasar penyusunan hubungan kekerabatan antar spesies dari genus
Stevia belum bisa menghasilkan klasifikasi yang
maksimal karena posisi outgroup masih di antara
ingroup. Oleh karena itu dasar penyusunan hubungan kekerabatan Stevia juga harus dibandingkan atau ditambah dengan penanda molekuler lainnya.
DAFTAR PUSTAKA
Barthet M., and Hilu K. 2007. Expression of MatK:
Functional and Evolutionary Implication.
American Journal of Botany, 94(8):
1402-1412
Hadia HA., abdel-Razzak HS., and Hafez EE. 2008.
Assesment of genetic relationships among and within Cucurbita spesies using RAPD and ISSR markers. J. of Applied Sci. Research., 4 (5):515-525.
Hilu K., and Liang H. 1997. The MatK Gene: Sequence Variation and Application In Plant Systematics. American Journal of Botany,
84(6): 830-839
Hilu K., Muller K., Borsch T., Slotis DE., Soltis PS., Savolainen V., Chase MW., and Chatrou L.
2003. Angiosperm Phylogeny Based On
MatK Sequence Information. American Journal of Botany, 90(12): 1758-1776
Judd WS., Campbell CS., Kellogg EA. and Stevens PF. 1999. Plant Systematics: A Phylogenetic Approach. Sinaeur Associates, Inc. Massachusetts
Saitou N. and Nei M. 1987. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol, 4:
406-425.
Samuel, R., Gutermann W., Stuessy TF., and
Talavera S. 2006. Molecular Phylogenetics
Reveals Leotodon (Asteraceae, Lactuceae) To Be Diphyletic. American Journal of Botany, 98(3): 1193-1205
