9
3 METODE
Penelitian ini dilaksanakan selama 14 bulan, yaitu dari April 2013 sampai Mei 2014 di Laboratorium Biokimia Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB, Seafast Center, Pusat Studi Satwa Primata LPPM IPB, dan Laboratorium Spektroskopi Departemen Fisika IPB.
Bahan
Kacang kedelai varietas lokal grobogan diperoleh dari Rumah Tempe Indonesia, Bogor sedangkan kacang bogor diperoleh dari pedagang di Pasar Anyar, Bogor. Serum berasal dari 3 orang responden penderita alergi. Bahan kimia yang digunakan antara lain adalah heksana, akrilamid, N,N’-metilen-bisakrilamid, tris base, glisin, SDS (sodium dodesil sulfat), -merkaptoetanol, APS (ammonium persulfat), TEMED (N,N,N’,N’-tetrametil-etana-1,2-diamin), metanol, asam asetat glacial, coomasie brilliant blue R-250 dan G-250, Tween-20, PBS (phosphate buffer saline), susu skim, antibodi IgG tikus anti IgE manusia yang berlabel enzim HRP (Horseradish Peroksidase) dari ICL Lab, substrat DAB (3,3’-diaminobenzidine), substrat TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin), dan Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder yang mengandung 10 protein dengan berat molekul 10-260 kDa.
Alat
Peralatan yang digunakan untuk isolasi dan karakterisasi protein alergen adalah alat sentrifuse dingin, pengering beku, alat SDS-PAGE (BIO-RAD), membran nitroselulosa 0.45 m, lempeng mikrotiter Nunc Maxisorb, perangkat ELISA, ELISA reader (BIO-RAD), spektrometer Ocean Optics USB4000-FL, dan peralatan gelas lainnya.
Prosedur Analisis Data
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap. Pada tahap pertama dilakukan isolasi protein kacang kedelai dan kacang bogor yang diolah dengan pemanasan. Selanjutnya dilakukan karakterisasi isolat protein dengan elektroforesis SDS-PAGE dan hidrofobisitas. Tahap selanjutnya adalah penentuan alergenisitas isolat protein melalui teknik imunobloting dan ELISA. Secara garis besar tahapan penelitian disajikan pada Gambar 2. Prosedur kerja masing-masing uji adalah sebagai berikut :
Pemanasan Basah dan Kering
Kacang kedelai dan kacang bogor mentah dipanaskan secara basah (perebusan dan pengukusan) dan dipanaskan secara kering (penyangraian dan pemanasan oven). Perebusan dilakukan dengan menggunakan air mendidih dan untuk tiap 1 kg kedelai diperlukan 2 L air. Perebusan dan pengukusan dilakukan selama 15, 30, dan 60 menit, sedangkan untuk oven dan penyangraian dilakukan selama 30 dan 60 menit. Proses oven dilakukan pada suhu 171 oC. Sebagai
10
kontrol negatif digunakan isolat protein yang diperoleh dari kacang kedelai dan kacang bogor tanpa pemanasan.
Preparasi Penghilangan Lemak Sampel (Liu et al. 2007)
Kacang kedelai yang telah dipanaskan, dikupas kulit arinya, kemudian digiling, dan diayak dengan ayakan 60 mesh. Kacang bogor tidak melalui proses penghilangan lemak karena kandungan lemaknya cukup rendah dan kadar air yang sangat tinggi sehingga kacang bogor hanya dikupas, dihaluskan, dan langsung diisolasi proteinnya.
Sampel kacang kedelai yang telah dihaluskan direndam dalam heksana dengan rasio sampel : heksana = 1 : 5 (v/v) selama 1 jam pada suhu kamar. Sampel disentrifus (8000 g selama 15 menit pada suhu 4 oC). Supernatan yang diperoleh dibuang, sedangkan endapannya diekstrasi kembali sebanyak 2 kali untuk menghilangkan kandungan lemak yang masih tersisa.
Isolasi Protein dengan Pengaturan pH (Speroni et al. 2010)
Sampel bebas lemak dicampur dengan akuades (rasio 1 : 10 w/v), kemudian pH suspensi dinaikkan sampai 8 dengan menggunakan NaOH 1 N, diaduk selama 90 menit pada suhu ruang dan disentrifus (8000 g atau 10000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 oC). pH supernatan yang diperoleh diturunkan sampai 4,5 dengan menggunakan HCl 1 N, lalu disentrifus kembali selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang, sedangkan endapan proteinnya diambil dan dikeringkan dengan pengering beku.
11 Elektroforesis SDS-PAGE (Bollag and Edelstein 1991)
Masing-masing isolat protein dianalisis dengan elektroforesis menggunakan gel akrilamid. Gel yang digunakan terdiri atas 2 bagian, yaitu gel atas (stacking gel) dan gel bawah (separating gel) dengan konsentrasi stacking gel 5 % dan separating gel 12 %. Pembuatan larutan kerja untuk elektroforesis SDS-PAGE terdapat pada Lampiran 1. Tahapan dalam analisis SDS-PAGE adalah sebagai berikut :
a Pembuatan separating gel
Dua lempeng kaca (mini slab) yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 mL larutan akrilamid 30 % (larutan A) dipipet ke dalam gelas piala, kemudian ditambahkan 2.5 mL larutan Tris-HCl/SDS pH 8.8 (larutan B) dan 3.5 mL akuabides. Larutan tersebut kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 100 L APS 10 % dan 10
L TEMED ditambahkan ke dalam larutan dan diaduk kembali dengan perlahan. Larutan dimasukkan ke dalam lempeng kaca (mini slab) tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempeng. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit.
b Pembuatan stacking gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tissue. Akuabides, larutan akrilamid 30 % (larutan A), dan larutan Tris-HCl/SDS pH 6.8 (larutan C) masing-masing sebanyak 2.3 mL, 0.67 mL, dan 1.0 mL dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya sebanyak 50 L APS 10 % dan 5 L TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis. Bufer elektroforesis dimasukkan ke dalam wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam.
c Preparasi dan injeksi sampel
Sebanyak 40 L sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 L bufer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100 oC. Sampel siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7-10
L protein marker sebagai standar. Standar yang digunakan adalah Thermo Scientific Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder yang mengandung 10 protein dengan berat molekul 10-260 kDa.
d Running SDS-PAGE
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilaksanakan
12
selama 180 menit sampai migrasi pewarna tersisa 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.
e Pewarnaan gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomasie brilliant blue G-250 (kurang lebih 20 mL). Kemudian digoyang-goyangkan sesekali selama 5-10 menit.
f Destaining gel
Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades sebanyak 2 kali. Larutan penghilang warna ditambahkan (destaining solution) dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
g Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan
Berat molekul protein sampel dapat dihitung melalui persamaan regresi yang diperoleh dari kurva hubungan antara mobilitas relatif protein penanda (Rf) dan logaritma berat molekul protein penanda. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi pewarna. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai berikut:
Rf= jarak migrasi protein jarak migrasi pewarna
Pengujian Hidrofobisitas Isolat Protein (Alizadeh and Li Chan 2000)
Satu seri konsentrasi larutan protein (0.005 – 0.025 % w/w) disiapkan dengan mengencerkan larutan stok protein (0.05 % w/w protein) dalam buffer fosfat 0.01 M (pH 7.0). Larutan ANS (8 mM dalam 0.01 M bufer fosfat pH 7.0) digunakan untuk menentukan indeks hidrofobisitas. Sebanyak 20 L larutan ANS ditambahkan ke dalam 4 mL larutan protein yang telah diencerkan. Larutan divorteks dan disimpan dalam ruang gelap selama 15 menit sebelum pengukuran. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang eksitasi 390 nm dan panjang gelombang emisi 470 nm. Indeks hidrofobisitas permukaan ditentukan melalui garis hubungan antara intensitas fluoresensi dengan konsentrasi protein.
Preparasi Serum Penderita Alergi
Serum berasal dari 3 responden penderita alergi. Setiap responden akan diminta untuk menyumbangkan darahnya sebanyak 20 mL. Pengambilan darah dilakukan oleh tenaga medis di klinik terdekat dari kampus IPB. Darah responden selanjutnya dibawa ke laboratorium untuk pemisahan serumnya dengan cara sentrifugasi. Darah yang diperoleh segera diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit, lalu disentrifus selama 20 menit pada kecepatan 1250 g. Supernatan yang diperoleh merupakan serum yang diduga banyak mengandung IgE. Serum disimpan pada suhu -20oC.
13 Imunobloting (Bollag and Edelstein 1991)
Gel hasil elektroforesis yang tidak diwarnai ditransfer ke membran nitroselulosa (0.45 m). Gel dan membran nitroselulosa disusun dalam alat transblotting, lalu diisi dengan bufer. Bloting dilakukan selama 1.5 jam pada arus konstan 0.25 A. Membran dicuci dengan PBST selama 10 menit, lalu diblok dengan Bloto 5 % dalam PBS selama 2 jam pada suhu kamar. Membran nitroselulosa dicuci dengan PBST dan ditambah serum penderita alergi yang telah diencerkan 2 kali dalam Bloto 5 %. Selanjutnya diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Pencucian dilakukan lagi dengan PBST, lalu diberi antibodi IgG tikus anti IgE manusia yang berlabel enzim HRP (pengenceran 1 : 2000 dalam Bloto). Kemudian diinkubasi selama 1 jam sambil digoyang. Hasil deteksi kompleks protein alergen dengan serum subyek akan terlihat setelah diberikan substrat DAB. Deteksi positif ditandai dengan terjadinya kompleks berwarna coklat pada membran nitroselulosa.
Pengujian Reaktivitas Imunologi menggunakan ELISA (Rupa et al. 2008) a Penentuan IgE total serum subyek alergi
Sebanyak 100 L serum dengan pengenceran 1 : 10 (dalam bufer karbonat-bikarbonat 0.05 M pH 9.8) diikatkan pada lempeng mikrotiter. Inkubasi dilakukan selama 18 jam pada suhu 4 oC, lalu dicuci sebanyak 3 kali dengan PBST (200 L/sumur). Selanjutnya sebanyak 200 L Bloto 5 % dalam PBS ditambahkan ke dalam lempeng mikrotiter dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC. Setelah dicuci sebanyak 3 kali dengan PBST (200 L/sumur), dilakukan penambahan antibodi HRP Conjugated Mouse anti-Human IgE sebanyak 100 L/sumur yang sebelumnya telah diencerkan 1 : 6000 dalam Bloto. Selanjutnya lempeng mikrotiter diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam, dicuci dengan PBST (200 L/sumur) sebanyak 3 kali, lalu ditambahkan substrat TMB sebanyak 100 L/sumur, dan diinkubasi lagi selama 20 menit pada suhu 37 oC. Hasil positif ditandai dengan timbulnya warna biru. Reaksi dihentikan dengan menggunakan H2SO4 2 M sebanyak 50 µL/sumur dan
larutan berubah warna menjadi kuning cerah. Optical Density (OD) diukur dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. b Penentuan sifat alergenisitas protein kacang
Sebanyak 100 µL/sumur protein sampel yang terlarut dalam bufer karbonat-bikarbonat 0.05 M, pH 9.8 diikatkan ke dalam lempeng mikrotiter. Inkubasi dilakukan selama 18 jam pada suhu 4 oC, lalu dicuci sebanyak tiga kali dengan PBST (200 µL/sumur). Selanjutnya lempeng mikrotiter diblok dengan larutan Bloto sebanyak 200 µL/sumur dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC. Lempeng mikrotiter kemudian dicuci sebanyak tiga kali dengan PBST (200 µL/sumur). Serum penderita alergi yang telah diencerkan 1 : 10 dalam Bloto ditambahkan pada lempeng mikrotiter sebanyak 100 µL/sumur dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC. Setelah inkubasi, lempeng mikrotiter dicuci sebanyak tiga kali dengan PBST (200 µL/sumur). Penambahan antibodi sekunder dilakukan setelah sebelumnya telah diencerkan 1 : 6000 dalam Bloto. Antibodi sekunder yang ditambahkan ke dalam lempeng mikrotiter sebanyak 100 µL/sumur dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam. Lempeng mikrotiter kemudian dicuci
14
sebanyak tiga kali dengan PBST lalu ditambahkan substrat TMB sebanyak 100 µL/sumur, dan diinkubasi lagi selama 20 menit pada suhu 37 oC. Hasil positif ditandai dengan timbulnya warna biru. Reaksi dihentikan dengan menggunakan H2SO4 2 M sebanyak 50 µL/sumur dan larutan berubah warna
menjadi kuning cerah. Optical Density (OD) diukur dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. Persen penurunan reaktivitas dihitung berdasarkan rumus berikut (Frias et al. 2008):
% penurunan reaktivitas OD =
=OD sampel tanpa pemanasan – OD sampel setelah pemanasan
