ISOLASI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM α AMILASE DARI Aspergillus niger DENGAN MENGGUNAKAN MEDIA CAMPURAN ONGGOK DAN DEDAK

(1)

ISOLASI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM α‐ AMILASE

DARI Aspergillus niger DENGAN MENGGUNAKAN

MEDIA CAMPURAN ONGGOK DAN DEDAK

Firman Sebayang Departemen Kimia FMIPA USU

Abstrak

Telah dilakukan ekstraksi enzim α-amilase dari Aspergillus niger yang ditumbuhkan dalam media pertumbuhan campuran onggok dan dedak. Ekstrak kasar enzim α-amilase dimurnikan lebih lanjut dengan pengendapan menggunakan (NH4)2SO4 60%. Kadar protein enzim dianalisa dengan metode Lowry. Pengujian aktivitas enzim

α-amilase menggunakan metode Bernfeld, yaitu dengan mengukur kandungan maltosa yang dihasilkan dari hidrolisa amilum. Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim α-amilase adalah 5.45 unit/mg protein pada pH 6.0 suhu 60 oC. Setelah pemurnian dengan (NH4)2SO4 60% aktivitas spesifik enzim α-amilase meningkatmenjadi 8.50

unit/mg protein pada pH 6.0 suhu 60 oC.

Kata kunci: Isolasi enzim α-amilase, Aspergillus niger

A. PENDAHULUAN

Dalam proses pengolahan hasil-hasil pertanian selain dihasilkan produk yang dikehendaki juga sering dihasilkan produk samping berupa limbah. Onggok yang merupakan hasil samping dari proses pengolahan ubi kayu menjadi tepung tapioka masih mengandung pati yang cukup tinggi sekitar 60-70%. Sedangkan menurut Judoamidjojo kandungan dari pati dalam onggok sekitar 60%. Jumlah pati yang tersisa dalam ampas tapioka tergantung pada teknik pembuatan tapioka. Oleh karena itu analisa kimia dari onggok dapat memberikan hasil yang berbeda-beda. Selama ini pendayagunaan onggok belum optimal, masih terbatas sebagai makanan ternak sehingga nilai ekonomis dan daya gunanya kecil sekali. Masih tingginya kadar pati dalam onggok cukup potensial digunakan dalam sistem fermentasi media padat meskipun kadang-kadang memerlukan penambahan sumber nitrogen dan unsur mineral lainnya. Di samping itu dedak sebagai limbah dari proses pengolahan gabah menjadi beras mengandung karbohidrat protein relatif masih tinggi serta mengandung vitamin dan

mineral. Dengan penerapan bioteknologi

akan dapat diupayakan dalam hal memanfaatkan potensi yang masih dimiliki oleh limbah industri pangan tersebut sehingga memberikan nilai tumbuh yang cukup berarti.

Dalam penelitian digunakan campuran antara onggok dan dedak sebagai media pertumbuhan kapang Aspergillus niger

dalam upaya memproduksi enzim

α-amilase secara fermentasi dengan

metode kultur semipadat. Enzim α-amilase

adalah enzim yang berfungsi untuk memecah ikatan α-1,4 glikosida dari molekul pati menjadi maltosa. α-amilase merupakan salah satu enzim ekstraseluler komersial yang mempunyai nilai ekonomis yang tinggi, sehingga banyak digunakan dalam berbagai bidang industri seperti industri pati, roti, alkohol, kertas, tekstil, gula, dan industri detergen.

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi serta karakterisasi ekstrak kasar enzim α-amilase dari kapang Aspergillus niger yang ditumbuhkan pada media campuran onggok dan dedak.

B. BAHAN DAN METODE

1. Penyediaan Suspensi Biakan Aspergillus niger

Biakan Aspergillus niger ditanam pada 5 ml media agar miring PDA (Potato Dextrosa Agar) dalam tabung reaksi, diinkubasi pada suhu 37 o_{C selama 5 hari. Ke dalam biakan}

tersebut ditambahkan 2 ml akuades steril. Spora yang terbentuk dikerok dengan jarum ose agar terlepas dari agar sehingga diperoleh suspensi biakan Aspergillus niger.

(2)

Proses penyediaan suspensi biakan Aspergilus niger dapat dilihat pada Gambar 1.

Sediaan jamur Aspergillus niger

Hasil biakan

Dibiakkan pada tabung reaksi yang berisi 5 ml media PDA Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 5 hari

Ditambahkan 2 ml akuades steril

Spora dikerok dengan jarum ose agar terlepas dari agar

Suspensi biakan

Aspergillus niger

Gambar 1. Penyedian Suspensi Biakan Aspergillus niger

35 g campuran onggok dan dedak (1:1)

Ditambahkan 29 ml urea 0,14% Ditambahkan 71 ml akuades

Ditambahkan 3 ml suspensi biakan Aspergillus nig Hasil biakan

Ditambahkan 100 ml akuades Dishaker selama 2 jam

Disentrifugasi 15’ , 2500 rpm, 4 o

C Supernatan

Ditambahkan CaCl2 20% (1:40)

Didiamkan selama 1 jam Disentrifugasi 15’ , 2500 rpm

Supernatan

Diambil 100 ml

Ditambahkan (NH4)2SO4 sampai konsentrasi 60%

Disentrifugasi selama 20’ , 5000 rpm, 4oC

Endapan

Disuspensikan dalam larutan bufer fosfat Didialisis dengan menggunakan kantong selopan

Enzim amilase

Diukur aktivitasnya Diukur kadar proteinnya

Aktivitas spesifik

(3)

2. Produksi Enzim α-amilase dari Aspergillus niger

Ke dalam labu erlenmeyer 250 ml dimasukkan 35 gram campuran onggok dan dedak (1:1), 29 ml urea 0,14% dan 71 ml akuades yang masing-masing telah disterilisasi secara terpisah pada suhu 120 o_{C selama 15 menit. Lalu diinokulasikan}

dengan 3 ml biakan Aspergillus niger dan diinkubasi selama 8 hari pada suhu kamar sehingga kultur padat tersebut dipenuhi misellium. Ke dalam hasil biakan ditambahkan 100 ml akuades dan dishaker selama 2 jam, lalu disentrifugasi selama 15 menit pada

putaran 2500 rpm dengan suhu 4 o_{C. Pada}

supernatan yang diperoleh ditambahkan CaCl2 20% (1 ml CaCl2 untuk 40 ml supernatan),

dibiarkan selama 1 jam dan disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan putaran

5000 rpm pada suhu 4 o_{C . Ke dalam 100}

ml supernatan (ekstrak kasar enzim) ditambahkan perlahan-lahan sambil diaduk (NH4)2SO4 60%, kemudian disentrifugasi

kembali pada putaran 5000 rpm selama 20 menit. Endapan yang diperoleh disuspensikan dalam bufer lalu dilakukan dialisa menggunakan kantong selopan sampai bebas sulfat. Enzim α-amilase yang diperoleh ditentukan aktivitas serta Kadar proteinnya. Diagram proses produksi enzim α-amilase dari Aspergillus niger dapat dilihat pada Gambar 2.

3. Pengujian Akivitas Enzim α-amilase

Ke dalam 2 buah tabung reaksi dimasukkan masing-masing 1 ml larutan amilum 0,5%. Pada salah satu tabung ditambahkan 1 ml akuades. Kedua tabung diinkubasi selama 3 menit. Ke dalam masing masing tabung ditambahkan 2 ml pereaksi DNS (Asam Dinitro Salisilat) dan panaskan pada air mendidih selama 5 menit dan dinginkan segera pada air mengalir. Tentukan absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm. Perlakuan ini dilakukan untuk variasi suhu inkubasi (50, 55, 60, 65, 70) o_C

serta variasi pH substrat (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5). untuk mengetahui jumlah maltosa

yang dihasilkan digunakan kurva standart maltosa (Lampiran 1).

4. Penentuan Kadar Protein

Penentuan kadar protein enzim dilakukan dengan metode lowry. Sebanyak 1 ml ekstrak kasar enzim direaksikan dengan 5 ml reagen C, kocok dan biarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Tambahkan 0,5 ml reagen D (Folinciocalteu 1N) kocok dan biarkan 30 menit pada suhu kamar. Tentukan absorbansinya pada panjang gelombang 750 nm. Untuk mengetahui konsentrasi protein digunakan kurva standar protein Bovin Serum Albumin (BSA) (Lampiran 2).

C. HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Isolasi Enzim α-amilase

Enzim α-amilase merupakan enzim

ekstraseluler sehingga dalam proses isolasinya tidak memerlukan pemecahan sel. Pemanfaatan campuran onggok dan dedak cukup potensial digunakan sebagai media pertumbuhan kapang Aspergillus

niger dalam upaya memproduksi enzim

dalam sistem fermentasi media semi padat sehubungan dengan kadar pati, protein, vitamin serta mineral yang masih terkandung di dalamnya. Enzim α-amilase yang diperoleh dari Aspergillus niger lebih lanjut dilakukan isolasi (pemurnian) secara parsial dengan penambahan (NH4)2SO4 .

Hal ini dimungkinkan karena garam berfungsi untuk merusak mantel air yang terdapat disekitar enzim (protein) sehingga protein akan mengendap. Pengendapan maksimum dipeoleh dengan penambahan

(NH4)2SO4 60%. Selanjutnya dilakukan

sentrifugasi dingin dan freezedrying sehingga diperoleh serbuk enzim kasar α-amilase sebanyak 0,55 g dari 100 ml supernatan.

(4)

2. Kondisi Optimum Kerja Enzim α-amilase

Dari hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diperoleh hasil sebagai berikut:

Tabel 1. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim α-amilase pH Aktivitas (unit) 5 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 0.35 0.49 1.50 1.05 0.65 0.42

pH optimum enzim α-amilase adalah 6,0 (Kurva 1 pada lampiran). pH berhubungan dengan struktur enzim yang terdiri dari asam-asam amino. Perubahan pH dalam suatu larutan menunjukkan

perubahan-perubahan jumlah ion H+_yang

ada dalam larutan. Jumlah ion yang ada akan mempengaruhi struktur enzim yang terdiri dari asam-asam amino, terutama pada ikatan hidrogennya. Karena aktivitas enzim berkaitan erat dengan strukturnya maka perubahan struktur akan menyebabkan perubahan-perubahan aktivitas enzim. Sedangkan pada pH optimum jumlah ion H+_{tidak mempengaruhi}

konformasi enzim sehingga konformasi substrat sama dengan konformasi enzim. Hal ini menyebabkan interaksi antara enzim dan substrat meningkat, sedangkan pada pH optimum aktivitas enzim paling tinggi. Dari hasil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim α-amilase diperoleh hasil sebagai berikut:

Tabel 2. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim α-amilase

Suhu (oC) Aktivitas (unit)

35 40 45 50 55 60 65 70 0.15 0.18 0.45 0.90 1.20 1.45 0.85 0.25

Suhu optimum enzim α-amilase adalah

60 o_{C (Kurva 2 pada lampiran). Sebelum}

mencapai suhu 60 o_{C terlihat bahwa}

aktivitas enzim kecil, hal ini disebabkan karena pada suhu tersebut energi aktivasi yang diperlukan enzim untuk mengkatalisis reaksi hidrolisis substrat amilum tidak cukup sehingga enzim tidak dapat bekerja dengan baik. Kenaikan suhu menyebabkan aktivitas enzim meningkat sampai mencapai suhu optimum. Setelah mencapai kondisi optimum terlihat bahwa aktivitas enzim menurun. Terjadinya penurunan aktivitas ini diperkirakan karena pada suhu tinggi struktur tertier enzim yang terdiri dari ikatan bukan kovalen atau elektrostatik, ikatan hidrogen, ikatan disulfida dan ikatan hidrofobik bila menyerap energi tinggi akan terjadi pemutusan dan mengakibatkan terjadinya pembukaan struktur tertier dan kuartener yang menyebabkan konformasi enzim berubah dan menyebabkan aktivitasnya menurun.

D. KESIMPULAN

1. Ekstrak kasar enzim α-amilase dapat diproduksi dari kapang Aspergillus

niger bila ditumbuhkan dalam media

campuran onggok dan dedak. Enzim α-amilase bersifat ekstraseluler.

2. Kondisi optimum ekstrak kasar enzim α-amilase adalah pada pH 6.5 dan

suhu 60 o_{C menghasilkan aktivitas}

spesifik sebesar 5,45 unit/ mg protein. Setelah dilakukan pemurnian dengan (NH4)2SO4 60% aktivitas spesifik

enzim amilase meningkat menjadi 8,50 unit/ mg protein.

E. DAFTAR PUSTAKA

Satiawiharja, B., 1984, Fermentasi Media

Padat dan Manfaatnya, Dept. Pendidikan

dan Kebudayaan Indonesia, Jakarta. Prescott, S. C. and dunn C.G., 1982,

Industrial Microbiology, the AVI. Pub.

Co. Inc., Westp Portt, Connecticit. Allen, R. D., 1980, Feedstuffs Ingredient

(5)

Soeka, Y. S., dan djajasukma, E., 1993,

Pengaruh Penambahan Sumber- Sumber Nitrogen terhadap Aktivitas Enzim Amilase Aspergillus niger dalam Media Onggok dan Dedak,

seminar hasil Litbang SDH Mikrobioligi LLI-Bogor, 165-171.

Crueger, W., and, A. Crueger, 1984,

Biotechnology: a Textbook of Industrial Microbiology, Brock, T.D.,

Editor, Science Tech., Madison, USA. Bernfeld, P., 1955, Methods in Enzymology,

Acad. Press Inc., New York.

Lowry, C.H., N.J. rosenrough, A. L. Farr, and R.J. Randall, 1951, Protein

Measurement With Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem., 183.

Sebayang, F., 1991, Konversi Penisilin

Menjadi 6-Apa Oleh Enzim Penisilin Aasilase yang Diembilkan dengan K-Karrageenan dan Kitin, Tesis, ITB,

Bandung.

(6)

LAMPIRAN

Lampiran 1. Harga Absorbsi dari Berbagai Konsentrasi Maltosa dalam Pembuatan Kurva Standar Maltosa Konsentrasi Maltosa (mg/ml) Absorbansi 0,1 0,115 0,2 0,231 0,3 0,334 0,4 0,442 0,5 0,523 0,6 0,642 0,7 0,738 0,8 0,823 0,9 0,971

(7)

Persamaan Regresi: Y= 0.018+1. 035X

Lampiran 2. Harga Absorbansi dari Berbagai Konsentrasi Larutan Bovin Serum Albumin (BSA) dalam Pembuatan Kurva Standar Protein

Konsentrasi BSA (ug/ml) Absorbansi

30 0,06 40 0,099 50 0,113 60 0,138 70 0,153 80 0,188 90 0,195

(8)