Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Pelaksanaan penelitian ini dimulai pada bulan Juni tahun 2014 hingga bulan Februari tahun 2015. Penelitian di lakukan di Laboratorium Kimia Dasar dan Analitik Jurusan Pendidikan Kimia Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Indonesia. Untuk tahapan sekuensing dilakukan di 1st BASE inc. Singapura.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pipet mikro, tabung eppendorf, sentrifuge, set alat PCR, autoklaf, set alat elektroforesis, dan lampu UV.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam tahap lisis yaitu buffer lisis (500 mM Tris-HCl pH 8,5, 10 mM EDTA pH 8, dan 5% Tween – 20), enzim proteinase K 10mg/mL, dan ddH2O. Bahan-bahan yang digunakan dalam proses PCR adalah primer HV2R 20pmol/µL, primer HV2F 20pmol/µL, buffer PCR 10x (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,0 pada suhu 25°C, 1% triton X-100, 15 mM MgCl2), enzim Taq DNA Polimerase 5unit/µ L, dan campuran dNTP 10 mM. Bahan-bahan yang digunakan pada elektroforesis gel agarosa yaitu agarosa, buffer TAE 1x (Tris-asetat 0,05 M dan EDTA 0,001 M pH 8), larutan EtBr 10µg/mL, loading buffer (sukrosa 50%, EDTA 0,1 M pH 8, bromfenol biru 0,1% pH 8), dan marker
pUC19/HinfI 60 µg/µ L.
3.3 Metode Penelitian
Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
PCR dengan elektroforesis gel agarosa, sekuensing urutan nukleotida daerah HV2 manusia dengan metode dideoksi sanger, dan analisis urutan nukleotida hasil sekuensing dengan menggunakan program SeqMan ver 4.00 DNASTAR. Secara keseluruhan penelitian dapat digambarkan seperti bagan alir pada Gambar 3.1.
Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian
3.3.1. Pengumpulan Sampel
Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
3.3.2. Isolasi mtDNA
Sampel akar rambut diisolasi secara enzimatik. Tahap awal sampel rambut sebanyak 5-7 helai dipotong ±1 cm dari bagian pangkal akarnya dan dimasukan ke dalam tabung eppendorf ukuran 1500µL yang telah disterilisasi menggunakan autoklaf. Kemudian ditambahkan ddH2O sebanyak 170µL. Selanjutnya ditambahkan 20 µL buffer lisis (500 mM Tris-HCl pH 8,5, 10 mM EDTA pH 8, dan 5% Tween-20), dan 10µL enzim proteinase K 10mg/mL hingga volume lisis tepat 200 µL. Kemudian tabung eppendorf yang berisis campuran reaksi dibungkus dengan parafilm dan diinkubasi selama 1 jam pada waterbath pada suhu ±55C°. Setelah itu dilakukan proses deaktifasi enzim proteinase K pada suhu ±95C° selama 10 menit. Kemudian campuran reaksi disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Setelah proses sentrifugasi supernatan diambil sebanyak 150 µL untuk selanjutnya digunakan sebagai templat pada proses PCR.
3.3.3. Amplifikasi Fragmen mtDNA Manusia secara In Vitro dengan Teknik
PCR
Proses amplifikasi fragmen daerah HV2 mtDNA manusia dilakukan dengan menggunakan primer HV2R dan HV2F. Campuran reaksi PCR dimasukan kedalam tabung eppendorf 200µL, terdiri dari 5 µL templat mtDNA hasil lisis; 0,5 µL primer HV2F (20 pmol/µL); 0,5 µL primer HV2R (20 pmol/µ L); 2,5 µL Buffer PCR 10x (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,0 pada suhu 25°C, 1% triton X-100, 15 mM MgCl2); 0,2 µL enzim taq DNA polimerase (5 unit/µL); 0,5 µL campuran dNTP 10 mM; dan 15,8 µL ddH20 sehingga volumenya mencapai 25 µL. Urutan nukleotida, ukuran, posisi dan suhu penempelan primer HV2F dan HV2R ditunjukan pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1. Urutan Nukleotida Primer HV2F dan HV2R
Primer Urutan 5’ ke 3’ Posisi Ukuran Suhu
Penempelan
HV2F GGT CTA TCA CCC
TAT TAA CCA C L 8-29
22
Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
HV2R CTG TTA AAA GTG
CAT ACC GCC H 429 - 409
21
Nukleotida 54,4°C
Proses PCR dilakukan dengan mesin GeneAmp® PCR System 2700 sebanyak 35 siklus. Tahap pertama dari proses PCR adalah tahap denaturasi awal yang dilakukan pada suhu 90°C selama 5 menit, kemudian dilanjutkan dengan siklus PCR yang terdiri dari 3 tahap yaitu tahap denaturasi yang dilakukan pada suhu 94°C selama 1 menit, tahap annealing yang dilakukan pada suhu 50°C selama 1 menit, dan tahap polimerisasi yang dilakukan pada suhu 72°C selama 4 menit. mtDNA hasil PCR kemudian disimpan pada suhu -20°C.
3.3.4. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Hasil amplifikasi mtDNA dari proses PCR yang telah dilakukan sebelumnya kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) menggunakan set alat elektroforesis sederhana. Komposisi gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,4 gram agarosa dalam 15 mL buffer TAE 1x. Larutan tersebut kemudian dipanaskan hingga semua agarosa larut sempurna, lalu didinginkan hingga suhu larutan mencapai ±60°C. Pada masing-masing sumur gel dimasukan 5 µL loading buffer (sukrosa 50%; EDTA 0,1 M pH 8; bromfenol biru 0,1 pH 8).
Proses elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE 1 sebagai media penghantar arus pada tegangan 100 volt selama 45 menit. Marker yang digunakan adalah pUC19/HinfI. Setelah proses elektroforesis selesai, hasil elektroforesis divisualisasikan dengan sinar UV dan difoto dengan kamera digital. Penentuan konsentrasi mtDNA dapat dilakukan dengan cara membandingkan intensitas pita sampel terhadap pita-pita dari marker yang telah diketahui konsentrasinya.
3.3.5. Penentuan Urutan Nukleotida Daerah HV2 mtDNA Manusia dengan
Sekuensing Metode Dideoksi Sanger
Idris Maliki, 2015
IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
Sanger menggunakan Automatic DNA Sequencer dengan primer HV2F (5’ -GGTCTATCACCCTATTAACCAC-3’).
