VARIAN GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL I (HVI) DNA
MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Sebagian dari Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains
dalam Bidang Kimia
Oleh:
Yunita Purnamasari 0905781
PROGRAM STUDI KIMIA JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
VARIAN GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL I (HVI) DNA
MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT DIABETES MELITUS TIPE 2
Oleh
Yunita Purnamasari
Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
© Yunita Purnamasari 2013
Universitas Pendidikan Indonesia
Oktober 2013
Hak Cipta dilindungi undang-undang.
Skripsi ini tidak boleh diperbanyak seluruhya atau sebagian,
LEMBAR PENGESAHAN
VARIAN GENETIK DAERAH HIPERVARIABEL I (HVI) DNA MITOKONDRIA PADA EMPAT GENERASI DENGAN RIWAYAT
DIABETES MELITUS TIPE 2
Oleh
Yunita Purnamasari 0905781
Disetujui dan disahkan untuk ujian sidang oleh:
Pembimbing I,
Gun Gun Gumilar, S.Pd, M.Si. NIP. 197906262001121001
Pembimbing II,
Drs. Rahmat Setiadi, M.Sc. NIP.196004111984031002
Mengetahui,
Ketua Jurusan Pendidikan Kimia
PERNYATAAN
Saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul “Varian Genetik Daerah Hipervariabel I (HVI) DNA Mitokondria pada Empat Generasi dengan Riwayat Diabetes Melitus Tipe 2” ini sepenuhnya karya saya sendiri. Tidak ada
bagian di dalamnya yang merupakan plagiat dari karya orang lain dan saya tidak
melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai
dengan etika keilmuan yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas pernyataan
ini, saya siap menanggung resiko atau sanksi yang dijatuhkan kepada saya apabila
di kemudian hari ditemukan adanya pelanggaran terhadap etika keilmuan dalam
karya ini, atau ada klaim dari pihak lain terhadap keaslian karya saya ini.
Bandung, Oktober 2013
Yang membuat pernyataan,
Yunita Purnamasari
ABSTRAK
Diabetes melitus tipe 2 (DMT2) merupakan penyakit kelainan metabolisme yang ditandai dengan meningkatnya kadar gula darah akibat tubuh tidak merespon keberadaan insulin. Salah satu faktor penyebab DMT2 adalah keberadaan mutasi DNA Mitokondria (mtDNA) yang diturunkan dari garis keturunan ibu (maternally
inherited). Salah satu daerah pada mtDNA yang sering dihubungkan dengan
penyakit adalah daerah Hipervariabel I (HVI) karena laju mutasinya tinggi.Oleh karena itu, dilakukan penelitian terhadap daerah HVI mtDNA pada empat generasi dengan riwayat diabetes melitus tipe 2 dan pewarisan mutasi yang menyebabkan DMT2 untuk mengetahui profil genetiknya. Tahapan yang dilakukan meliputi lisis terhadap sampel akar rambut, amplifikasi fragmen HVI mtDNA dengan Polymerase Chain Reaction (PCR), deteksi hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa, pengukuran konsentrasi mtDNA dengan spektrofotometri UV-Vis, penentuan urutan nukleotida daerah HVI mtDNA dengan metode direct sekuensing, dan analisis hasil sekuensing dengan menggunakan program SeqmanTM versi 4.00. Berdasarkan hasil perbandingan
urutan nukleotida antara data penelitian dan revised Cambridge Reference
Sequence (rCRS) diperoleh enam mutasi yang sama, yaitu: C16147T, T16189C,
C16193del, T16127C, A16235G, dan A16293C. Setelah dibandingkan dengan data sekunder Mitomap dan NCBI diperoleh dua mutasi yang menjadi kandidat pemicu DMT2, yaitu T16189C dan T16217C. Kedua mutasi tersebut juga dimiliki oleh generasi yang tidak terdiagnosis DMT2. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi kontribusi pada pengumpulan database varian genetik mtDNA manusia yang berhubungan dengan penyakit metabolisme, sehingga kedepannya dapat dimanfaatkan dalam berbagai bidang khususnya bidang kedokteran.
ii
ABSTRACT
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a metabolic disease characterized by increased blood sugar levels due to insulin resistence.One of the factor is mutations of T2DM Mitochondrial DNA (mtDNA). That is passed down trough the maternally inherited.One area in the mtDNA often associated with the disease is Hypervariabel region I (HVI). It have been known that area, it has high mutation rate. Therefore, to purpose of studied to examination of the mtDNA HVI region in four generations with a history of type 2 diabetes mellitus and the inheritance of a mutation that causes T2DM to determine genetic profiles.The steps was taken in this study are lysis of the hair root samples, amplified fragments of mtDNA HVI with Polymerase Chain Reaction (PCR), detection of PCR product by agarose gel electrophoresis, mtDNA concentration measurement by spectrophotometry UV-Vis, determination of the nucleotide sequence of mtDNA HVI region with methodsdirect sequencing, sequencing and analysis of the results using the program SeqmanTM version 4.00.Based on the comparison of the nucleotide sequence between data result and revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) data, six similar mutation obtained same mutation, these are: C16147T, T16189C, C16193del, T16127C, A16235G, and A16293C.Comparing the data with secondary data Mitomap and NCBI, it obtained two candidate mutations to trigger T2DM, the T16189C and T16217C.Both of these mutations are shared by generations of undiagnosed T2DM. The result is expected to contribute to the collection of human mtDNA genetic variants database. That associated with the metabolic disease so that in the future can be applied in various fields, especially in medicine area.
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah
memberikan nikmat sehat, kekuatan, dan ketabahan kepada penulis sehingga
penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Varian Genetik Daerah
Hipervariabel I (HVI) DNA Mitokondria pada Empat Generasi dengan Riwayat Dibetes Melitus Tipe 2”.
Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam menempuh
ujian sidang dan memperoleh gelar Sarjana Sains dalam bidang Kimia FPMIPA
UPI. Dalam penyusunan skripsi ini penulis menyadari masih banyak kekurangan
dan ketidaksempurnaan, karena keterbatasan pengalaman dan wawasan yang
dimiliki penulis. Oleh karena itu saran dan kritik yang membangun dari berbagai
pihak sangat penulis harapkan demi perbaikan pada penulisan karya selanjutnya.
Namun penulis berharap semoga skripsi ini banyak memberi manfaat bagi semua
pihak.
Bandung, Oktober 2013
iv
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Varian
Genetik Daerah Hipervariabel I (HVI) DNA Mitokondria pada Empat
Generasi dengan Riwayat Dibetes Melitus Tipe 2”.
Selama penyusunan skripsi ini tidak sedikit kesulitan yang dialami penulis,
namun karena bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak akhirnya penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis
mengucapkan terimakasih dan penghargaan setinggi-tingginya kepada:
1. Gun Gun Gumilar, S. Pd, M. Si. dan Drs. Rahmat Setiadi, M.Sc. selaku Dosen
Pembimbing yang telah membimbing, memberikan motivasi, dukungan,
arahan, dan saran kepada penulis selama penelitian dan penyusunan skripsi ini
dengan penuh kesabaran.
2. Drs. Yaya Sonjaya, M.Si selaku Dosen Pembimbing Akademik serta seluruh
Dosen yang telah memberikan ilmunya dan memberi pengalaman pada
penulis, sehingga memiliki pengetahuan dan wawasan mengenai kimia.
3. Yang terkasih Ibu, Bapak, Mas Angga, Mba Anggi dan semua keluarga atas
segala doa, semangat dan batuannya kepada penulis sehingga penulis tetap
semangat dalam menyelesaikan penelitan dan skripsi ini.
4. Sahabat-sahabatku, teman-teman di Science2, Kimia C, rekan-rekan angkatan
2009 serta seluruh pihak yang telah memberikan bantuan kepada penulis
hingga terselesaikannya skripsi ini.
Penulis memohon maaf atas segala keterbatasan dan kekurangan penulis
dalam penulisan skripsi ini. Atas perhatiannya penulis ucapkan terima kasih.
Bandung, Oktober 2013
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK ... i
ABSTRACT ... ii
KATA PENGANTAR ... iii
UCAPAN TERIMA KASIH ... iv
DAFTAR ISI ... v
DAFTAR TABEL ... vii
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... ix
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Masalah Penelitian ... 1
1.2. Rumusan Masalah Penelitian ... 3
1.3. Tujuan Penelitian ... 4
1.4. Manfaat Penelitian ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Diabetes Melitus ... 5
2.2. Mitokondria ... 6
2.3. DNA Mitokondria ... 7
2.4. Keterkaitan antara Mutasi DNA Mitokondria dan Diabetes Melitus Tipe 2... 11
2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 12
2.6. Elektroforesis Gel Agarosa ... 14
2.7. Spektrofotometri UV-Vis ... 15
2.8. Sekuensing DNA ... 16
2.9. rCRS (revised Cambridge Reference Sequence) ... 18
2.10. Mitomap dan Natinal Center for Biotechnology Information (NCBI) ... 19
BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Bagan Alir. ... 20
3.2. Alat dan Bahan ... 21
3.2.1. Alat ... 21
3.2.2. Bahan ... 21
3.3. Metode Penelitian... 21
vi
3.3.2. Lisis Sampel Akar Rambut ... 21
3.3.3. Amplifikasi Fragmen mtDNA Manusia secara In vitro dengan Teknik PCR ... 22
3.3.4. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarose ... 23
3.3.5. Pengukuran Kuantitasi mtDNA dengan Spektrofotometri UV-Vis ... 23
3.3.6. Penentuan Urutan Nukleotida Daerah HVI mtDNA Manusia dengan Sekuensing Metode Dideoksi Sanger ... 24
3.3.7. Pembacaan Elektroferogram Hasil Sekuensing .. 24
3.3.8. Analisis Urutan Nukleotida Daerah HVI mtDNA Manusia dengan Sekuensing Metode Dideoksi Sanger ... 25
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Karakteristik Sampel mtDNA ... 26
4.2. Hasil Lisis Sampel ... 27
4.3. Hasil Amplifikasi Fragmen HVI mtDNA dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 28
4.4. Hasil Kuantisasi Fragmen HVI mtDNA dengan Spektrofotometri UV-Vis ... 30
4.5. Hasil Sekuensing Urutan Nukleotida Daerah HVI mtDNA ... 30
4.6. Analisis Mutasi pada Daerah HVI mtDNA ... 32
4.7. Perbandingan Mutasi Sampel dengan Data Sekunder .... 35
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan ... 44
5.2. Saran ... 44
DAFTAR PUSTAKA ... 45
LAMPIRAN ... 50
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1. Perbedaan karakteristik mtDNA dan DNA inti ... 10
Tabel 3.1. Urutan Nukleotida Primer M1 dan M2 ... 22
Tabel 4.1. Data Individu Sampel mtDNA Manusia ... 26
Tabel 4.2. Data Konsentrasi Sampel mtDNA ... 30
Tabel 4.3. Matriks hasil perbandingan sampel dengan rCRS ... 34
viii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1. Struktur Mitokondria ... 7
Gambar 2.2. Organisasi mtDNA manusia ... 8
Gambar 2.3. Struktur Basa nukleotida DNA ... 10
Gambar 2.4. Mediasi insulin dalam proses uptake glukosa ... 11
Gambar 2.5. Fragmen urutan nukleotida rCRS dari 16021-16390 ... 18
Gambar 3.1. Tampilan elektroferogram hasil sekuensing sampel ... 24
Gambar 4.1. Hasil deteksi produk PCR dengan elektroforesis gel agarosa 29 Gambar 4.2. Contoh tampilan elektroferogram hasil sekuensing sampel DMG01 ... 31
Gambar 4.3. Contoh tampilan analisis mutasi pada sampel DMG01 dengan menggunakan program SeqManTM versi 4.00 DNASTAR ... 32
Gambar 4.4. Analisis jenis mutasi yang sama pada sampel DMG01, DMG02, DMG03, dan DMG04 dengan menggunakan program SeqManTM versi 4.00 DNASTAR ... 33
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Elektroferogram Hasil Sekuensing Sampel DMG01... 50
Lampiran 2. Elektroferogram Hasil Sekuensing Sampel DMG02... 51
Lampiran 3. Elektroferogram Hasil Sekuensing Sampel DMG03... 52
1 BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Masalah
Seiring dengan perkembangan zaman, prevalensi diabetes melitus
cenderung mengalami peningkatan baik di negara maju maupun di negara
berkembang. Menurut DEPKES RI, hal ini berhubungan dengan jumlah populasi
yang meningkat, urbanisasi yang merubah pola hidup tradisional ke pola hidup
modern, prevalensi obesitas meningkat dan kegiatan fisik berkurang (Hasdianah,
2012). Menurut data World Health Organization (WHO) pada tahun 2004,
diperkirakan 3,4 juta orang di dunia meninggal akibat gula darah puasa
tinggi. Lebih dari 80% kematian yang disebabkan diabetes melitus terjadi di
negara berpenghasilan rendah dan menengah. Faktanya dari data WHO pada
tahun 2011, penyakit diabetes melitus di Indonesia menduduki peringkat keenam
sebagai penyakit penyebab kematian tertinggi.
Berdasarkan penelitian epidemiologis di Indonesia, jumlah prevalensi
diabetes melitus di daerah urban mencapai 14,7% dan di daerah rural mencapai
sebesar 7,2%. Prevalensi tersebut meningkat 2-3 kali dibandingkan negara maju,
sehingga diabetes melitus merupakan salah satu masalah kesehatan yang harus
ditangani, dan dapat terjadi pada segala usia (Hadisaputro dalam Hasdianah,
2012).
Diabetes melitus adalah penyakit metabolisme yang ditandai dengan
peningkatan kadar gula darah akibat kekurangan sekresi insulin, kerusakan fungsi
insulin, ataupun keduanya (Lamster, et al, 2008). Berdasarkan pada sekresi insulin,
diabetes melitus dibagi menjadi dua kategori utama, yaitu diabetes melitus tipe 1
(DMT1) atau Insulin Dependent Diabetes Mellitus (IDDM) dan diabetes melitus tipe 2
2
DMT2 merupakan kombinasi dari resistensi insulin dan kelainan produksi insulin
pada sel β pankreas (Kurniali, 2013). Menurut data WHO 2004 dari seluruh penderita diabetes di dunia, 90% diantaranya mengidap DMT2.
Diabetes melitus tidak hanya dipengaruhi oleh satu faktor, melainkan
disebabkan oleh banyak faktor. Beberapa faktor yang berperan dalam diabetes
melitus tipe 2, antara lain obesitas (BMI ≥ 25 kg/m2), kurangnya aktivitas fisik,
serta faktor keturunan (Pouwer, 2005). Faktor keturunan terjadi karena adanya
kelainan genetik yang diturunkan dari orang tua kepada anaknya. Kelainan
genetik merupakan akumulasi dari berbagai jenis mutasi yang terjadi pada DNA.
Lebih dari 200 mutasi pada DNA inti telah ditemukan berhubungan dengan
metabolisme glukosa yang tidak normal, beberapa diantaranya telah ditetapkan
sebagai varian genetik penyebab diebetes melitus tipe 2 (Indriani, 2010). Disisi
lain, beberapa hasil penelitian menunjukkan adanya hubungan penyakit diabetes
melitus tipe 2 dengan mutasi genetik pada DNA mitokondria (Alcolade et al.,
1994; Alcolade dan Thomas, 1995; Gerbitz et al., 1996).
Mitokondria merupakan organel semiotonom, yang memiliki DNA dan
ribosom sendiri (Shamsi et al, 2008). Mitokondria berfungsi untuk menghasilkan
energi dalam bentuk adenosin trifosfat (ATP) (Wallace, 1999). DNA mitokondria
(mtDNA) bersama-sama dengan DNA inti berperan dalam menyandi kompleks
enzim respirasi yang sangat diperlukan untuk transfer elektron pada proses
fosforilasi oksidasi dalam menghasilkan energi ATP. Hasil samping dari
fosforilasi oksidatif berupa radikal oksigen. Radikal oksigen ini bersifat
mutagenik sehingga memicu terjadinya mutasi. Mutasi pada mtDNA dapat
menyebabkan berbagai jenis penyakit genetik yang dikenal dengan penyakit
mitokondria (Berdanier, 2007). DNA mitokondria hanya diwariskan dari ibu
(maternally inherited), sedangkan DNA inti merupakan hasil rekombinasi DNA
(Sudoyo, 2003).
Pada penelitian-penelitian terbaru, varian mtDNA biasa digunakan untuk
3
terutama varian pada daerah D-Loop. D-Loop merupakan daerah non coding
(bukan pengkode) pada bagian mtDNA yang memiliki laju mutasi paling tinggi,
sehingga urutan nukleotida pada daerah D-Loop sangat bervariasi antar individu.
D-Loop terdiri dari dua daerah, yaitu Hypervariabel I (HVI) yang terletak pada
nukleotida 16024-16383 dan Hypervariabel II (HVII) yang terletak pada
nukleotida 57-372.
Beberapa penelitian sebelumnya yang berkaitan dengan daerah HVI
mtDNA dan penyakit diabetes melitus tipe 2 telah dilakukan oleh Poulton et al.
(2002). Selain itu, Liou et al. (2007) meneliti tentang keterkaitan antara diabetes
melitus tipe 2 dengan varian mtDNA dan kenaikan indeks massa tubuh, Sari
(2009) meneliti tentang penderita diabetes melitus tipe 2 yang memiliki riwayat
obesitas, serta Indriani (2010) meneliti tentang penderita diabetes melitus tipe 2
dalam satu garis keturunan. Namun, penelitian yang berkaitan dengan varian HVI
mtDNA pada empat generasi dengan riwayat diabetes melitus tipe 2 belum pernah
diteliti. Berdasarkan hal tersebut, maka pada penelitian ini diteliti variasi mutasi
genetik daerah HVI mtDNA pada empat generasi dengan riwayat diabetes melitus
tipe 2.
1.2. Rumusan Masalah
Berdasarkan pada latar belakang yang telah dikemukakan, rumusan
masalah dalam penelitian ini dirumuskan dalam bentuk pertanyaan sebagai
berikut: “Bagaimana varian genetik daerah HVI mtDNA pada empat generasi
dengan riwayat diabetes melitus tipe 2?”. Untuk menentukan langkah-langkah
penelitian, maka rumusan masalah tersebut dijabarkan menjadi sub-sub masalah
sebagai berikut:
1. Bagaimana variasi mutasi daerah HVI mtDNA pada setiap generasi dengan
riwayat diabetes melitus tipe 2 ?
2. Mutasi jenis apa saja yang sama pada keempat generasi dengan riwayat
4
3. Apakah kandidat mutasi penyebab penyakit diabetes melitus tipe 2 diwariskan
terhadap generasi lainnya?
1.3. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil genetik daerah HVI
mtDNA pada empat generasi dengan riwayat diabetes melitus tipe 2. Adapun
tujuan lebih lanjut dari penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Mengidentifikasi varian mutasi yang terjadi pada daerah HVI mtDNA pada
empat generasi dengan riwayat diabetes melitus tipe 2.
2. Mengetahui kesamaan mutasi yang dimiliki keempat generasi dengan riwayat
diabetes melitus tipe 2 di daerah HVI mtDNA.
3. Mengetahui pewarisan kandidat mutasi di daerah HVI mtDNA penyebab
diabetes melitus tipe 2 pada empat generasi dengan riwayat diabetes melitus
tipe 2.
1.4. Manfaat Penelitian
Adapun manfaat dari dilakukannya penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Dapat memberikan informasi tentang pewarisan genetik daerah HVI mtDNA
pada empat generasi dengan riwayat diabetes melitus tipe 2.
2. Dapat mengetahui kandidat marker genetik yang dapat memicu terjadinya
penyakit diabetes melitus tipe 2.
3. Dapat memberi kontribusi pada pengumpulan database varian genetik
mtDNA manusia yang berhubungan dengan penyakit, sehingga ke depannya
20
BAB III
METODE PENELITIAN
Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah:
pengumpulan sampel, lisis terhadap sampel mtDNA yang telah diperoleh,
amplifikasi daerah HVI mtDNA sampel dengan menggunakan teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR), pendeteksian hasil PCR dengan elektroforesis gel agarosa,
pengukuran konsentrasi mtDNA dengan Spektrofotometri UV-Vis, sekuensing
hasil PCR dengan konsentrasi > 100 ng/ L, serta analisis urutan nukleotida
menggunakan program SeqManTM versi 4.00 DNASTAR.
3.1. Bagan Alir
Penelitian ini secara umum dapat digambarkan pada skema berikut:
Sampel mtDNA manusia
Templat DNA
Fragmen HVI mtDNA
Konsentrasi mtDNA >100 ng/ L
Urutan Nukleotida Daerah HVI mtDNA
Profil Genetik Daerah HVI mtDNA Manusia pada Empat Generasi dengan Riwayat Diabetes Melitus 2
Lisis dan ekstraksi sel
Amplifikasi dengan teknik PCR dan deteksi
dengan elektroforesis gel agarose
Sekuensing
Analisis data menggunakan Program SeqManTM
versi 4.00 DNASTAR
Diukur absorbansi pada =260nm dan =280nm
21
3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pipet mikro, tabung
eppendrof, sentrifuge, set alat PCR, autoklaf, set alat elektroforesis, lampu UV,
dan Spektrofotometri UV-Vis.
3.2.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam tahap lisis yaitu buffer lisis (500 mM
Tris-HCl pH 8,5, 10 mM EDTA pH 8, dan 5% Tween-20), enzim proteinase K 10
mg/mL, dan ddH2O. Bahan-bahan yang digunakan dalm proses PCR adalah
primer M1 20 pmol/ L, primer M2 20 pmol/ L, buffer PCR 10x (500 mM KCl,
100 mM Tris-HCl pH 9,0 pada suhu 25C, 1% Triton X-100, 15 mM MgCl2),
enzim Taq DNA Polimerase 5 unit/ L, dan campuran dNTP 10 mM. Bahan-bahan
yang digunakan dalam elektroforesis gel agarosa yaitu agarosa, buffer TAE 1x
(Tris-asetat 0,05 M dan EDTA 0,001 M pH 8), larutan EtBr 10 g/mL, loading
buffer (sukrosa 50%, EDTA 0,1 M pH 8, bromfenol biru 0,1% pH 8), dan marker
pUC19/HinfI 30 g/ L.
3.3. Metode Penelitian
3.3.1. Pengumpulan Sampel mtDNA
Sampel yang digunakan berupa akar rambut dari empat generasi dengan
riwayat dibetes melitus tipe 2. Pengambilan sampel akar rambut dengan cara
mencabut rambut sampai akarnya, sehingga selanjutnya dapat dilakukan proses
lisis dan ekstrasi mtDNA dari akar rambut tersebut.
3.3.2. Lisis Sampel Akar Rambut
Sampel akar rambut dilisis secara kimiawi dan enzimatik. Tahap awal
sampel rambut sebanyak 5-7 helai dipotong pada bagian akarnya (±1 cm) dan
dimasukkan ke dalam tabung eppendrof ukuran 1500 L. Kemudian ditambahkan
ddH2O sebanyak 170 L. Selanjutnya ditambahkan 20 L buffer lisis (500 mM
22
proteinase K 10 mg/ mL hingga volume lisis tepat 200 L. Kemudian tabung
eppendrof yang berisi campuran reaksi dibungkus dengan parafilm dan diinkubasi
selama 1 jam pada waterbath dengan suhu ±55°C. Setelah itu dilakukan proses
deaktivasi enzim proteinase K pada suhu ±95°C selama 10 menit. Kemudian
campuran reaksi disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm.
Setelah proses sentrifugasi, supernatannya diambil sebanyak 150 L dan dimasukkan ke dalam tabung eppendrof 1500 L yang baru untuk selanjutnya
digunaan sebagai templat pada proses PCR.
3.3.3. Amplifikasi Fragmen mtDNA Manusia secara In vitro dengan Teknik PCR
Proses amplifikasi fragmen daerah HVI mtDNA manusia dilakukan
dengan menggunakan primer M1 dan M2. Campuran reaksi PCR dimasukkan ke
dalam tabung eppendrof 200 L, terdiri atas 5 L template mtDNA hasil lisis;
primer M1 (30 pmol/ L) 0,5 L; 0,5 L primer M2 (30 pmol/ L); 2,5 L buffer
PCR 10x (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9 pada suhu 25°C); 1,0% Triton
X-100; 15 mM MgCl2); enzim Taq DNA Polimerase (5 unit/ L) sebanyak 0,2 L;
0,5 L campuran dNTP 10 mM; dan ditambah 15,8 L ddH2O steril sehingga volumenya mencapai 25 L. Urutan rinci nukleotida primer M1 dan M2
ditunjukkan pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1. Urutan Nukleotida Primer M1 dan M2
Primer Urutan 5’ ke 3’ Posisi Ukuran
M1 -CACCATTAGCACCCAAAGCT- L 15.978-15.997 20 Nukleotida
M2 -GATTTCACGGAGGATGGTG- H 16.419-16.401 19 Nukleotida
Proses PCR dilakukan dengan mesin GeneAmp® PCR System 2700
sebanyak 35 siklus. Tahap awal dari proses PCR adalah tahap denaturasi awal
yang dilakukan pada suhu 90°C selama 5 menit, kemudian masuk ke program
siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri dari 3 tahap yaitu tahap
23
yang dilakukan pada suhu 50°C selama 1 menit, dan tahap extension atau
polimerisasi pada suhu 72°C selama satu setengah menit. Pada akhir semua siklus
dilakukan tambahan proses polimerisasi pada 72°C selama empat menit. DNA
hasil PCR kemudian disimpan pada suhu -20°C.
3.3.4. Analisis Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarose
Hasil amplifikasi dari proses PCR yang telah dilakukan sebelumnya
kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) menggunakan set
alat elektroforesis sederhana. Komposisi gel agarosa dibuat dengan melarutkan
0,15 gram agarosa dalam 15 mL buffer TAE 1x. Larutan tersebut kemudian
dipanaskan hingga semua agarosa larut sempurna, lalu didinginkan hingga suhu
larutan mencapai 60°C. Pada masing-masing sumur gel dimasukkan 5 L sampel
hasil PCR yang telah dicampurkan dengan 2 L loading buffer (sukrosa 50%;
EDTA 0,1 M pH 8; bromfenol biru 0,1% pH 8).
Proses elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE 1x sebagai media
penghantar arus pada tegangan 100 volt selama 45 menit. Marker atau penanda
yang digunakan adalah pUC19/HinfI. Setelah elektroforesis selesai, agarosa
direndam dan digoyangkan menggunakan shaker selama 5 menit dalam larutan
EtBr. Kemudian direndam dan dishake di dalam dH2O selama 3 menit. Hasil
elektroforesis kemudian divisualisasikan dengan sinar UV dan difoto dengan
kamera digital. Penentuan konsentrasi DNA dapat dilakukan dengan cara
membandingkan intensitas pita sampel terhadap pita-pita dari marker yang
konsentrasinya telah diketahui sebelumnya.
3.3.5. Pengukuran Konsentrasi mtDNA dengan Spektrofotometri UV-Vis
Ekstrak mtDNA hasil isolasi dihitung konsentrasinya menggunakan alat
spektrofotometer UV-Vis. Total volume yang digunakan untuk pengukuran pada
spektrofotometer sebanyak 1000 l dan faktor pengenceran yang digunakan
sebesar 200 kali. Larutan blanko yang digunakan adalah ddH2O sebanyak 1000 l.
24
Sedangkan untuk pengukuran kemurnian DNA dilakukan dengan perbandingan
absorban 260/280 (A260/280).
Kalibrasi spektrofotometer dilakukan sebelum digunakan untuk
pengukuran sampel DNA. Sebanyak 1000 l ddH2O dimasukkan ke dalam kuvet
lalu dimasukkan ke dalam Spektrofotometer UV-Vis dan ditekan tombol read
blank untuk kalibrasi. Sebanyak 5 l sampel DNA dimasukkan ke dalam kuvet
kemudian ditambahkan ddH2O sebanyak 995 l. Konsentrasi DNA diukur pada
panjang gelombang 260 nm dan kemurnian DNA diukur dengan perbandingan
absorban 260/280 (OD260/280).
3.3.6. Penentuan Urutan Nukleotida Daerah HVI mtDNA Manusia dengan Sekuensing Metode Dideoksi Sanger
Sekuensing DNA merupakan tahapan akhir dalam menetukan urutan
nukleotida fragmen hasil amplifikasi dengan teknik PCR. Sekuensing dilakukan
oleh Macrogen In. Korea berdasarkan prinsip sekuensing metode Dideoksi Sanger
menggunakan Automatic DNA Sequencer dengan primer M1 5’(CACCATTAGC-
ACCCAAAGCT)3’.
3.3.7. Pembacaan Elektroferogram Hasil Sekuensing
Pembacaan elektroferogram hasil sekuensing dilakukan dengan
menganalisis data elektroferogram. Pada elektroferogram tersebut, masing-masing
basa memperlihatkan warna dan tinggi puncak yang berbeda. Basa adenin (A)
berwarna hijau, basa guanin (G) berwarna hitam, basa sitosin (C) berwarna biru,
dan basa timin (T) berwarna merah, seperti pada Gambar 3.1.
25
3.3.8. Analisis Urutan Nukleotida Daerah HVI mtDNA Manusia dengan Sekuensing Metode Dideoksi Sanger
Urutan nukleotida pada daerah HVI mtDNA manusia hasil sekuensing
dianalisis dengan menggunakan SeqManTM versi 4.00 DNASTAR. Proses
analisisnya dilakukan dengan cara memasukkan urutan nukleotida sampel dan
urutan DNA standar yang ada yaitu urutan Cambrige yang telah direvisi oleh
Andrews et al. pada tahun 1999 yaitu revised Cambrige Reference Sequnce
(rCRS), kemudian program akan secara otomatis menandai basa pada posisi
44
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dan pemaparan
pembahasan, dapat disimpulkan bahwa:
1. Sampel empat generasi dengan riwayat DMT2 memiliki enam mutasi yang
sama, yaitu mutasi C16147T, T16189C, C16193del, T16217C, A16235G, dan
A16293C.
2. Ditemukan lima mutasi khas yang dimiliki empat generasi dengan riwayat
diabetes melitus tipe 2, yaitu C16147T, C16193del, T16217C, A16235G, dan
A16293C.
3. Kandidat mutasi yang mengindikasikan terjadinya penyakit DMT2 pada
sampel DMG01 dan DMG02 adalah T16189C dan T16217C. Kedua mutasi
tersebut juga terdapat pada sampel DMG03 dan DMG04, maka generasi
ketiga dan keempat ini juga berpotensi terkena DMT2.
5.2. Saran
Diabetes melitus tipe 2 merupakan penyakit yang diturunkan secara
maternal dan dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti gaya hidup. Dalam
penelitian ini ditemukan setiap individu memiliki mutasi yang berbeda satu sama
lain meskipun dalam satu garis keturunan. Oleh karena itu, kandidat varian
genetik yang diperoleh dalam penelitian ini perlu dianalisis lebih lanjut hubungan
mutasinya satu sama lain dan faktor-faktor yang menyebabkan terjadinya
DAFTAR PUSTAKA
Alcolado, J.C., Majid, A., dan Brockington M. (1994). Mitochondrial Gene
Defects in Patients with NIDDM. Diabetalogia 37, 372-376.
Alcolado, J.C., dan Thoas A. W. (1995). Maternally Inherited Diabetes Mellitus:
the Role of Mitochondrial DNA Defects. Diabet Med 12, 102-108.
Anderson, S. et al. (1981). Sequence and Organization of The Human
Mitochondrial Genome. Nature 290 (5806): 457–465.
Andrews, R.M. et al. (1999). Reanalysis and Revision of The Cambridge
Reference Sequence for Human Mitochondrial DNA. Nat Genet 23 (2): 147.
Berdanier, C.D. (2007). Linking Mitochondrial Function to Diabetes Mellitus: an
Animal’s Tale. American Journal Physical Cell Physiol 293, 830-836.
Bogenhagen, Daniel F. (1999). DNA REPAIR’99 Repair of mtDNA in Vertebrates. Am. J. Hum. Genest. 64, 1276-1281.
Brown. (1996). Gene Cloning. An Introduction. Third edition. Chapman dan Hall, Boundrary Raw, London.
Carranza, F.A. et al. (2002). Carranza’s Clinical Periodontology 9th ed.
Philadelphia:208-211.
Chen, X. et al. (1995). Rearranged Mitochondrial Genomes are Present in
Human Oocytes. Am. J. Hum. Genest, 239-247.
Fachreza, Rizki P. (2009). Tinjauan Diabetes Melitus dari Aspek Selular dan
Molekuar. [Online]. Tersedia: http://lucablightblue.blogspot.com/2009/05/
tinjauan-diabetes-melitus-dari-aspek.html. [30 Juli 2013]
Fatchiyah. (2011). Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman
Dengan Metode RAPD. Malang: Laboratorium Sentral Ilmu Hayati
46
Gerbitz, K.D., Paprotta A. dan Brdiczka D. (1996). Mitochondria and Diabetes:
Genetics, Biochemical and Clinical Implication of the Cellular Energy
Circuit. Diabetes 45, 113-126.
Gray, M.W., G. Burger, dan B.F. Lang. (1999). Mitochondrial Evolution. Science 283: 1467-481.
Gumilar, G.G, Supriyanti, F. M.T., Siti, H.H. (2008). Bioteknologi. Bandung: Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.
Handayani, L. (2007). Kejadian Diabetes Melitus (DM), Perilaku Berisiko Dan
Kondisi Fisiologis Penderita DM di Indonesia. Dalam : Majalah Kesehatan
Perkotaan. 15 (1): 55-67.
Hasdianah, H.R. (2012). Mengenal Diabetes Melitus pada Orang Dewasa dan
Anak-Anak dengan Solusi Herbal. Yogyakarta: Nuha Medika.
http://www.mitomap.org/bin/view. pl/MITOMAP/HumanMitoSeq
http://www.mitomap.org/pub/MITOMAP/MitomapFigures/mtDNAMorbidMap. pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Indriani, Tanti. (2010). Kandidat Varian Genetik DNA Mitokondria Daerah
Hipervariabel I (HVI) pada Penderita Diabetes Melitus Tipe 2 dalam Satu Garis Keturunan. Skripsi Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.
Bandung: tidak diterbitkan.
Jean, Francois Giot. (2010). Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Kahn, S.E., (2005). The Patophysiology And Genetics Of Type 2 Diabetes
Melitus. In : Ellenberg, M., ed. The Diabetes Melitus Manual. USA: The
McGrawHill Companies, 51-61.
Khosravinia, H. et al. (2007). Optimazing factors influencing DNA extraction
from fresh whole avian blood. African Journal of Biotechnolody, Vol. 6(4),
pp. 481-486.
Kurniali, Peter C. (2013). Hidup Bersama Diabetes Mengaktifkan Kekuatan
Kecerdasan Ragawi untuk Mengontrol Diabetes dan Komplikasinya.
47
Lamster, I. B. et al. (2008). The Relationship Between Oral Health And Diabetes
Mellitus. J Am Dent Assoc;139;19S-24S.
Liou, Chia-Wei et al. (2007). A Common Mitochondrial DNA Variant and
Increased Body Mass Index as Associated Factors for Development of Type 2 Diabetes: Additive Effects of Genetic and Environmental Factors. The
Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 92(1):235–239.
Lucky, Bellinda. (2008). Mutasi DNA Mitokondria yang Berkaitan dengan
Penyakit Diabetes Melitus. Skripsi Program Studi Kimia Institut Teknologi
Bandung. Bandung: tidak diterbitkan.
Magdeldin, Sameh. (2012). Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia.
Maharani, Afriana P. (2011). Sel dan Bagian-Bagiannya (Fungsi Organel Sel). [Online]. Tersedia: http://aimaifantasy.wordpress.com/2011/07/26/sel-dan-bagian-bagiannya. [28 Juli 2013]
Marzuki, S. et al. (1991). Normal Variants of Human Mitochondrial DNA and
Translation Products: The Building of a Reference Data Base. Human
Genetics, 88(2).
Matthews D.C. (2002). The Relationship Between Diabetes and Periodontal
Disease. J Can Dent Assoc; 68(3):161-4.
Muladno. (2002). Teknik Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wirausaha Muda.
Mullis, Kary. (1990). The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Scientific American April 56-65.
Nakada, K. (2006). Mitochondria-Related Male Infertility. PNAS: 103(41):15148-53.
Ngili, Yohanis. (2005). DNA Mitokondria Pengidentifikasi Korban Tsunami. [Online]. Tersedia: http://www.pikiran–rakyat.com. [28 Juli 2013]
Nugroho, A.H. (2006). Hewan Percobaan Diabetes Mellitus: Patologi dan
Mekanisme Aksi Diabetogenik. Biodiversitas 7:378-382.
48
Park, K.S. et al. (2008). A Mitochondrial DNA Variant at Potition 16189 1A
Associatted with Type 2 Diabetes Mellitus in Asians. Diabetologia 51:
602-608.
Parson, Walther dan Arne Du¨r. (2007). EMPOP—A forensic mtDNA database. Forensic Science International: Genetics 1 (2007) 88–92.
Poulton, J. et al. (1998). A Common Mithocondrial DNA Variant is Associated
with Insulin Resistent in Adult Life. Diabetologia 51: 602-608.
Poulton, J. et al. (2002). Type 2 Diabetes is Associated with a Common
Mitochondrial Variant: Evidence From a Population-Based Case-Control Study. Hum Mol Genet. 2002 Jun 15;11(13):1581-3.
Pouwer, F. (2010). Does Emotional Stress Cause Type 2 Diabetes Mellitus? A
Review from the Europeaan Depression in Diabetes (EDID) Research Consortium. Discovery Medicine., 2010; 9(45): 112 – 118.
Purnomo, Sudjiono, T. Joko, dan S. Hadisusanto. (2009). Biologi Kelas XI untuk
SMA dan MA. Jakarta: Pusat Perbukuan, Departemen Pendidikan Nasional.
Puspitasari, Dea. (2007). Urutan Nukleotida Daerah HVSI DNA Mitokondria
Manusia Poli-C. Skripsi Program Studi ITB. Bandung: tidak diterbitkan.
Qiagen. (2006). Genomic DNA Purification. [Online]. Tersedia: http://www. qiagen.com/ literature/brochurs/index. [30 Juli 2013]
Qu, Jia M.D. et al. (2009). Extremely Low Penetrance of Leber’s Hereditary
Optic Neuropathy in 8 Han Chinese Families Carrying the ND4 G11778A Mutation. Ophthalmology. 2009 March ; 116(3): 558–564.e3.doi:10.1016/ j.ophtha.2008.10.022.
Ruiz, Pesini E et al. (1998). Correlation of Sperm Motility with Mitochondrial
Enzymatic Activities. Clin Chem 44:1616-1620.
Ruiz, Pesini E. et al. (2000). Seminal quality correlates with mitochondrial
functionality. Clin Chem Acta 300:97-105.
Saepudin, Asep. (2012). Penggunaan Lintasan Euler dalam Penyederhanaan Sekuensing DNA. Bandung: Institut Teknologi Bandung.
Sambrook, J. Fritsch, E.F. dan Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: a
49
Sari, Y. A. (2009). Kandidat Varian Genetik Daerah D-Loop DNA Mitokondria
Manusia pada Penderita Diabetes Melitus Tipe 2 yang Dipicu oleh Obesitas. Skripsi Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI. Bandung: tidak
diterbitkan.
Shamsi, M. B. et al. (2008). Mitochondrial DNA Mutations in Etiopathogenesis of
Male Infertility. Indian J Urol; 24:150-4.
Schteingart, D.S., (2006). Metabolisme Glukosa dan Diabetes Melitus. Dalam : Price, S. A., ed. Patofisiologi, Konsep Klinis, dan Proses Penyakit. Edisi ke-5. Jakarta: EGC, 1259-1267.
Soini, H. K et al. (2012). Mitochondrial DNA sequence variation in Finnish patients with matrilineal diabetes mellitus. BMC Research Notes 2012, 5:350.
Sudarmadji, S. (1996). Teknik Analisa Biokimiawi. Yogyakarta: Edisi Pertama Liberty.
Sudjadi. (2008). Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisiu.
Sudoyo, H. (2003). Polimorfisme DNA Mitokondria dan Kedokteran Forensik. Jakarta: Lembaga Biologi Molekuler Eijkman.
Sulandari,S dan M.S.A. Zein. (2003). Panduan Praktis Laboratorium DNA. Bidang Zoologi Pusat Penelitian Biologi LIPI.
Susmiarsih, T. (2010). Peran Genetik DNA Mitokondria (mtDNA) pada Motilitas
Spermatozoa. Majalah Kesehatan PharmaMedika, 2010 Vol.2, No.2.
Tan, Duan-Jun et al. (2002). Comprehensive Scanning of Somatic Mitochondrial
DNA Mutations in Breast Cancer1. CANCER RESEARCH 62, 972–976, February 15, 2002.
Wallace, D.C. (1995). Mitochondrial DNA Variation in Human Evolution,
Degenerative Disease, and Aging. Am J Hum Genet 57:201-223.
Wallace, D.C. (1997). Mitochondrial DNAin Aging Disease. Scientific American.
22-29.
Wang, Pei-Wen, Tsu et al. (2009). Mitochondrial DNA Variants in the
Pathogenesis of Type 2 Diabetes - Relevance of Asian Population Studies.
