Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013
386
ISOLASI DAN PENENTUAN AKTIFITAS SPESIFIK KLOROFILASE DARI DAUN MAHONI (Swietenia mahagoni)
(Isolation and Determination Specific Activity of Chlorophyllase from Mahogany Leaf (Swietenia mahagoni)) Nurlita Khasanah., Dra. Wuryanti, M.Si., Dra. Nies Suci M, M.S. Laboratorium Biokimia, Jurusan Kimia, Universitas Diponegoro, Semarang
Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275, Telepon (024) 7474754 nurlitachem@gmail.com
ABSTRAK
Telah dilakukan isolasi dan penentuan aktifitas spesifik klorofilase dari daun mahoni (Swietenia mahagoni). Tahapan penelitian meliputi isolasi plastida, isolasi enzim klorofilase, penentuan aktifitas spesifik klorofilase pada pH= 7,4 dan penentuan aktifitas spesifik klorofilase dengan berbagai variasi pH dan waktu inkubasi. Hasil penelitian diperoleh bahwa aktifitas spesifik tertinggi klorofilase dari daun mahoni (Swietenia mahagoni) terdapat pada kejenuhan aseton 80-95%, yaitu sebesar 13,605 unit/mg protein Adapun pengaruh pH dan waktu inkubasi terhadap aktifitas spesifik tertinggi pada klorofilase terdapat pada pH 8,6 dan waktu inkubasi 5 menit, sedangkan aktifitas spesifik klorofilase terendah pada pH 7,0 dan waktu inkubasi 45 menit. Adanya variasi pH dan waktu inkubasi menunjukkan bahwa pH tidak terlihat mempengaruhi aktifitas spesifik klorofilase sedangkan semakin lama waktu inkubasi, aktifitas spesifik klorofilase semakin menurun.
Keywords: isolasi klorofilase, fraksinasi aseton, daun mahoni
ABSTRACK
Enzyme chlorophyllase was isolated and determination specific activity of chlorophyllase from mahoni leaf (Swietenia mahagoni) Several stage of this work including plastid isolation, determination of specific activity chlorophyllase at pH= 7,4 and determination of specific activity of chlorophyllase with pH and incubation time variation. Result showed the highest specific activity in leaf mahogany (Swietenia mahogany) present in acetone with saturation of 80-95%, with value is 13.605 units/mg protein. The influence of pH and incubation time of the higher specific activity of chlorophyllase at pH 8.6 and incubation time of 5 minutes, whereas the smaller specific activity of chlorophyllase at pH 7.0 and incubation time of 45 minutes. The presence of variation pH and incubation time on specific activity of chlorophyllase, showed that variation pH not influence specific activity of chlorophyllase and the longer of incubation time, specific activity of chlorophyllase was decreased.
Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013
387 I. PENDAHULUAN
Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai katalisator reaksi-reaksi kimia dalam sistem biologis. Enzim memiliki daya katalitik yang tinggi. Kemampuan enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi tergambar melalui aktifitasnya. Harga aktifitas enzim dipengaruhi beberapa faktor antara lain: pH, suhu, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat dan inhibitor (Lehninger, 1982).
Enzim memegang peranan dalam berbagai aspek dalam kehidupan, misalnya enzim klorofilase. Enzim klorofilase memiliki peranan penting dalam metabolisme daun. Secara in vitro enzim ini mengkatalisis pemutusan gugus fitol dari klorofil dan juga feofitin (Goodwin, 1976) dan dapat dimanfaatkan di berbagai bidang, salah satunya yaitu di bidang industri minyak. Khamessan, dkk., (1995) melaporkan bahwa klorofilase dapat berfungsi sebagai agen bleaching pada minyak sayur dengan menghilangkan senyawa klorofil.
Berdasarkan manfaat tersebut, perlu dilakukan penelitian mengenai aktifitas spesifik klorofilase yang terdapat pada daun mahoni. Tanaman mahoni merupakan tanaman yang memiliki nilai potensial dalam bahan pembuatan obat-obatan. Namun daun mahoni masih jarang di manfaatkan secara luas. Diharapkan dengan isolasi klorofilase pemanfaatan daun pada mahoni dapat lebih luas dan dapat mengetahui informasi mengenai aktifitas klorofilase yang terdapat di daun mahoni tersebut.
II. METODE KERJA 2.1 Alat dan Bahan 2.1.1 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya yaitu alat-alat gelas laboratorium, Spectronic UV mini 1240, sentrifus Heraecus model Biofuge 13, inkubator, detektor UV (Spectroline ENF-24/F), dll.
2.1.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini diantaranya yaitu: daun mahoni (Swietenia mahagoni), aseton p.a., glisin (merck), polivinylpirolidon (merck), sodium
deodocyl sulfate (merck), petroleum eter p.a., NaCl, dll.
2.2 METODE KERJA
2.2.1 Isolasi klorofil dengan Metode Kromatografi Kolom
Isolasi klorofil dari daun mahoni menggunakan metode kromatografi kolom (Limantara, dkk., 2009). Daun mahoni yang telah kering kemudian di blender dan di maserasi dengan metanol:aseton (7:3, v/v). Lalu klorofil yang diperoleh digunakan sebagai substrat untuk penentuan aktifitas spesifik klorofilase.
2.2.2 Isolasi Plastida
Daun mahoni yang telah dibersihkan dan dikeringkan diiris kecil-kecil lalu diblender kemudian ditimbang sebanyak 75 gram lalu dimaserasi dengan 500 mL larutan aseton. Homogenat disaring menggunakan corong Buchner. Filtrat hasil maserasi digabungkan untuk selanjutnya dipekatkan dengan rotary evaporator lalu dikeringkan dan disimpan dalam freezer.
2.2.3 Isolasi Enzim Klorofilase
Ekstrak aseton dari daun mahoni yang berupa padatan hasil dari pengeringan kemudian ditimbang sebanyak 2,01 gram. Selanjutnya isolasi klorofilase dengan menggunakan 40 mL larutan pengekstrak yang terdiri dari tris-hidroksimetil-aminometan 42 mM, glisin 320 mM, glukosa 670 mM, polivinylpirolidon 2% (w/v), sodium deodocyl sulfate 0,5% (w/v) dengan kondisi pH larutan campuran tersebut sebesar 7,4. Kemudian dilakukan pengadukkan lambat menggunakan pengaduk magnet selama 8 jam pada suhu 4oC, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm, selama 20 menit. Selanjutnya filtratnya difraksinasi dengan pelarut aseton.
2.2.4 Fraksinasi Enzim Klorofilase dengan pelarut aseton
Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan enzim (enzim kasar) dengan prinsip pengendapan. Untuk fraksi 0-20%, larutan aseton dingin dengan kejenuhan 0-20% ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam larutan ekstrak kasar enzim, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Filtrat hasil fraksi 1 dilanjutkan untuk fraksinasi selanjutnya yaitu
Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013
388 fraksi 2, 20-40%, fraksi 3, 40-60%, fraksi 4, 60-80%, fraksi 5, 80-95%.
2.3.5 Penentuan Unit Aktifitas Enzim Klorofilase
Satu unit aktifitas enzim klorofilase pada penelitian ini didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang dapat menghidrolisis 1 mg klorofil per menit pada kondisi optimum. Untuk menentukan aktifitas enzim dilakukan dengan cara, larutan campuran terdiri dari larutan aseton 35% (v/v), larutan natrium sitrat 12 mM, larutan klorofil dalam aseton, larutan enzim dan larutan bufer fosfat pada pH 7,4 dengan total volume 0,7 mL serta dibuat larutan pengontrol. Kemudian masing-masing larutan di sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit. Lalu aktifitasnya diuji dengan pelarut organik dan diukur pada panjang gelombang 662 nm dan dibandingkan dengan larutan kontrol. 35% (v/v), larutan natrium sitrat 12 mM, larutan klorofil dalam aseton, larutan enzim dan larutan bufer fosfat dengan pH yang divariasikan pada pH 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 7,0; 7,4; 7,8; 8,2; 8,3; 8,4; 8,5; dan 8,6 dan total volume 0,7 mL, serta dibuat larutan pengontrol. Kemudian masing-masing
larutan di sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit. Lalu aktifitasnya diuji dengan pelarut organik dan diukur pada panjang gelombang 662 nm dan dibandingkan dengan larutan kontrol.
2.2.8Penentuan Aktifitas Spesifik Klorofilase yang dipengaruhi Variasi Waktu Inkubasi
Larutan campuran terdiri dari larutan aseton 35% (v/v), larutan natrium sitrat 12 mM, larutan klorofil dalam aseton, larutan enzim dan larutan bufer fosfat dengan pH 7,4 dengan total volume 0,7 mL serta dibuat larutan pengontrol. Masing-masing larutan d2nkubasi pada suhu 35oC dengan waktu inkubasi yang divariasikan yaitu 5 menit, 10 menit, 15 menit, 20 menit, 25 menit, 30 menit, 35 menit, 40 menit dan 45 menit. Lalu aktifitasnya diuji dengan pelarut organik dan diukur pada panjang gelombang 662 nm dan dibandingkan dengan larutan kontrol.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Isolasi Klorofil dengan Metode Kromatografi Kolom
Ekstraksi pigmen klorofil ini dilakukan untuk mendapatkan klorofil dari daun mahoni 2.2.6 Penentuan Kadar Protein dengan (Swietenia mahagoni), yang akan digunakan
Metode Lowry
Kadar protein hasil fraksinasi aseton ditentukan dengan metode Lowry menggunakan larutan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai protein standar.
2.2.7. Penentuan Aktifitas Spesifik Klorofilase yang dipengaruhi Variasi pH
Untuk menentukan aktifitas enzim yang dipengaruhi pH dilakukan dengan cara, larutan campuran terdiri dari larutan aseton
sebagai substrat pada penentuan aktifitas spesifik klorofilase. Hasil kromatografi kolom silika gel didapatkan 23 botol fraksi, dengan 11 fraksi yang masing-masing akan di uji dengan KLT. Hasil KLT produk isolasi klorofil dengan kromatografi kolom dengan eluen heksan:eter:aseton (6:3:2) masing-masing fraksi memberikan noda sebanyak 6 buah. Profil KLT tersebut mengindikasikan ada berbagai macam produk yang dihasilkan serta menunjukkan bahwa, eluen yang
Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013
389 digunakan masih belum cukup untuk mendapatkan isolat klorofil murni.
Hasil analisis klorofil dengan KLT, menunjukkan bahwa klorofil a dan klorofil b berhasil di isolasi dari daun mahoni yang terdapat di fraksi A, ditandai dengan terbentuknya noda berwarna hijau muda untuk klorofil a dan noda berwarna hijau tua untuk klorofil b, dengan Rf dari klorofil a sebesar 0,43 serta setelah di analisis dengan lampu detektor UV, λ=365 nm terbentuk noda dengan warna merah bata menyala. Klorofil pada fraksi A tidak dimurnikan kembali dan digunakan sebagai substrat pada penentuan aktifitas spesifik klorofilase.
3.2 Isolasi Enzim Klorofilase
Sebelum mengisolasi enzim klorofilase pada daun mahoni (Swietenia mahagoni) terlebih dahulu dilakukan isolasi jaringan sel (plastida) prosedur selanjutnya isolasi enzim klorofilase. Hasil yang diperoleh yaitu endapan berwarna hijau kecoklatan. Dalam hal ini, SDS merupakan suatu molekul yang memiliki rantai lipofilik yang dapat berikatan dengan protein pada permukaan hidrofiliknya. Sehingga ikatan protein yang terikat dengan kuat melalui gaya hidrofobik dapat terputuskan melalui proses pelarutan membran. (Scopes, 1982; Johnston, 1987). Sedangkan untuk mengurangi pengaruh dari senyawa-senyawa fenol yang dapat menginaktivasi enzim pada saat mengukur aktifitas enzim digunakan polivinylpirolidone (PVP). Berdasarkan penelitian (Lopez, dkk., 1992) diinformasikan bahwa polivinylpirolidone (PVP) yang digunakan pada saat isolasi enzim klorofilase dapat meningkatkan aktifitas enzim klorofilase dari Citrus limon.
larutan enzim berwarna kuning dan endapan yang berwarna coklat kehijauan dengan nilai tertinggi dari aktifitas klorofilase terdapat pada fraksi 5, 80-95%.
Selain menggunakan aseton, fraksinasi juga dapat menggunakan pelarut organik lainnya dan garam amonium sulfat. Penelitian sebelumnya (Karboune, dkk., 2005; Arkus, dkk., 2006; Kumar, dkk., 2011) mengisolasi dan fraksinasi klorofilase menggunakan pelarut aseton. Karena pelarut aseton yang bersifat lebih nonpolar dan klorofil akan larut dalam aseton dan protein dapat terendapkan tanpa mengendapkan klorofil.
3.4 Penentuan Kadar Protein dengan metode Lowry
Kadar protein pada tiap-tiap fraksi diukur dengan menggunakan metode Lowry. Melalui metode ini, protein dalam daun mahoni
(Swietenia mahagoni) akan bereaksi dengan pereaksi Lowry, menghasilkan senyawa kompleks berwarna biru. Hasil absorbansi yang diperoleh kemudian diplotkan pada kurva standar BSA.
Kadar protein dari daun mahoni yang diperoleh pada fraksi tertinggi nilainya yaitu 65,172 mg/mL. Penelitian sebelumnya dengan penggunaan 2,01 gram serbuk yang diekstrak dan 40 mL larutan pengekstrak yang dikuti dengan pengendapan aseton mendapatkan 0,387 mg protein pada daun suji, Sibarani, dkk., (1995).
3.5 Penentuan Aktifitas Spesifik Enzim klorofilase
Enzim Klorofilase ditemukan pertama kali oleh Wilstater dan Stoll pada tahun 1910. Nilai aktifitas enzim klorofilase ditentukan dari banyaknya substrat klorofil yang
Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013
390 pelarut aseton
Filtrat hasil penyaringan yang berisi campuran protein enzim dan protein non enzim ini disebut ekstrak kasar enzim, sehingga masih membutuhkan pemurnian lebih lanjut, menggunakan fraksinasi dengan pelarut aseton. Hasil yang diperoleh yaitu klorofil yang diukur dengan metode spektrofotometri pada λ= 662 nm (Terpstra, dkk., 1981., Khamessan, dkk., 1994).
Hasil yang diperoleh tidak adanya penampakkan warna hijau pada larutan tersebut. Hasil yang seharusnya adalah terbentuknya larutan berwarna hijau yang (Swietenia mahagoni) yang dipengaruhi variasi pH, dilakukan terhadap enzim fraksi terbaik hasil fraksinasi dengan aseton. Hasil yang diperoleh, pada pH= 6,4 aktifitas enzim spesifik klorofilase di daun mahoni mengalami penurunan dengan unit aktifitas sebesar 4,487 unit/mL, pada pH= 7,4 hingga pH= 8,6 aktifitas enzim klorofilase dapat mengalami peningkatan. Gambar grafik dari pengaruh pH terhadap aktifitas enzim klorofilase pada daun mahoni dapat dilihat pada gambar 3.2 berikut ini: 6.000 a k ti v it a s sp e si fi k (U /m g p ro te in ) 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 6 7 8 9 variasi pH
Gambar 3.2 Grafik pengaruh pH terhadap aktifitas spesifik klorofilase pada daun mahoni (Swietenia mahagoni)
Dari gambar gambar 3.2 menunjukkan tidak adanya puncak optimum yang diperoleh dari hasil kerja enzim tersebut dan pH tidak terlihat mempengaruhi aktifitas spesifik enzim klorofilase dikarenakan kondisi kemurnian enzim dan substrat yang masih belum murni. Selain itu, aktifitas enzim yang mulai menurun dapat disebabkan kontak enzim dengan sisa aseton hasil fraksinasi. Karena aseton dapat berfungsi sebagai inhibitor. (Garcia, 1980).
3.7 Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktifitas Spesifik Klorofilase
Waktu inkubasi merupakan waktu kontak antara enzim dan substrat untuk menghasilkan produk. Hasil menunjukkan bahwa enzim klorofilase hasil isolasi dari daun mahoni (Swietenia mahagoni) memiliki pola grafik yang tidak semestinya dari kerja suatu enzim. Seperti yang terlihat pada gambar 3.3 semakin lama waktu inkubasi aktifitas enzim klorofilase semakin menurun.
14.000 ak tiv ita s sp es ifi k( U /m gp ro te in ) 12.000 10.000 8.000 6.000 4.000 2.000 0.000 0 20 40 60 t inkubasi (menit)
Gambar 3.3 Grafik pengaruh waktu inkubasi terhadap aktifitas spesifik klorofilase pada daun mahoni (Swietenia mahagoni)
Penurunan aktifitas dapat disebabkan karena enzim klorofilase yang diperoleh masih belum murni dan adanya pengaruh inhibitor pada saat pembentukkan reaksi kompleks enzim substrat. Selain itu juga dapat disebabkan karena waktu kontak dengan aseton dan fitol yang dapat menurunkan laju reaksi. Karena aseton dan fitol dapat bertindak sebagai inhibitor reaksi, sehingga akan terjadi penyimpangan terhadap aktifitas yang diperoleh dan memungkinkan terjadinya reaksi balik penguraian kompleks enzim substrat menjadi enzim bebas dan substrat kembali sehingga produk yang dihasilkan semakin sedikit (Garcia, dkk., 1980).
IV. KESIMPULAN
Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa :
1. Enzim klorofilase dapat diisolasi dari daun mahoni (Swietenia mahagoni) yang difraksinasi menggunakan pelarut aseton.
Vol 1, No 1, Hal 386 – 392 , 2013
391 Hasil fraksinasi dengan pelarut aseton menunjukkan aktifitas spesifik tertinggi pada daun mahoni (Swietenia mahagoni) terdapat pada Fraksi ke 5, (80-95)%, nilainya yaitu 13,605 unit/mg protein. 2. Pengaruh pH dan waktu inkubasi terhadap
aktifitas spesifik tertinggi pada klorofilase terdapat pada pH 8,6 dan waktu inkubasi 5 menit, sedangkan aktifitas spesifik klorofilase terendah pada pH 7,0 dan waktu inkubasi 45 menit, dengan pola grafik yang tidak sewajarnya (tidak diperoleh kondisi optimum dari kerja enzim klorofilase tersebut). Semakin lama waktu inkubasi, aktifitas spesifik klorofilase semakin menurun dan variasi pH tidak mempengaruhi aktifitas spesifik klorofilase pada daun mahoni (Swietenia mahagoni).
V. DAFTAR PUSTAKA
1. Arkus, A.J., Kiani, dan Jez, M, Joseph., 2006, Development of High- Troughput purification method and a continous assay system for Chlorophyllase. USA, Donald Danforth Plant Sciences, Elsivier: Analytical Biochemistry, 353, 93-98
2. Garcia, A.L., Galindo, L., dan Navaro, S., 1980, Chlorophyllase in Citrus Leaves, Kinetics Aspects of Reaction, Biol.Plant, 22,(4), 255-262
3. Goodwin, T.W., 1976, Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, edisi kedua, Vol.,2 Acid Pess, New York 4. Johnston, A., 1987, Immunochemistry in
Practice, edisi kedua. Blackwill Sci, Publ. Grit, Britain
5. Karboune, Salwa, Neufeld, Ronald dan Kermasha, S., 2005, Immobilization and biocatalysis of chlorophyllase in selected organic solvent systems, Elsevier, Journal of Biotechnology, 120, 273-283
6. Khamessan, A., Kermasha, S., dan Mollimard, L., 1995, Optimization of Chlorophllase-Catalyzed Hydrolytic Activity in a Micellar Ternary System, Biotechnol, Appl. Biochem, 22, 327-343 7. Kumar, N., Gupta, S., Gupta, S.M., 2011,
Role of chlorophyllase in chlorophyll homeostasis and post-harvest breakdown
