IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2.

(1)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH

HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI

DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Sebagian dari Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Sains Jurusan Pendidikan Kimia

Oleh

Idris Maliki

1005298

PROGRAM STUDI KIMIA

DEPARTEMEN PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

(2)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 2015

Oleh

Idris Maliki

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi sebagian dari syarat

memperoleh gelar Sarjana Sains pada

Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Pendidikan Indonesia

Juni 2015

Hak Cipta dilindungi undang-undang.

(3)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

LEMBAR PENGESAHAN

Diajukan oleh :

Idris Maliki

1005298

DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH :

Pembimbing I

Gun Gun Gumilar, S.Pd., M.Si. NIP.197906262001121001

Pembimbing II

Drs. Rahmat Setiadi, M.Sc. NIP.196004111984031002

Mengetahui,

(4)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu Dr. rer. nat. Ahmad Mudzakir, M.Si.

NIP. 196611211991031002

PERNYATAAN

Saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul “IDENTIFIKASI KANDIDAT

MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA

MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT

DIABETES MELITUS TIPE 2” ini sepenuhnya karya saya sendiri. Tidak ada bagian di dalamnya yang merupakan plagiat dari karya orang lain dan saya tidak melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai dengan etika keilmuan yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas pernyataan ini, saya siap menerima resiko/sanksi yang dijatuhkan kepada saya apabila di kemudian ditemukan adanya pelanggaran terhadap etika keilmuan dalam karya saya ini, atau ada klaim dari pihak lain terhadap keaslian karya saya ini.

Bandung, Juni 2015 Yang membuat pernyataan,

(5)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu ABSTRAK

Diabetes melitus tipe 2 (DMT2) merupakan penyakit kelainan metabolisme yang ditandai dengan meningkatnya kadar gula darah akibat tubuh menjadi tidak responsif terhadap insulin. Salah satu faktor penyebab DMT2 adalah keberadaan mutasi DNA Mitokondria (mtDNA) yang diturunkan dari garis keturunan ibu. Salah satu daerah pada mtDNA yang sering digunakan untuk proses identifikasi individu adalah daerah Hipervariabel II (HVII) karena berada di daerah D-Loop yang kemungkinan terjadinya mutasi tinggi. Oleh karena itu, dilakukan penelitian tentang variasi mutasi mtDNA daerah HVII pada empat generasi dengan riwayat DMT2 untuk mengetahui kandidat marker genetik DMT2. Sampel yang digunakan berupa akar rambut dari empat individu dalam satu garis keturunan. Tahapan yang dilakukan meliputi isolasi mtDNA, amplifikasi fragmen HVII mtDNA dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR), deteksi hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa, penentuan urutan nukleotida daerah HVII mtDNA dengan metode direct sekuensing, dan analisis hasil sekuensing dengan menggunakan program Seqman™ versi 4.00 DNASTAR. Berdasarkan hasil perbandingan antara urutan nukleotida sampel dengan revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) diperoleh enam mutasi yang sama pada keempat generasi, yaitu: A73G, T152C, G225A, A249del, A263G dan G316CA. Setelah dibandingkan dengan data sekunder Mitomap dan NCBI diperoleh satu mutasi yang menjadi kandidat marker genetik pemicu DMT2, yaitu mutasi G316CA.

(6)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu ABSTRACT

Diabetes mellitus type 2 (DMT2) is a metabolic disorder signed by rise of blood sugar caused by body insensitivity to insulin presence. One factor that caused DMT2 is presence of Mitochondial DNA (mtDNA) mutation that inherited maternally. Hypervariable II (HVII) region often linked to body disorder because located in D-loop region which have high possibility of mutation occurence. Therefore, a study about variance in mtDNA mutation on HVII region on four generation with history of DMT2 to look for DMT2 genetic marker candidate was conducted. The sample used in this study is hair root from four person in one maternal lineage. The method used is mtDNA isolation, amplification of mtDNA fragment by using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique, detection of PCR product with electrophoresis gel agarose, sequencing of nucleotide using direct sequencing, and analysis of sequencing result with Seqman™ version 4.00 DNASTAR. After comparing sample sequence with revised Cambridge Reference Sequence (rCRS), mutation that occur in four generation were found, those are : A73G, T152C, G225A, A249del, A263G and G316CA. After compared with data from secondary source, such as NCBI and Mitomap, G315CA mutation was found as a candidate for DMT2 genetic marker.

(7)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

KATA PENGANTAR

Bismillaahirrahmanirrahiim

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat, taufik, dan hidayah kepada penulis, serta atas seizin-Nya penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi dengan judul “Identifikasi Kandidat Marker Genetik Daerah Hipervariabel II DNA Mitokondria pada Empat Generasi Dengan Riwayat Diabetes Melitus Tipe 2”. Skripsi ini diajukan

untuk memenuhi sebagian dari syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Program Studi Kimia Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI Bandung.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari seluruh pihak demi kesempurnaan skripsi ini. Penulis juga mohon dimaafkan apabila terdapat kesalahan dalam skripsi ini.

Terima kasih atas segala doa, bantuan, dan partisipasi dari semua pihak yang terlibat dalam penyusunan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat dimanfaatkan sebaik mungkin demi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bandung, Juni 2015

(8)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

UCAPAN TERIMA KASIH

Dalam proses penyelesaian skripsi ini, penulis banyak menerima bantuan, masukan, maupun bimbingan dan dorongan dari semua pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada:

1. Bapak Gun Gun Gumilar, S.Pd., M.Si., selaku Pembimbing I Skripsi, Pembimbing Akademik dan Koordinator KBK Kimia Hayati yang senantiasa memberikan bimbingan, arahan, dan saran selama penulisan skripsi.

2. Bapak Drs. Rahmat Setiadi, M.Sc., selaku Pembimbing II yang senantiasa memberikan bimbingan, kritik, masukan, dan saran selama penulisan skripsi.

3. Ibu Dr. Ratnaningsih Eko S., M.Si, selaku Ketua Progam Studi Kimia yang telah memberikan bimbingan dan masukan.

4. Kedua orang tua tercinta, adik dan semua keluarga besar, terima kasih atas semua doa, motivasi, dan dukungan yang telah diberikan.

5. Egi Tritya Apdila, Devi Bentia Effendi, dan Yohanes Fajar K. selaku sahabat penulis yang selalu ada dalam suka maupun duka untuk menyelesaikan skripsi dan Rekan-rekan kelas kimia C 2010 yang senantiasa memberikan dukungan kepada penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.

6. Semua pihak yang tidak dapat disebut satu per satu yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi.

(9)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

(10)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

DAFTAR ISI

ABSTRAK ... i

KATA PENGANTAR ... iii

UCAPAN TERIMA KASIH ... iv

DAFTAR ISI... v

DAFTAR GAMBAR ... vi

DAFTAR TABEL ... viii

DAFTAR LAMPIRAN………...ix

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 3

1.3 Tujuan Penelitian ... 3

1.4 Manfaat Penelitian ... 3

1.5 Struktur Organisasi Skripsi ... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Diabetes Melitus ... 5

2.2 Mitokondria ... 6

2.3 DNA Mitokondria ... 7

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 11

2.5 Elektroforesis Gel Agarosa ... 12

2.6 Sekuensing DNA ... 14

2.7 revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) ... 15

2.8 Mitomap dan National Center for Biotecnology Information (NCBI) ... 16

(11)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

3.2 Alat dan Bahan ... 17

3.2.1 Alat ... 17

3.2.2 Bahan ... 17

3.3 Metode Penelitian ... 18

3.3.1 Pengumpulan Sampel ... 18

3.3.2 Isolasi mtDNA ... 18

3.3.3 Amplifikasi Fragmen mtDNA ... 19

3.3.4 Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa ... 20

3.3.5 Penentuan Urutan Nukleotida Daerah HV2 mtDNA Manusia dengan Sekuensing Metode Dideoksi Sanger ... 20

3.3.6 Analisis Urutan Nukleotida Daerah HV2 mtDNA Manusia ... 21

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 4.1 Karakteristik Sampel mtDNA... 22

4.2 Hasil lisis Sampel ... 23

4.3 Hasil Amplifikasi fragmen HVII mtDNA dengan teknik PCR ... 24

4.4 Hasil Sequensing Urutan Nukleotida Daerah HVII mtDNA ... 25

4.5 Analisis mutasi pada daerah HVII mtDNA ... 27

4.6 Perbandingan Mutasi Sampel Dengan Data Sekunder ... 29

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 34

DAFTAR PUSTAKA ... 35

(12)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Tahapan Patogenesis Diabetes Melitus Tipe 2 ... 6

Gambar 2.2. Peta DNA Mitokondria Manusia ... 9

Gambar 2.3. Struktur Basa Nitrogen Penyusun DNA ... 11

Gambar 2.4. Struktur Ethidium bromida ... 14

Gambar 2.5. Fragmen urutan nukleotida rCRS dari 1-480 ... 15

Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian ... 18

Gambar 4.1. Hasil deteksi produk PCR dengan elektroforesis gel agarosa ... 25

Gambar 4.2. Tampilan elektroforegram hasil sekuensing sampel DM01 ... 26

Gambar 4.3. Tampilan analisis mutasi pada sampel DM01 dengan menggunakan program SeqMan™ ver 4.00 DNASTAR ... 27

Gambar 4.4. Analisis jenis mutasi yang sama pada sampel DM01, DM02, DM03 dan DM04 dengan menggunakan program SeqMan™ ver 4.00 DNASTAR. ... 28

(13)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

DAFTAR TABEL

Tabel 3.1. Urutan Nukleotida Primer HV2F dan HV2R ... 19

Tabel 4.1. Data Individu Sampel mtDNA Manusia ... 22

Tabel 4.2. Matriks hasil perbandingan sampel dengan rCRS ... 28

(14)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Elektroforegram Sampel ... 39

Lampiran 2. Sumber Data Sekunder ... 43

(15)

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Diabetes adalah penyakit kronis yang muncul ketika tubuh tidak dapat memproduksi insulin yang cukup atau tidak dapat menggunakan insulin secara efektif. Penderita diabetes tidak dapat menyerap glukosa dengan baik dan glukosa akan tetap tersirkulasi dalam darah (kondisi ini dikenal sebagai hiperglikemia) dan berakibat rusaknya jaringan tubuh. Kerusakan ini dapat menyebabkan kelumpuhan hingga komplikasi kesehatan yang dapat menyebabkan resiko kematian (Olokoba et al., 2012).

Pada tahun 2013, Sekitar 5,1 juta orang di dunia pada rentang umur 20 hingga 79 tahun meninggal disebabkan diabetes. Angka kematian oleh diabetes pada tahun 2013 menunjukan peningkatan 11% dari angka kematian pada tahun 2011. Data kematian oleh diabetes mungkin saja lebih besar dari yang tercatat, karena diabetes jarang dituliskan pada akta kematian sebagai penyebab kematian.

Indonesia adalah negara dengan jumlah penderita diabetes terbesar ke-7 di dunia, terdapat 7,6 juta pasien diabetes dan 12,6 juta orang memiliki prediabetes pada tahun 2012, Pada tahun 2030 jumlah penderita diabetes diprediksi mencapai 11,8 juta, dengan laju pertumbuhan penderita pertahun sebesar 6%, melebihi laju pertumbuhan penduduk pertahun indonesia. Makanan pokok mayoritas penduduk Indonesia adalah beras putih, dan biasa dikonsumsi melebihi kebutuhan karbohidrat harian sehingga menyebabkan kadar gula yang relatif tinggi sangat kuat diasosiasikan dengan diabetes (Novo Nordisk, 2013).

(16)

2

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

faktor genetik dan DMT2, memiliki keluarga dengan sejarah DM tipe II meningkatkan resiko terjangkit DMT2 (Olokoba et al., 2012).

Mitokondria adalah organel sitoplasmik yang mengandung DNA sendiri dan berperan penting dalam pembentukan energi. Mitokondria bertanggung jawab atas mayoritas energi yang didapat dari pemecahan karbohidrat dan asam lemak. Pada mitokondria terdapat DNA mitokondria (mtDNA) yang mengkode tRNA, rRNA dan beberapa protein mitokondria, kerja dari mitokondria melibatkan protein yang terkode dari genomnya sendiri dan ditranslasikan dalam organelnya (Copper dan Housman, 2007).

Mitokondria memiliki sistem genetiknya sendiri yang berbeda dari DNA inti, mtDNA berbentuk sirkular dan terdapat dalam banyak salinan per organel. Mayoritas mtDNA mengkode beberapa protein yang merupakan komponen esensial untuk sistem fosforilasi oksidatif, mtDNA juga mengkode RNA ribosom dan mayoritas RNA transfer yang dibutuhkan untuk proses translasi urutan pengkode protein dalam mitokondria (Copper dan Housman, 2007).

Kelainan mtDNA manusia menyebabkan berbagai macam penyakit, yang dapat mempengaruhi organ manapun, muncul pada umur berapapun dan bergantung pada dimana letak mutasinya, dapat diturunkan dari autosom, kromosom X atau secara maternal. Sampai saat ini penyakit yang disebabkan oleh kelainan mtDNA belum dapat disembuhkan dan perawatan yang ada hanya untuk meredakan gejala yang muncul (Nunnari dan Soumalainen, 2012).

Mitokondria berpengaruh dalam sekresi insulin dari beta sel pankreas. Sekresi insulin oleh beta sel pankreas sangat bergantung pada adenosin trifosfat yang disintesis dari fosforilasi oksidatif pada mitokondria. Protein esensial yang dibutuhkan untuk fosforilasi oksidatif disintesis di dalam mitokondria dari mtDNA. Diabetes maternal salah satunya dapat disebabkan oleh mutasi pada mtDNA (Chinnery et al., 2007).

(17)

3

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

generasi dengan riwayat diabetes (Purnamasari, 2013) namun belum ada penelitian yang menganalisis variasi mutasi pada daerah Hipervariabel II (HV II) pada empat generasi dengan riwayat diabetes. Pada penelitian ini akan dilakukan analisis variasi mutasi mtDNA daerah HVII pada empat generasi dengan riwayat DMT2 untuk mengetahui kandidat marker genetik DMT2.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah dikemukakan, masalah utama yang akan diteliti adalah “Bagaimana kandidat marker genetik daerah hipervariabel II DNA mitokondria pada empat generasi dengan riwayat DMT2?”. Untuk menentukan langkah penelitian, rumusan masalah dijabarkan menjadi sub masalah sebagai berikut :

1. Bagaimana variasi mutasi HVII pada setiap generasi dengan riwayat DMT2? 2. Apakah mutasi di daerah HVII yang ditemukan diwariskan pada setiap

generasi?

3. Mutasi apakah di daerah HVII mtDNA yang dapat menjadi kandidat marker genetik DMT2?

1.3 Tujuan

1. Mengidentifikasi variasi mutasi HVII pada setiap generasi dengan riwayat DMT2.

2. Mengetahui pewarisan mutasi di daerah HVII yang terdapat pada setiap generasi dengan riwayat DMT2.

3. Mengetahui mutasi di daerah HVII mtDNA yang dapat menjadi kandidat marker genetik DMT2.

1.4 Manfaat

(18)

4

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

mtDNA pada generasi dengan riwayat DMT2, dan memberikan kontribusi terhadap basis data mtDNA manusia yang berhubungan dengan penyakit DMT2 yang dapat dimanfaatkan dalam berbagai bidang, terutama bidang medis.

1.5. Struktur Organisasi Skripsi

Skripsi ini tersusun atas lima bab terdiri dari bab I tentang pendahuluan, bab II tentang tinjauan pustaka, bab III tentang metode penelitian, bab IV tentang hasil dan pembahasan, serta bab V tentang kesimpulan dan saran.

(19)

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian

Pelaksanaan penelitian ini dimulai pada bulan Juni tahun 2014 hingga bulan Februari tahun 2015. Penelitian di lakukan di Laboratorium Kimia Dasar dan Analitik Jurusan Pendidikan Kimia Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Indonesia. Untuk tahapan sekuensing dilakukan di 1st BASE inc. Singapura.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pipet mikro, tabung eppendorf, sentrifuge, set alat PCR, autoklaf, set alat elektroforesis, dan lampu UV.

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam tahap lisis yaitu buffer lisis (500 mM Tris-HCl pH 8,5, 10 mM EDTA pH 8, dan 5% Tween – 20), enzim proteinase K 10mg/mL, dan ddH2O. Bahan-bahan yang digunakan dalam proses PCR adalah primer HV2R 20pmol/µL, primer HV2F 20pmol/µL, buffer PCR 10x (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,0 pada suhu 25°C, 1% triton X-100, 15 mM MgCl2), enzim Taq DNA Polimerase 5unit/µ L, dan campuran dNTP 10 mM. Bahan-bahan yang digunakan pada elektroforesis gel agarosa yaitu agarosa, buffer TAE 1x (Tris-asetat 0,05 M dan EDTA 0,001 M pH 8), larutan EtBr 10µg/mL, loading buffer (sukrosa 50%, EDTA 0,1 M pH 8, bromfenol biru 0,1% pH 8), dan marker

pUC19/HinfI 60 µg/µ L.

3.3 Metode Penelitian

(20)

18

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

PCR dengan elektroforesis gel agarosa, sekuensing urutan nukleotida daerah HV2 manusia dengan metode dideoksi sanger, dan analisis urutan nukleotida hasil sekuensing dengan menggunakan program SeqMan ver 4.00 DNASTAR. Secara keseluruhan penelitian dapat digambarkan seperti bagan alir pada Gambar 3.1.

Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian

3.3.1. Pengumpulan Sampel

(21)

19

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

3.3.2. Isolasi mtDNA

Sampel akar rambut diisolasi secara enzimatik. Tahap awal sampel rambut sebanyak 5-7 helai dipotong ±1 cm dari bagian pangkal akarnya dan dimasukan ke dalam tabung eppendorf ukuran 1500µ L yang telah disterilisasi menggunakan autoklaf. Kemudian ditambahkan ddH2O sebanyak 170µL. Selanjutnya ditambahkan 20 µL buffer lisis (500 mM Tris-HCl pH 8,5, 10 mM EDTA pH 8, dan 5% Tween-20), dan 10µL enzim proteinase K 10mg/mL hingga volume lisis tepat 200 µL. Kemudian tabung eppendorf yang berisis campuran reaksi dibungkus dengan parafilm dan diinkubasi selama 1 jam pada waterbath pada suhu ±55C°. Setelah itu dilakukan proses deaktifasi enzim proteinase K pada suhu ±95C° selama 10 menit. Kemudian campuran reaksi disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Setelah proses sentrifugasi supernatan diambil sebanyak 150 µL untuk selanjutnya digunakan sebagai templat pada proses PCR.

3.3.3. Amplifikasi Fragmen mtDNA Manusia secara In Vitro dengan Teknik

PCR

Proses amplifikasi fragmen daerah HV2 mtDNA manusia dilakukan dengan menggunakan primer HV2R dan HV2F. Campuran reaksi PCR dimasukan kedalam tabung eppendorf 200µL, terdiri dari 5 µL templat mtDNA hasil lisis; 0,5 µL primer HV2F (20 pmol/µL); 0,5 µL primer HV2R (20 pmol/µ L); 2,5 µL Buffer PCR 10x (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9,0 pada suhu 25°C, 1% triton X-100, 15 mM MgCl2); 0,2 µL enzim taq DNA polimerase (5 unit/µL); 0,5 µL campuran dNTP 10 mM; dan 15,8 µL ddH20 sehingga volumenya mencapai 25 µL. Urutan nukleotida, ukuran, posisi dan suhu penempelan primer HV2F dan HV2R ditunjukan pada Tabel 3.1.

Tabel 3.1. Urutan Nukleotida Primer HV2F dan HV2R

Primer Urutan 5’ ke 3’ Posisi Ukuran Suhu

Penempelan

HV2F GGT CTA TCA CCC

TAT TAA CCA C L 8-29

22

(22)

20

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu HV2R CTG TTA AAA GTG

CAT ACC GCC H 429 - 409

21

Nukleotida 54,4°C

Proses PCR dilakukan dengan mesin GeneAmp® PCR System 2700 sebanyak 35 siklus. Tahap pertama dari proses PCR adalah tahap denaturasi awal yang dilakukan pada suhu 90°C selama 5 menit, kemudian dilanjutkan dengan siklus PCR yang terdiri dari 3 tahap yaitu tahap denaturasi yang dilakukan pada suhu 94°C selama 1 menit, tahap annealing yang dilakukan pada suhu 50°C selama 1 menit, dan tahap polimerisasi yang dilakukan pada suhu 72°C selama 4 menit. mtDNA hasil PCR kemudian disimpan pada suhu -20°C.

3.3.4. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Hasil amplifikasi mtDNA dari proses PCR yang telah dilakukan sebelumnya kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) menggunakan set alat elektroforesis sederhana. Komposisi gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,4 gram agarosa dalam 15 mL buffer TAE 1x. Larutan tersebut kemudian dipanaskan hingga semua agarosa larut sempurna, lalu didinginkan hingga suhu larutan mencapai ±60°C. Pada masing-masing sumur gel dimasukan 5 µL loading buffer (sukrosa 50%; EDTA 0,1 M pH 8; bromfenol biru 0,1 pH 8).

Proses elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE 1 sebagai media penghantar arus pada tegangan 100 volt selama 45 menit. Marker yang digunakan adalah pUC19/HinfI. Setelah proses elektroforesis selesai, hasil elektroforesis divisualisasikan dengan sinar UV dan difoto dengan kamera digital. Penentuan konsentrasi mtDNA dapat dilakukan dengan cara membandingkan intensitas pita sampel terhadap pita-pita dari marker yang telah diketahui konsentrasinya.

3.3.5. Penentuan Urutan Nukleotida Daerah HV2 mtDNA Manusia dengan

Sekuensing Metode Dideoksi Sanger

(23)

21

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Sanger menggunakan Automatic DNA Sequencer dengan primer HV2F (5’ -GGTCTATCACCCTATTAACCAC-3’).

3.3.6. Analisis Urutan Nukleotida Daerah HV2 mtDNA Manusia

Urutan nukleotida pada daerah HV2 mtNDA manusia hasil sekuensing dianalisis dengan menggunakan SeqMan™ versi 4.00 DNASTAR. Proses analisisnya dilakukan dengan cara memasukan urutan nukleotida sampel dan urutan DNA standar. Dalam elektroforegram, setiap jenis basa nukleotida menunjukan warna dan tinggi puncak yang berbeda. Basa adenin (A) berwarna hijau, basa guanin (G) berwarna hitam, basa sitosin (C) berwarna biru, dan basa timin (T) berwarna merah. Urutan DNA standar yang digunakan adalah urutan dari revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) yang telah direvisi (Andrew et al., 1999) program akan secara otomatis menandai basa pada posisi tertentu

(24)

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :

1. Pada keempat sampel, ditemukan enam jenis mutasi pada daerah HVII mtDNA, yaitu mutasi A73G, T152C, G225A, A249del, A263G, dan G316CA.

2. Seluruh mutasi yang ditemukan adalah mutasi yang diwariskan pada empat generasi.

3. Kandidat mutasi pada empat generasi yang dapat dijadikan marker genetik untuk DMT2 adalah mutasi G316CA.

5.2. Saran

1. Mutasi G316CA yang diduga menjadi marker genetik DMT2 perlu diteliti lebih lanjut pengaruhnya terhadap DMT2.

(25)

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

DAFTAR PUSTAKA

Achilli, A., Olivieri, A., Pala, M., Hooshiar, K.B., Carossa, V., Perego, U.A., Gandini, F., Santoro, A., Battaglia, V., Grugni, V., Lacioni, H., Sirolla, C., Bonfiqli, A.R., Cormio, A., Boemi, M., Testa, I., Semino, O., Ceriello, A., Spazzafumo, L., Gadaleta, M.N., Marra, M., Testa, R., Franseschi, C., dan Torroni, A. (2011) Mitochondrial DNA Backgrounds Might Modulate Diabetes Complications Rather than T2DM as a Whole. PLoS ONE, 6(6): e21029. doi:10.1371/journal.pone.0021029

Anderson, S., Bankier, A.T., Barrell, B.G., de Bruijn, M.H., Coulson, A.R., Drouin, J., Eperon, I.C., Nierlich, D.P., Roe, B.A., Sange,r F., Schreier, P.H., Smith, A.J., Staden, R., dan Young, I.G. (1981). Sequence and organization of the Human Mitochondrial Genome. Nature, 290, hlm. 457-465.

Andrew, R.M., Kubacka, I., Chinnery, P.F., Lightowlers, R.N., Turnbull, D.M., dan Howell, N. (1999). Reanalysis and revision of the Cambridge Reference Sequence for Human Mitochondrial DNA. Nature Genetics, 23, hlm. 147.

Bogenhagen, D.F. (1999). Repair of mtDNA in vertebrates. The American Journal of Human Genetics, 64, hlm. 1276-1281.

Chen Y.S., Torroni, A., Excoffier, L., Santachiara-Benerecetti, A.S. dan Wallace DC. (1995). Analysis of mtDNA variation in African populations reveals the most ancient of all human continent-specific haplogroups. The American Journal of Human Genetics, 57, hlm. 133-149.

Chinnery P.F., Mowbray C, Patel SK, Elson JL, Sampson M, Hitman GA, McCarthy MI, Hattersley AT, Walker M. (2007). Mitochondrial DNA haplogroups and type 2 diabetes: a study of 897 cases and 1010 controls. Journal of Medical Genetics, 44.

Chomyn, A. (1998). The myoclonic epilepsy and ragged-red fiber mutation provides new insights into human mitochondrial function and genetics. The American Journal of Human Genetics, 62, hlm. 745-751.

Cooper, M.G. dan Hausman, R.F. (2007). The Cell A molecular approach, 4th Ed Washington, D.C : ASM Press.

(26)

36

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

DeFronzo, R.A. (1988). Lilly lecture 1987. The triumvirate: beta-cell, muscle, liver. A collusion responsible for NIDDM. Diabetes, 37, hlm. 667-687.

Dorra, G., Houshmand, M., Shafa, S. P. M., Larijani, B., Arman, A., dan Sanati, M. H. (2005). Polymorphism in non-coding region of Human Mitochondrial DNA in Persian Diabetes Type II Patients.Scientific Information Database.

Franca, L.T.C., Carrilho, E.K., dan Tarso, B.L.K. (2002). A review of DNA sequencing techniques. Quarterly Review of Biophysic. 35, 2, hlm. 169-200.

Garibyan, Lilit dan Avashia, Nidhi. (2013). Polymerase Chain Reaction, Journal of Investigative Dermatology 133, e6. doi:10.1038/jid.2013.1.

Holt, Richard I. G., (2004). Diagnosis, epodemiology and pathogenesis of diabetes mellitus : an update for psychiatrists. British Journal Of Psychiatry, 47, hlm. 55-63.

http://www.dnatestingcentre.com/Mitochondrial.htm

http://www.mitomap.org/bin/view.pl/MITOMAP/PolymorphismsControl http://www.mitomap.org/MITOMAP/HumanMitoSeq

Kaku, K. (2010) Pathopshysiology of type 2 diabetes and its treatment policy. Japan Medical Association Journal 53, 1, hlm. 41-46.

Kirkpatrick, F. H. (1990). Overview of agarose gel properties. Current Communications in Cell and Molecular Biology, 1, hlm. 9-22.

Kino, T., Emanuel, S., Evangelia, C., Takamasa, I., Paul, D., Chantal, M., Anton, A., Irini, M., Heiner, W., George, P.C. dan James, H.S. (2006). Rho Family Guanine Nucleotide Exchange Factor Brx Couples. The Journal Of Biological Chemistry, 281, 14, hlm. 9118–9126.

Lee, S.V., dan Bahaman, A.R. (2010). Modifiedgel preparation for distinct DNA fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine, 27, hlm. 351-354.

Lightowlers, R.N., Chinnery, P.F., dan Turnbull, D.M. (1997). Mammalian Mitochondrial Genetics : Heredity, heteroplasmy and disease. Trends in Genetics, 13, hlm. 450-455.

Liou, Chia-Wei., Jin-Bor Chen, Mao-Meng Tiao, Shao-Wen Weng, Tiao-Lai Huang, Jiin-Haur Chuang, Shang-Der Chen, Yao-Chung Chuang, Wen-Chin Lee, Tsu-Kung Lin, dan PeiWen Wang. (2012). Mitochondrial DNA Coding and Control Region Variants as GeneticRisk Factors for Type 2 Diabetes. Diabetes, 61, hlm. 2642 – 2651.

(27)

37

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Lott M.T., Leipzig, J.N, Derbeneva, O., Xie, H.M., Chalkia, D., Sarmady, M., Procaccio, V., dan Wallace, D.C. (2014). mtDNA Variation and Analysis Using MITOMAP and MITOMASTER. Current Protocols in Bioinformatics, 1, 123, hlm. 1.23.1– 1.23.26.

Manfredi,G., Thyagarajan, D., Papadopoulou, L.C., Pallotti, F. dan Schon, E.A. (1997). The fate of human sperm-derived mtDNA in somatic cells. The American Journal of Human Genetics, 61, hlm. 953-960.

Ng, M.C., Lee, S.C., Ko, G.T., Li, J.K., So, W.Y., Hashim, Y., Barnett, A.H., Mackay, I.R., Critchley, J.A., Cockram, C.S., dan Chan, J.C. (2001). Familial Early-Onset Type 2 Diabetes in Chinese Patients. Diabetes Care, 24, hlm. 663– 671.

Novo Nordisk. (2013). Changing Diabetes in Indonesia . The Blueprint for Change.

Nunnari, Jodi dan Soumalainen, Anu. (2012). Mitochondria : In Sickness and in health. Cell, 148, 6, hlm. 1145–1159.

Olokoba, A.B., Olusegun, A.O., dan Lateefat B.O. (2012). Type 2 Diabetes Mellitus: A Review of Current Trends. Oman Medical, 27, 4, hlm. 269-273.

Ozougwu, J. C., Obimba, K. C., Belonwu, C. D., dan Unakalamba, C. B. (2013). The pathogenesis and pathopsysiology of type 1 and type 2 diabetes mellitus. Journal of Physiology and Pathophysiology, 4, 4, hlm. 46-57.

Pagliarini, D.J., Calvo, S.E., Chang, B., Sheth, S.A., Vafai, S.B., Ong, S.E., Walford, G.A., Sugiana, C., Boneh, A., Chen, W.K., Hill, D.E., Vidal, M., Evans, J.G., Thorburn, D.R., Carr, S.A., dan Mootha, V.K. (2008). A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology. Cell, 134, hlm. 112–123.

Patty, M.E., dan Corvera, S. (2010). The Role of Mitochondria in the Pathogenesis of Type 2 Diabetes. Endocrine Reviews, 31, 3, hlm. 364–395.

Petruzzella, V., Tiranti, V., Fernandez, P., Ianna, P., Carrozzo, R., dan Zeviani, M. (1998). Identification and characterization of hu-man cDNAs specific to BCS1, PET112, SCO1, COX15, and COX11, five genes involved in the formation and func-tion of the mitrochondrial respiratory chain. Genomics, 54, hlm. 494–504.

Poulton, J., Macaulay, V., dan Marchington, D.R. (1998). Is the bottleneck cracked? The American Journal of Human Genetics, 62, hlm. 752-757.

Purnamasari, Yunita. (2013). Varian Genetik Daerah Hipervariabel I DNA Mitokondria Pada Empat Generasi Dengan Riwayat Diabetes Melitus Tipe 2. Skripsi Kimia Universitas Pendidikan Indonesia.

Purnomo, Sudjino Trijoko dan Suwarno, Hadi Susanto. (2009). Biologi Kelas XI untuk SMA dan MA. Jakarta: Pusat perbukuan, Departemen Pendidikan Nasional.

(28)

38

Idris Maliki, 2015

IDENTIFIKASI KANDIDAT MARKER GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL II DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2

Rao P.N, Shidhar. (2006). Polymerase Chain Reaction. Tersedia Online http://www.microrao.com/micronotes/pcr.pdf (Diakses 18 - Feb - 2014).

Richter C, Park JW dan Ames BN. (1988). Normal oxidative damage to mito-chondrial and nuclear DNA is extensive. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85, hlm. 6465–6467.

Sambrook, J., dan Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Schon EA, Bonilla E & DiMauro S. (1997). Mitochondrial DNA mutations and pathogenesis. The Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 29, hlm. 131-149.

Soini, H.K., Moilanen JS, Finnila S, Majamaa K. (2012) Mitochondrial DNA sequence variation in Finnish patients with matrilineal diabetes mellitus. BMC Research Notes, 5, 350.

Starkov, AA. (2008). The role of mitochondria in reactive oxygen species metabolism and signaling. Annals of the New York Academy of Sciences, 1147, hlm. 37–52.

Taylor Robert W. dan Turnbull, Doug M. (2005). Mitochondrial DNA Mutations In Human ___Disease. Nature Reviews, 6.

Tuomi, Tiinamaija. (2005). Type 1 and type 2 diabetes what do they have in common? Diabetes, 54, 2.

Wallace, D.C., (1994). Mitochondrial DNA mutations in diseases of energy metabolism. The Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 26, hlm. 241-250.

Wallace, D.C., (1995). Mitochondrial DNA variation in human evolution and disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91, hlm. 8739-8746.

Wallace, D.C., (1997). Mitochondrial DNA mutations and bioenegetic defects in aging and degenerative diseases. In: Rosenberg RN, Prusiner SB, DiMauro S, Barchi RL (eds) The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease. Butterworth-Heinemann, Boston, hlm. 237-269.

Wallace, DC. (2005). A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annual Review of Genetics, 39, hlm. 359-407.