TESIS
UJI ANTIKANKER KOMBINASI EKSTRAK ETIL ASETAT
DAUN POGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) DENGAN
DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
SECARA IN VITRO
Oleh:
MAINAL FURQAN
NIM 127014008
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
UJI ANTIKANKER KOMBINASI EKSTRAK ETIL ASETAT
DAUN POGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) DENGAN
DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
SECARA IN VITRO
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
Oleh:
MAINAL FURQAN
NIM 127014008
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS
UJI ANTIKANKER KOMBINASI EKSTRAK ETIL ASETAT
DAUN POGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) DENGAN
DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
SECARA IN VITRO
Oleh:
MAINAL FURQAN
NIM 127014008
Medan, Juni 2014 Menyetujui:
Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,
Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. NIP 195311281983031002 NIP 195301011983031004
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. NIP 195103261978022001 NIP 196602091992031003
Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195311281983031002
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP 195103261978022001
Mengetahui: Disahkan Oleh:
Ketua Program Studi, Dekan,
PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Mainal Furqan
Nomor Induk Mahasiswa : 127014008
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Uji Antikanker Kombinasi Ekstrak Etil Asetat
Daun Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) dengan Doksorubisin Terhadap Sel Kanker Payudara Secara In Vitro
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Senin tanggal
enam belas bulan Juni tahun dua ribu empat belas.
Mengesahkan:
Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt.
Anggota Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama Mahasiswa : Mainal Furqan
Nomor Induk Mahasiswa : 127014008
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Uji Antikanker Kombinasi Ekstrak Etil Asetat
Daun Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) dengan
Doksorubisin Terhadap Sel Kanker Payudara
Secara In Vitro
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah asli karya saya sendiri,
bukan plagiat dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat
karena kesalahan saya sendiri maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh
Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan
menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan dalam
keadaan sehat.
Medan, Juni 2014
Yang membuat pernyataan,
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala nikmat yang tak terhingga
sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis dengan judul
uji antikanker kombinasi ekstrak etil asetat daun poguntano (Picria fel-terrae
Lour.) dengan doksorubisin terhadap sel kanker payudara, sebagai salah satu
syarat untuk mencapai gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara. Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah
banyak mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril
maupun materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima
kasih yang tiada terhingga kepada:
1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu,
DTMH&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K).
2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr.
Sumadio Hadisahputra, Apt., yang telah menyediakan fasilitas dan
kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi
Fakultas Farmasi.
3. Ketua Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. Karsono, Apt., yang telah menyediakan
fasilitas bagi penulis selama menjadi mahasiswa Program Studi Magister
Farmasi Fakultas Farmasi.
4. Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. dan Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si.,
Apt., selaku Pembimbing yang selalu membimbing, mengarahkan,
memberikan dorongan dan semangat sehingga penulis terpacu untuk
5. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas,
M.Biomed., sebagai penguji.
6. Ibu Dra. Suwarti, M.Si., Apt., Kepala Laboratorium Farmakognosi beserta
staf.
7. Bapak Prof. Dr. Supargiyono Kepala Laboratorium Parasitologi Fakultas
Kedokteran Universitas Gadjah Mada beserta staf.
Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tiada
hentinya kepada keluarga tercinta Krisna Lestari, Danish Baariq Furqan dan
Ibunda Nuraini Ns, yang tiada hentinya berkorban dengan tulus ikhlas bagi
kesuksesan penulis. Serta buat rekan Fitri Yanti, Vonna Aulianshah, Denny Satria,
Sri Wastuti, Puji Lestari, Cut Masyitah dan semua pihak yang tidak dapat penulis
sebutkan satu per satu yang telah banyak membantu dalam penelitian tesis ini.
Kiranya Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan
bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan, sehingga
penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun. Akhir kata
semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi ilmu pengetahuan
khususnya bidang farmasi.
Medan, Juni 2014 Penulis,
UJI ANTIKANKER KOMBINASI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN POGUNTANO (Picria fel-terrae Lour.) DENGAN DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
SECARA IN VITRO
ABSTRAK
Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) merupakan salah satu tumbuhan obat di Sumatera Utara yang digunakan untuk mengatasi penyakit degeneratif dan metabolisme. Penelitian sebelumnya telah melakukan uji tentang efek sitotoksik dari ekstrak n-heksana daun poguntano dengan doksorubisin terhadap sel kanker payudara MCF-7 dan T47D secara in vitro. Ekstrak etil asetat daun poguntano (EEADP) juga memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara namun belum dilakukan penelitian lanjutannya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik dari EEADP, indeks selektivitas (IS), efek kombinasi dengan doksorubisin, mekanisme penghambatan siklus sel, mekanisme apoptosis serta penekanan ekspresi siklin D1 dan Bcl-2 pada sel kanker payudara.
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi bertingkat menggunakan pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya, n-heksana, etil asetat dan etanol serta dilakukan skrining fitokimia dan karakterisasi terhadap simplisia dan ekstrak. Ekstrak diuji sitotoksiknya terhadap sel MCF-7 dan T47D dengan menggunakan metode kolorimetri MTT (Microculture Tetrazolium Technique), indeks selektivitas, indeks kombinasi, mekanisme penghambatan siklus sel dan apoptosis dengan metode flowsitometri serta penekanan ekspresi siklin D1 dan Bcl-2 dengan metode imunositokimia.
Hasil uji sitotoksik EEADP pada sel kanker payudara MCF-7 dan sel T47D memberikan nilai IC50 sebesar 120,312 µg/mL dan 99,404 µg/mL. Pengujian
sitotoksik terhadap sel normal (sel Vero) menunjukkan EEADP selektif terhadap sel MCF-7 dan T47D (IS > 3). Selanjutnya kombinasi EEADP dengan doksorubisin pada sel MCF-7 memberikan efek sinergis kuat dengan konsentrasi optimal yaitu 15 µg/mL – 2 µg/mL (1/8 IC50 – 1/4 IC50). EEADP dikombinasikan
dengan doksorubisin terhadap sel T47D memberikan efek sinergis sangat kuat diperoleh konsentrasi optimal 12,5 µg/mL – 0,25 µg/mL (1/8 IC50 – 1/8 IC50).
EEADP dan kombinasinya dengan doksorubisin dilakukan uji penghambatan siklus sel terhadap sel MCF-7, memberikan hasil penghambatan siklus sel pada fase G0-G1 dan G2-M dengan persentase berturut-turut 70,01% dan 21,16%. Uji
penghambatan siklus sel EEADP dan kombinasinya dengan doksorubisin terhadap sel T47D diperoleh hasil menghambat siklus sel pada fase G0-G1
Kata kunci: Daun poguntano, doksorubisin, T47D, MCF-7, sitotoksik, indeks kombinasi, indeks selektivitas, flowsitometri, apoptosis, imunositokimia.
COMBINATION OF TEST ANTICANCER ETHYLACETATE EXTRACT POGUNTANO LEAVES (Picria fel - terrae Lour.)
WITH DOXORUBICIN ON BREAST CANCER CELLS AS IN VITRO
ABSTRACT
Poguntano (Picria fel - terrae Lour.) is one of the medicinal plants in Sumatera Utara used to treat degenerative and metabolic diseases. Previous research has conducted tests on the cytotoxic effects of n-hexane extract of leaves poguntano with doxorubicin against breast cancer cells MCF-7 and T47D in vitro. Ethylacetate extract of leaves poguntano (EAELP), also has potent cytotoxic effect against breast cancer cells, but subsequent studies have not been conducted. This study aims to determine the cytotoxic effects of EAELP, selectivity index (SI), the effect of combination with doxorubicin, the mechanism of cell cycle inhibition, the mechanism of apoptosis, suppression of the expression of cyclin D1 and Bcl-2 in breast cancer cells.
Preparation of extracts was done by graded with solvents on the level of polarity. The solvents were n-hexane, ethyl acetate and ethanol as well as performed phytochemical screening and characterization of simplex and extracts. Extracts were tested against T47D cells with MTT method (Microculture Tetrazolium Technique), selectivity index, combination of active extracts with doxorubicin, effects inhibition of cell cycle and apoptosis with flowcytometry method and suppression of cyclin D1 and Bcl-2 expression in T47D cells with immunocytochemistry method.
The test results of EAELP cytotoxic against breast cancer cells MCF-7 and T47D cells giving IC50 value of 120.312 mg/mL and 99.404 mg/mL. Tests
cytotoxic against normal (Vero) cells showed selective EEALP against MCF-7 and T47D (SI > 3). Furthermore EAELP combined with doxorubicin against MCF-7 cells provide strong synergistic effect by optimal concentrations present in concentrations EAELP - doxorubicin at 15 mg/mL - 2 mg/mL (1/8 IC50 - 1/4 IC50).
EAELP combined with doxorubicin on T47D cells provide a very strong synergistic effect obtained optimal concentration of 12.5 ug/mL - 0.25 ug/mL (1/8
IC50 - 1/8 IC50). EAELP and doxorubicin combination with cell cycle inhibition
test against MCF-7 cells with flowcytometry methods, giving results inhibit the cell cycle at G0-G1 phase and G2-M with a percentage of 70.01% respectively and
21.16%. EAELP cell cycle inhibition test and its combination with doxorubicin on T47D cells inhibits cell cycle results obtained in the G0-G1 phase with a
percentage of 62.33% respectively and 71.24% and can stimulate apoptosis by percentage 81.52%; 29.89% and can suppress the expression of cyclin D1 and Bcl-2. Based on result test, EAELP and doxorubicin combination showed selective on breast cancer cells, giving selective effects, inhibit the cell cycle and stimulate apoptosis on breast cancer cells.
Keywords: Poguntano leaves, doxorubicin, T47D, MCF-7, cytotoxic,
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
SURAT PERNYATAAN ... iv
KATA PENGANTAR ... v
ABSTRAK ... vii
ABSTRACT ... viii
DAFTAR ISI ... ix
DAFTAR TABEL ... xv
DAFTAR GAMBAR ... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ... xvii
DAFTAR SINGKATAN ... xx
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 6
1.3 Hipotesis ... 6
1.4 Tujuan Penelitian ... 7
1.5 Manfaat Penelitian ... 8
1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 9
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 10
2.1 Uraian Tumbuhan ... 10
2.1.2 Nama daerah ... 10
2.1.3 Nama asing ... 11
2.1.4 Morfologi tumbuhan ... 11
2.1.5 Khasiat tumbuhan ... 12
2.2 Ekstraksi ... 12
2.2.1 Maserasi ... 12
2.3 Kanker ... 13
2.3.1 Tinjauan umum kanker ... 13
2.3.2 Sifat kanker ... 14
2.3.3 Siklus sel ... 16
2.3.4 Mekanisme apoptosis ... 18
2.3.5 Karsinogenesis ... 20
2.3.6 P-glikoprotein ... 22
2.4 Kanker Payudara ... 24
2.5 Sel MCF-7 ... 27
2.6 Sel T47D ... 27
2.7 Sel Vero ... 28
2.8 Uji Sitotoksik ... 28
2.8.1 Uji sitotoksik menggunakan metode MTT ... 29
2.9 Antikanker ... 30
2.9.1 Doksorubisin dan resistensinya pada kanker payudara ... 31
2.9.2 Terapi kombinasi ... 33
BAB III METODE PENELITIAN ... 36
3.1 Alat dan Bahan ... 36
3.1.1 Alat-alat ... 36
3.1.2 Bahan-bahan ... 36
3.2 Penyiapan Bahan Tumbuhan ... 38
3.2.1 Pengumpulan bahan tumbuhan ... 38
3.2.2 Identifikasi tumbuhan ... 38
3.2.3 Pembuatan simplisia daun poguntano ... 38
3.3 Pembuatan Pereaksi ... 38
3.3.1 Besi (III) klorida 1% b/v ... 38
3.3.2 Larutan asam klorida 2 N ... 39
3.3.3 Timbal (II) asetat 0,4 M ... 39
3.3.4 Pereaksi Mayer ... 39
3.3.5 Pereaksi Molish ... 39
3.3.6 Pereaksi Dragendorff ... 39
3.3.7 Larutan kloralhidrat ... 39
3.3.8 Larutan asam sulfat 2 N ... 40
3.3.9 Pereaksi Bouchardat ... 40
3.3.10 Pereaksi Lieberman-Bouchardat ... 40
3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia dan Ekstrak ... 40
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik ... 40
3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik ... 40
3.4.4 Penetapan kadar sari larut dalam air ... 41
3.4.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol ... 42
3.4.6 Penetapan kadar abu total ... 42
3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam ... 42
3.5 Skrining Fitokimia ... 43
3.5.1 Pemeriksaan alkaloid ... 43
3.5.2 Pemeriksaan flavonoid ... 43
3.5.3 Pemeriksaan glikosida ... 44
3.5.3.1 pemeriksaan glikosida antrakuinon ... 44
3.5.4 Pemeriksaan saponin ... 44
3.5.5 Pemeriksaan tanin ... 45
3.5.6 Pemeriksaan steroid/triterpenoid ... 45
3.6 Pembuatan Ekstrak Etil asetat Daun Poguntano (Picria fel-terrae Lour.) ... 45
3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan ... 45
3.8 Pembuatan Media ... 46
3.8.1 Pembuatan media DMEM ... 46
3.8.2 Pembuatan media komplit DMEM ... 46
3.8.3 Pembuatan media RPMI ... 47
3.8.4 Pembuatan MK-RPMI ... 47
3.8.5 Pembuatan media M199 ... 48
3.8.6 Pembuatan media MK-M199 ... 48
3.9.1 Penumbuhan sel ... 49
3.16 Uji Penghambatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Siklin D1 dengan Metode Imunositokimia ... 57
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 58
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan ... 58
4.2 Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak ... 58
4.3 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak ... 60
4.4 Ekstraksi ... 63
4.5 Uji Sitotoksik EEADP Terhadap Sel MCF-7 dan T47D ... 64
4.6 Indeks Selektivitas ... 65
4.7 Uji Kombinasi EEADP - Doksorubisin terhadap Sel MCF-7 ... 66
4.8 Uji Kombinasi EEADP - Doksorubisin terhadap Sel T47D ... 68
4.9 Uji Penghambatan Siklus Selterhadap Sel MCF-7 ... 70
4.11 Uji Apoptosis ... 79
4.12 Pengamatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Siklin D1 ... 84
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 89
5.1 Kesimpulan ... 89
5.2 Saran ... 90
DAFTAR PUSTAKA ... 91
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
3.1 Interpretasi Nilai IK (Indeks Kombinasi) ... 54
4.1 Hasil karakterisasi SDP dan ekstrak daun poguntano ... 59
4.2 Hasil skrining fitokimia SDP ... 61
4.3 Hasil skrining fitokimia ekstrak daun poguntano ... 61
4.4 Nilai IK doksorubisin dengan EEADP terhadap sel MCF-7 ... 67
4.5 Nilai IK doksorubisin dengan EEADP terhadap sel T47D ... 69
4.6 Distribusi sel MCF-7 setelah perlakuan dengan berbagai konsentrasi EEADP, doksorubisin dan kombinasi keduanya ... 71
4.7 Distribusi sel T47D setelah perlakuan dengan berbagai konsentrasi EEADP, doksorubisin dan kombinasi keduanya ... 75
DAFTAR GAMBAR
4.9 Gambaran presentase kondisi sel T47D kontrol ... 80
4.10 Gambaran presentase kondisi sel T47D yang diberi 1 x IC50 EEADP ... 80
4.11 Gambaran presentase kondisi sel T47D yang diberi ½ IC50 EEADP ... 81
4.13 Gambaran presentase kondisi sel T47D diberi doksorubisin ... 82
4.14 Ekspresi Bcl-2 yang diberi berbagai perlakuan ... 85
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1 Hasil identifikasi tumbuhan poguntano
(Picria fel-terrae Lour.) ... 98
2 Gambar daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.) ... 99
3 Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk SDP ... 100
4 Bagan ekstraksi serbuk simplisia secara maserasi bertingkat ... 101
5 Perhitungan kadar air SDP, ENDP, EEADP dan EEDP ... 102
6 Perhitungan kadar sari larut air SDP, ENDP, EEADP dan EEDP... 103
7 Perhitungan kadar sari larut etanol SDP, ENDP, EEADP dan EEDP ... 104
8 Perhitungan kadar abu total SDP, ENDP, EEADP dan EEDP ... 105
9 Perhitungan kadar abu tidak larut asam SDP, ENDP, EEADP dan EEDP ... 106
10 Perhitungan persen sel hidup MCF-7 ... 107
11 Perhitungan persen sel hidup T47D ... 108
12 Perhitungan persen sel hidup Vero ... 109
13 Bagan pembuatan media RPMI ... 110
14 Bagan pembuatan MK-RPMI ... 111
15 Bagan penumbuhan sel ... 112
17 Bagan perhitungan sel ... 114
18 Bagan pembuatan larutan uji ... 115
19 Bagan pengujian sitotoksik ... 116
20 Bagan pengujian flowsitometri ... 117
21 Bagan pengujian imunositokimia ... 118
22 Sel MCF-7 dan T47D di bawah mikroskop ... 120
23 Sel Vero di bawah mikroskop ... 121
24 Microplate-96 sumuran ... 122
25 Hasil penentuan IC50 SPSS 17 ... 123
sel MCF-7 dengan analisis probit 26 Hasil penentuan IC50 sel T47D dengan analisa probit SPSS 17 .. 124
27 Hasil penentuan IC50 sel Vero dengan analisa probit SPSS 17 ... 125
28 Indeks Kombinasi MCF-7... 126
29 Indeks Kombinasi T47D ... 129
30 LAF, inkubator CO2 dan mikroskop inverted ... 132
DAFTAR SINGKATAN
ABCB1 ATP Binding Cassette Famili B 1
AIF Apoptosis Including Factor
Apaf-1 Apoptosis activating factor-1
ATP Adenosine-Tri Phosphat
Bcl-2 B cell Limphoma-2
Bcl-XL B cell Limphoma- Extra Large
BCRP Breast Cancer Resistance Protein
CAK CDK Activating Kinase
CDK Cyclin Dependent Kinase
CDKI Cyclin Dependent Kinase Inhibitor
Cdc25c Cell division cycle 25 homolog C
CI Combination Index
Cyc Cyclin
DR Death Reseptor
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Dimethyl Sulfoxide
DNA Deoxiribo Nukleid Acid
Dox Doxorubicin
ENDP Ekstrak n-heksana daun poguntano
EEADP Ekstrak etil asetat daun poguntano
EEDP Ekstrak etanol daun poguntano
ER Estrogen Reseptor
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
FADD Fas-Asociated Death Domain
FBS Fetal Bovine Serum
HER-2 Human Epidermal growth factor Receptor 2
HIV Human Immunodeficiency Virus
IAP Inhibitory Apoptosis
IK Indeks Kombinasi
MAPK Mitogen Activated Protein Kinase
MDR Multi Drug Resistance
MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida]
NFĸB Nuclear Factor kappa B
p21 Protein 21
p53 Protein 53
Pgp P-glikoprotein
PI Propidium Iodida
PKC Protein Kinase C
pRB Protein Retinoblastoma
PS Phosphatidylserine
RNA Ribo Nucleid Acid
ROS Reactive Oxygen Species
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SDP Simplisia Daun Poguntano
SDS Sodium Dodesil Sulfat
SI Selectivity Index
TNF Tumor Necrosis Factor
TNFR Tumor Necrosis Factor Receptor
