Metaboromu kaiseki ni yoru bitaminC no kogan sayo no kaimei

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract. Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). メ夕ボローム解析によるビタミンCの抗がん作用の解明 上瀧, 萌 慶應義塾大学湘南藤沢学会 2012 生命と情報 No.19 (2012. ) ,p.107- 114 近年, 副作用の少ないがんの代替療法として高濃度ビタミンC点滴療法が注目を集めている。一般 的に抗酸化物質として知られるビタミンCが, むしろ酸化促進作用を発揮することでがん細胞に選択的な毒性をもたらすと示唆されているが, その作用機序は未だ明らかになっていない。さらにビタミンCに対する感受性は一様ではなく, 同じがん種由来でも細胞株間で顕著な差があることも確認されている。本研究では, ビタミンCの毒性作用機序をメタボロミクスの観点から解明することを目的とし, まずはビタミンC に対し高感受性を示したMCF7(ヒト乳がん細胞株)および低感受性を示したHT29(ヒト結腸がん細胞 株)を用い, キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析装置(CETOFMS)による経時的なメタボローム解析を行った。結果, それぞれの細胞において細胞毒性が生じるビタミンC濃度条件では, プロファイルの変動が類似しており, 加えてエネルギー生成の低下が示唆され, またNAD, NADHの低下に伴い, 解糖系上流およびTCA回路上流に位置する物質濃度が増加したことから, NADの分解に起因するエネルギー代謝全体の停滞が示された。さらに, 抗酸化物質をビタミンCと共添加することにより両細胞株における細胞死が顕著に回避され, ビタミンCによる毒性が緩和されたことから, ビ夕ミンCによる細胞毒性が主にROSの発生によるものであることが示唆された。したがって, ビタミンCによる細胞毒性がエネルギー代謝に顕著な影響を与え, さらにビタミンCによる細胞毒性がROSと密接な関係をもつことを浮き彫りにした。一方, 正常細胞に対するビタミンCの毒性の低さを検証すべく, まず正常細胞とがん細胞のビタミンCに対する感受性を比較したところ, 4種の正常細胞のうち3種において, がん細胞に対する毒性と同程度の毒性が生じ, ビタミンCのがん 細胞選択的毒性がこれまでに考えられていたよりも不完全なものであることも示唆された。今後, ビタミンCを投与した正常細胞におけるメ夕ボロームデ一夕との比較解析を行うことで, 高濃度ビタミンC療法の有効性を高め, さらに副作用の可能性についても洞察を深めることができると考える。 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2012年度学生論文集 卒業論文ダイジェスト Technical Report http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000019 -0107.

2012年 度 卒 業 論 文 ダ イ ジ ヱ ス ト. メ夕ボローム解析によるビタミンC の抗がん作用の解明 慶應義塾大学環境情報学部 上瀧萌. 要旨 近 年 ， 副 作 用 の 少 な い が ん の 代 替 療 法 と し て 高 濃 度 ビ タ ミ ン C 点 滴 療 法 が 注 目 を 集 め て い る .一 般 的 に抗酸化物質として知られるビタミンc が， むしろ酸化促進作用を発揮することでがん細胞に選択的な 毒性をもたらすと示唆されているが， その作用機序は未だ明らかになっていない.. さらにビタミンC に. 対する感受性は一様ではなく， 同じがん種由来でも細胞株間で顕著な差があることも確認されてい る. 本 研 究 で は ， ビ タ ミ ン C の 毒 性 作 用 機 序 を メ タ ボ ロ ミ ク ス の 観 点 か ら 解 明 す る こ と を 目 的 と し ， ま ず は ビ タ ミ ン C に 対 し 高 感 受 性 を 示 し た M C F 7 ( ヒ ト 乳 が ん 細 胞 株 ）お よ び 低 感 受 性 を 示 し た H T 2 9 ( ヒト 結 腸 が ん 細 胞 株 ）を 用 い ， キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 飛 行 時 間 型 質 量 分 析 装 置 (C E -T O F M S ) に よ る 経 時 的 な メ タ ボ ロ ー ム 解 析 を 行 っ た . 結 果 ， そ れ ぞ れ の 細 胞 に お い て 細 胞 毒 性 が 生 じ る ビ タ ミ ン C濃 度 条 件 で は， プ ロ フ ァ イ ル の 変 動 が 類 似 し て お り ，加 え て エ ネ ル ギ ー 生 成 の 低 下 が 示 唆 さ れ ， また N A D , N A D H の 低 下 に 伴 い ， 解 糖 系 上 流 お よ び T C A 回 路 上 流 に 位 置 す る 物 質 濃 度 が 増 加 し た こ と か ら ，N A D の 分 解 に起因するエネルギー代謝全体の停滞が示された.. さらに， 抗 酸 化 物 質 を ビ タ ミ ン C と共添加すること. に よ り 両 細 胞 株 に お け る 細 胞 死 が 顕 著 に 回 避 さ れ ， ビ タ ミ ン C に よ る 毒 性 が 緩 和 さ れ た こ と か ら ， ビ夕 ミンC に よ る 細 胞 毒 性 が 主 に R O S の 発 生 に よ る も の で あ る こ と が 示 唆 さ れ た .. したがって， ビタミン C. に よ る 細 胞 毒 性 が エ ネ ル ギ ー 代 謝 に 顕 著 な 影 響 を 与 え ， さ ら に ビ タ ミ ン C に よ る 細 胞 毒 性 が 'R O S と密接 な関係をもつことを浮き彫りにした. 一方，正常細胞に対するビタミンC の毒性の低さを検証すべく， ま ず 正 常 細 胞 と が ん 細 胞 の ビ タ ミ ン C に 対 す る 感 受 性 を 比 較 し た と こ ろ ，4 種 の 正 常 細 胞 の う ち 3種にお いて， が ん 細 胞 に 対 す る 毒 性 と 同 程 度 の 毒 性 が 生 じ ， ビ タミン C の が ん 細 胞 選 択 的 毒 性 が こ れ ま で に 考 え ら れ て い た よ り も 不 完 全 な も の で あ る こ と も 示 唆 さ れ た . 今 後 ， ビタミンC を 投与した正常細胞にお け る メ 夕 ボ ロ ー ム デ 一 夕 と の 比 較 解 析 を 行 う こ と で ， 高 濃 度 ビ タ ミ ン C 療 法 の 有 効 性 を 高 め ， さらに副 作用の可能性についても洞察を深めることができると考える. K e y w o r d s: ビタミン C ， が ん ， メ 夕 ボ ロ ミ ク ス ， 酸 化 促 進 作 用. 107.

1.背景 ビタミン C ( ア ス コ ル ビ ン 酸 ）は抗酸 化 物 質 の 一 " ^ と し て 知 ら れ ， 酸 化 ス ト レ ス を 発 生 さ せ る ス ー パ ー 才キシドラジカル（ 〇2 —) ， ヒ ド ロ キ シ ラ ジ カ ル （ 0 H つ， 過 酸 化 水 素 (H 202) な ど の 活 性 酸 素 種 (R O S ) を 除去するという優れた性質を持っている（ A h m a d e M /. ，2 0 0 5 ) . — 方 ， 高 濃 度 の ビ タ ミ ン C が 血 中 に 投 与 さ れ 酸 化 さ れ る と ， 副 産 物 と し て H2〇2 を 発 生 さ せ る こ と も 知 ら れ て い る . っ ま り ビ タ ミ ン C は 抗 酸 化 物 質 で あ る 反 面 ， 活 性 酸 素 を 発 生 さ せ る 酸 化 促 進 剤 （プ ロ オ キ シ ダ ン ト ）で あ る と も 言 え る （ L iw a /., 2 007 ) . 近 年 ， こ のビタミン C に 選 択 的 な 抗 腫 瘍 効 果 が 確 認 さ れ ， ビ タミン C を 大 量 に 投 与 す る 高 濃 度 ビ. 夕ミン C 点 滴 療 法 が ， 副 作 用 の 少 な い が ん の 代 替 療 法 と し て 注 目 さ れ て い る （ H offer W a/. ，2 0 0 8 ， Ohno e h / . , 2 0 0 9 ).. 4 3 種 の が ん 細 胞 株 お よ び 5種 の 正 常 細 胞 に 対 し ビ タ ミ ン C を 添 加 し た と こ ろ ， 正 常 細 胞 で. は20 m M 以 上 の ビ タ ミ ン C 濃 度 に お い て も 毒 性 が 見 ら れ な か っ た が ， が ん 細 胞 株 の 7 5 % に 対 し 10 m M 以. 下 の 濃 度 で 顕 著 な 毒 性 を 示 し た （ Chen e h /.， 2008) . 血液中のビタミン C が高濃度の状態で維持される と， モノデヒドロアスコルビン酸レダクタ一ゼ（ N A D H ) の働きでモノデヒドロアスコルビン酸ラジカル (A A ’ ）に酸化され， それに伴って放出された電子は金属タンパク質中の F # な ど を 還 元 す る （ C h e n e ffl /., 20〇5， L e v i n e d a /.，2 0 11).続いて還元された Fe 2+などは〇2 _を 生 成 す る .こ の 0 2 — は， スーパ一オキシド ジスム夕ーゼ（ S O D ) により H 20 2に 変 換 さ れ る .こ の 反 応 が 血 液 中 で 起 こ っ た 場 合 ， H 20 2は力夕ラ一ゼ やグノレ夕チオンペル才キシダ一ゼなどの抗酸化酵素により安全な水と酸素に分解される.細胞外の間質 液へも同様にビタミン C から H 20 2が作られ， その一部は細胞膜を透過して細胞内へ移動する （ A n tu n esef ゴ，2000) . 正常細胞に入った H2O2 は血液中と同様に分解される一方，多くのがん細胞では抗酸化酵素 (S O D とカタラ一セ')の発現量か少ないことが知られている （ Ahm ad ef a /.，2005, Oberley ef a /.，1979)• 以 上のことからがん細胞では抗酸イ匕能が低いため，高濃度のビタミン C を投与するとR 0 S をうまく消去で きず蓄積し， ミトコンドリアがダメージを受け A T P 産生に支障をきたし，細 胞 死 に 至 る と い う 説 (Chen 2007)が有力であるが， ビタミン C ががん細胞に対してもたらす毒性作用の詳細なメカニズムは諸 説あり（ C a r o s io W a /.， 2〇〇7)，未 だ 明 確 な こ と は 分 か っ て い ない.また培養細胞レベルでは全てのがん種 に一様に効果があるわけではないことも明らかとなっており（ C h e n e M /，2008)， ビタミン C に対する感 受性には細胞株間で顕著な差があり， またビタミン C によるがんの治療 法 は 発 展 途 上 段 階 に あ る .ま た， ビタミン C によるがん細胞や正常細胞に対するメ夕ボロームレベルでの影響についても未だ不明な 部 分 が 多 い .そ こ で 本 研 究 で は ， ビタミン C の投与による代謝応答， および感受性の異なる細胞株にお けるその代謝応答の違いをメ夕ボロームレベルで明らかにすることを目的とし， C E -T O F M S を用いて ビタミンC を投与したビタミン C 感受性の異なる培養細胞のメ夕ボローム実験及びその解析を行った. また， ビタミン C の酸化促進作用により発生するとされる r 〇s によって選択的毒性が発揮されている可 能性が考えられているが， これを検証する目的で，がん細胞に抗酸化物質をビタミンc と共添加するこ と で 毒 性 濃 度 域 に お い て 見 ら れ た 細胞死が顕著に回避されるかを調査した .更に，高濃度ビタミン C の 投与による毒性が低いとされる正常細胞においてどのような代謝変動が生じているのかを確かめるため の予備実験として， まず正常細胞とがん細胞のビタミン C に対する感受性を比較した.. 2 . 対象と手法 2.1ビタミンC感受性株と低感受性株を用いたメ夕ボ ロ ー ム 解析 2.1.1メ夕ボ ロ ー ム 実験に用いた対象と実験条件 がん細胞においてビタミン C に対して感受性差のある細胞株を選定するため，A 4 3 1 (ヒト扁平上皮癌 細胞株)， Panc-1(ヒト滕臓癌細胞株 )， HeLa (ヒト子宮頸癌細胞株)， HT29, MCF7 を用いて様々なビ夕 ミンc 濃度条件における細胞生存率を調べた結果， ビタミン c に対して高感受性を示したM C F 7 と低感受 性を不した HT2 9 を用いて，比 較 メ タ ボ ロ ー ム 解 析 を 行 っ た .ま た 添 加 す る ビ タ ミ ン c 濃度は q，〇2 , j 〇， 1 0 mM とし，処理時間はビタミン C添加直前を0 h とし，添 加 後 ^ , 6 , 12h に設定した. 2.1.2 メ タ ボ ロ ー ム 実 験 手 法. 108.

6 穴 プ レ ー ト に H T 2 9 または M C F 7 を そ れ ぞ れ 2 x l 〇5 ce lls/m L で 1 w e ll に 対 し て 2 m L ず つ 播 種 し ， G lucose (1 .0 g /L )， Glutamine (0 .5 8 4 g /L )， Pyruvate ( 0 .11 g /L ) 含 有 D M E M 培 地 （ Sigma^ D 2 9 0 2 ) に て 2 4 時 間 前 培 養 を. 行 っ た . 次 に ， ビタミン C 添 加 1 時 間 前 に こ の D M E M 培 地 に て 培 地 交 換 を 行 っ た . 1 w e ll 毎 に 10% 添 加 し 2 時 間 曝 露 し た .. その後， ビタミンC を. また， ビ タミン C は 非 常 に 分 解 し や す い 物 質 で あ る こ と か ら ， 添. 加 す る 直 前 に 用 時 調 製 し ，P B S で 希 釈 し 吸 光 度 を 測 定 す る こ と で ビ タ ミ ン C濃 度 の 定 量 を 行 っ た .コ ン トロ一 ル と し て ビ タ ミ ン C 添 加 直 前 を O h とし， ビ タミン C 添 加 後 ， 1 ，2, 6 , 1 2 h 後にそれぞれのサンプノレ を 採 取 し た . サ ン プ ル 数 は 一 条 件 に つ き ， n = 3 とした .. また， メ 夕 ボ ロ ー ム 解 析 で 細 胞 内 代 謝 物 質 濃. 度を細胞数で正規化する必要があるため， トリパンブルー試薬を用いてマイクロプレートリーダーで測 定を行うことで，各時系列点における生細胞数を調べた.. 2.1.3サンプルの前処理 5 %マ ン ニ ト ー ル を 1 以己丨丨に対して1 1111^添 加 し 2 度 洗 浄 し た . 25 ^ M の L -m ethionine su lfon e ， M E S, ( I S 1 ) を 含 む M eO H を， l w e l l に 対 し 6 0 0 fiL 添 加 し た .. C SA. その後，4 〇 C に て 10 分 間 静 置 後 ， 4 0 0 f iL の サ ン プ. ル 溶 液 に 対 し 400 f i L の C H C 13 と2 0 0 叫 の M illi-Q を 加 え 十 分 に 攪 拌 し ， 9 ,0 0 0 x g ， 4 。 ¢： に て 15 分 間 遠 心 分 離 を 行 っ た 後 ，水 層 3 6 0 叫 を M illipore 製 限 外 ろ 過 フ イ ル タ ー に 移 し ， 再 度 9 ,0 0 0 x g ， 4 ° C にて 2 時 間 以 上 遠心分離を行った.. そ の 後 ， ろ 液を 4 0 °C で 2 4 0 分 間 遠 心 乾 固 さ せ ， 10 〇n M の 3-A m inopyrrolidine ，. Trim esate ( I S 2 ) を 含む 25 »iL の M illi-Q に よ り 可 溶 化 し ， C E -T O FM S に よ る メ 夕 ボ ロ ー ム 測 定 を 行 っ た .. 2.1.4 メタボローム解析 本 研 究 で は C E -T O FM S に よ り 計 測 さ れ た 陽 イ オ ン 性 •陰 イ オ ン 性 物 質 全 て の サ ン プ ノ レ デ 一 夕 を 用 い て メ 夕 ボ ロ ー ム 解 析 を 行 っ た . C E -T O FM S に よ り 得 ら れ た 全 デ ー タ を M asterH ands2 を 用 い て 積 分 に よ る ピ ー ク 検 出 を 行 い ， 各 物 質 の 精 密 質 量 や ，標 準 物 質 の 濃 度 を 元 に 各 代 謝 物 濃 度 の 計 算 を 行 っ た .. 2.2ビタミンC と抗酸化剤の共添加時の細胞数測定 M C F 7 お よ び H T 2 9 を2 x l 〇5 c e lls/m L で 4 8 以611ブ レ 一 ト に そ れ ぞ れ 2 5 0 ‘. にて播種した.. ビ夕ミン(：の処. 理 濃 度 は そ れ ぞ れ 細 胞 死 が 観 察 さ れ る よ う ， M C F 7 に お い て は 0 , 3 , 1 0 m M ， H T 2 9 に お い て は 0 ,1 0 , 3 0 mMで添加した.. また， ビタミン C 処 理 の 一 時 間 前 に ， R O S を 無 毒 化 す る こ と に よ り 抗 酸 化 剤 と し て 機. 能する G SH (10 m M ) ，N -acetylcystein e (N A C ; 3 ,1 0 m M ) お よ び Pyruvate ( 3 ,1 0 m M ) を 培 地 中 に 添 加 し ， さ ら に ビ タ ミ ン C 添 加 2 時 間 後 の 培 地 交 換 後 に 同 濃 度 で 再 添 加 し た . そ の 後 ， ビ タミン C 添 加 4 8 時間後にト リパンブルー試薬により染色を行い， それぞれの条件下での細胞生存率を算出した.. 2.3正常細胞およびがん細胞におけるビタミンC に対する感受性比較 T I G -1 ( ヒ ト 胎 児 肺 繊 維 芽 細 胞 ) ， HRE ( 正 常 ヒ ト 腎 上 皮 細 胞 ) ， 2 93-T ( ヒ ト 胎 児 腎 細 胞 亜 種 ）の 3 種 の 正. 常 細 胞 と M CF7, C a k i-1 ( ヒ ト 腎 明 細 癌 細 胞 ) ， C aki-2 ( ヒ ト 腎 明 細 癌 細 胞 ) ， 7 6 9 - P ( ヒ ト 腎 癌 細 胞 ) ， 7 8 6 -0 ( ヒ ト 腎 癌 細 胞 ) ， H T 29 の 6 種 の が ん 細 胞 を 用 い て ， ビタミン C に 対 す る 感 受 性 を 比 較 し た . 96 w e ll プ レートに. T IG -1 (4 x 1〇4 cdls/m L), HRE (2 x 1〇4 cells/mL)， 293-T (5 x 104 cells/mL)， HM EC (10 x l 〇4 ceus/. m L ) の 4 種 の 正 常 細 胞 と M C F7 (4 x l 〇4 cells/m L ) ， C a k i-1 (2 x l 〇4 ceiis/m L ) ， C aki-2 (3 x l 〇4 cells/m L )， 7 6 9 - P (2 x l 〇4 cells/m L ) ， 7 8 6 - 0 (1 x l 〇4 c e l 丨 s/m L ) ， H T 29 (5 x l 〇4 ce 丨 丨 s /m L ) の 6 種 の が ん 細 胞 を そ れ ぞ れ 括. 弧 内 に 明 記 し た 濃 度 に て 播 種 し た . 1 w e ll あ た り 150 mL ず つ 播 種 し ， D M E M 培 地 に て 2 4 時 間 前 培 養 を 行 っ た . 次 に ， ビタミン C 添 加 1 時 間 前 に D M E M 培 地 に て 培 地 交 換 を 行 い ， そ の 後 ， ビタミン C o l w e l l 毎 に 10 % 添 加 し 2 時 間 曝 露 し た . 添 加 す る ビ タ ミ ン C 濃 度 は 0, 0 .1 ，0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5 .0 ,1 0 m M (H M E C の み 5 .0 m M 条 件 を 除 く . ）とし， ビタミン C 添 加 4 8 時 間 後 に M TT a ssa y に よ り ， 生 細 胞 数 を 確 認 し た .. 109.

3 . 結果と考察 3.1がん細胞におけるビタミンC が引き起こす細胞内代謝変動 3.1.1がん細胞におけるビタミンC に対する感受性比較 M C F 7(感 受 性 株 }. a. 1. 4. # t Time[h]. ii. H T 29(低 感 受 性 株 }. 0. n. !. 4. 备. 務. m. ti. Time[h]. Fig.1 異なるビタミン C濃度条件における HT29および MCF7の生存率の変化. 縦 軸 は 生 細 胞 数 [%] (0 h における生存細胞数に対する各濃度での生存細胞数の割合)，横軸は培養時間 [h] を示す. まずビタミン C に対して最も感受性に違いのある細胞を選択するために，5種 の が ん 細 胞 株 (A431，. Panc-1， HeLa，HT29, MCF7)におけるビタミン C濃度と細胞生存率の関係を調べた結果， MCF7が最も ビタミン C に対して感受性を示し， HT29が 最 も 低 感 受 性 を 示 し た .よ っ て MCF7を感受性株， HT29を低 感受性株とし，様々なビタミン C濃度条件におけるこれらの細胞株の生存率の時間変化に ついてさらに 比較を行った（ Fig.1). F i g . l より， H T 2 9 とM C F 7 におけるビタミン C 濃度と細胞生存率の関係を調べた結果， H T 2 9 では， ビ夕. ミンC 濃 度 1 0 m M 条件においてのみ細胞毒性が観察され， ビタミンC 添 加 1 2 時間後に生存細胞数が半減 したのに対し， M C F7 では， ビタミンC 濃 度 I m M 条件において細胞数が半減し， さらに i 〇m M ^ 件では 12 時 間 で 細 胞 が ほ ぼ 死 滅 し た .し た が っ て ， M C F 7 では I m M 以上， H T 2 9 で は 1 0 m M のビタミン C 濃度で. それぞれ毒性が見られた.. 3 .1 .2 がん細胞内におけるビタミンC 添加による代謝変動マップ 全代謝物質デ一夕を用い， メ タ ボ ロ ー ム 解 析 を 行 っ た .ビ タ ミ ン C濃 度 OmM時に対してビタミン C を 添加した条件での細胞内代謝がどのように変動す るかを調 べ た . そ れ ぞ れ の 細 胞 に 対 い 福 及 び 1〇. mMのビタミン C を添加した1時間後の細胞内代謝マップを描画した.. 110.

I か賺 «. 0. 1i. Fig. 2. 10 m M ビ タミン C 添 加 1 時 間 後 の M C F 7 の 濃 度 依 存 的 代 謝 変 動 .. 各 物 質 毎 に ， 各 添 加 時 間 の OmM条 件 に お け る 定 量 値 に 対 す る 各 条 件 時 に お け る 定 量 値 の 比 率 を 算 出しカラ一コードに従い色付けした.. ま た エ ラ 一 バ ー は n = 3 の 標 準 偏 差 を 示 し ， “ * ’’ は， O m M 条 件 に. おける値に対する 有 意 差 が あ る こ と を 示 す （P < 0 . 0 5 ) . また代謝マップの側部には0 mM条件時の定量 値に対してそれぞれ顕著に差があった各物質を示した（ 縦 軸 : 単 位 細 胞 あ た り の 代 謝 物 濃 度 [MM]， 横 軸 : 左 か ら 順 に ビ タ ミ ン C 濃 度 0 ,0 .2 , 1 ,1 0 m M 条 件 ， 赤 枠 お よ び 青 枠 は そ れ ぞ れ M C F7 ， H T 2 9 に お け る 代 謝物である.. そ れ ぞ れ ビ タ ミ ン C 添 加 1時 間 後 の デ ー タ を 示 す . ） .. そ の 結 果 ， M C F 7 に お い て 毒 性 を 発 揮 す る 1 m M の ビ タ ミ ン C を 添 加 し た 条 件 時 で は ATP や G T P などのヌ クレオチド3 リン酸の顕著 な 低 下 と 共 に ，AM Pや GM Pな ど の ヌ ク レ オ チ ド 1 リン酸の増加が確認された ことから， エ ネ ル ギ ー 生 成 の 低 下 が 示 唆 さ れ た .. また， N A D , N A D H の 低 下 に 伴 い ， 解 糖 系 上 流 お よ. びT C A 回 路 上 流 に 位 置 す る 物 質 濃 度 が 増 加 し た こ と か ら ， N A D の 分 解 に 起 因 す る エ ネ ル ギ ー 代 謝 全 体 の 停 滞 が 示 さ れ た .さ ら に 10 m M の ビ タ ミ ン C を 添 加 し た 条 件 時 で は そ れ ら の 代 謝 物 が 激 し く 変 動 し て いることが明らかとなった（ Fig. 2 ) . — 方 H T 2 9 で 毒 性 が 見 ら れ る 1 0 m M の ビ タ ミ ン C を 添 加 し た 条 件 時 ではM C F 7と同様の変動が見られるが，毒 性 が 発 揮 さ れ な い 1 m M のビタミンC を添加した条件時では目 立った代謝変動は見られなかった（ Fig. 2). ま た ビ タ ミ ン C 添 加 1 時 間 後 で は い ず れ の 細 胞 に お い て も 細 胞 生 存 率 は お よ そ 1〇〇%で あ る に も 関 わ ら ず， す で に 活 発 な 代 謝 変 動 が 起 こ っ て い る こ と が 明 ら か と な っ た （ F ig .1，2). したがって， 両 細 胞 と も 非 毒 性 濃 度 域 （ M C F7 で は I m M 未 満 ， H T2 9 で は 1 0 m M 未 満 を 指 す . ）のビ夕ミ ンC で は 目 立 っ た 代 謝 変 化 は 見 ら れ ず ； 一 方 で 毒 性 濃 度 域 (M C F 7 で は I m M 以 上 ， H T 2 9 で は 1 0 m M 以上 を指す . ）で は 両 細 胞 で 代 謝 プ ロ フ ァ イ ル の 変 動 が 類 似 し て い た こ と か ら ， ビタミン C は が ん 細 胞 に お い て毒性を発揮する濃度域でエネルギー代謝全般に変動を及ぼし細胞死を誘導することが推察された.. 3.2 R O S に よ る 細 胞 死 次 に ， こ れ ま で の 結 果 に お い て ， G S H お よ び G S S G の比など酸イ匕ストレスに関連する代謝が変動してい たため，先行研究で示唆されている通りビタミン C の添加により生じるR O Sとそれを無毒化する細胞の. in.

抗酸化機構が選択的毒性に重要な役割を果たしている可能性が高い.. こ れ を 確 か め る べ く ， これまでメ. 夕 ボ ロ ー ム 解 析 で 比 較 を 行 っ た H T 2 9 とM C F 7 を 用 い て 抗 酸 化 物 質 を ビ タ ミ ン C と 共 添 加 す る こ と で 毒 性 濃度域において見られた細胞死が顕著に回避されるかを調査した•. mis § _ 祕 秘. 言级 綱 ■C|勤•_. 游. ^. §. 2. 4 s § Cc^rrnm^n lmm\. 10. - ド ，酬續3^M3. ◎ 一一••. l&mM\. ，へ. ^. …攀. ^. 誦. m. 零. 喔. •… MA_ _ _ '則•. 眶. is. m. B. [mm]. M. Fig. 3 異 な る ビ タ ミ ン C 濃 度 条 件 に お い て 種 々 の 抗 酸 化 物 質 を 共 添 加 し 4 8 時 間 培 養 し た M C F 7 および H T 29 の 生 存 率 .縦 軸 は 各 条 件 に お け る 全 細 胞 数 に 対 す る 生 細 胞 の 割合！ ;％]，横 軸 は ビ タ ミ ン C 濃 度 [m M ] をポす .. そ の 結 果 ， G S H ， N A C ， Pyruvate の い ず れ の 抗 酸 化 物 質 を 添 加 す る こ と に よ っ て も ， ビ タ ミ ン C の添加 に よ る 細 胞 死 が 回 避 さ れ ，毒 性 が 低 下 し た こ と が 明 ら か と な っ た （ F i g . 3 ) . し た が っ て ， R O S の発生に よ っ て ビ タ ミ ン C の 毒 性 が 発 揮 さ れ て い る こ と が 示 唆 さ れ た .細 胞 株 ご と に 感 受 性 が 異 な る 原 因 と し て， 発 生 す る R O S 量 の 違 い や ， R O S を 除 去 す る 能 力 の 違 い な ど が 考 え ら れ る が ， こ れ ら に つ い て ，今 後 ビタミン C 毒 性 に 顕 著 な 違 い が 見 ら れ た 細 胞 株 を 用 い て 明 ら か に し て い く 必 要 が あ る .. 3.3正 常 細 胞 お よ び が ん 細 胞 に お け る ビ タ ミ ン Cの 感 受 性 比 較 こ れ ま で の 結 果 か ら ， ビタミン C に 対 す る が ん 細 胞 の 感 受 性 に は 顕 著 な 差 が 見 ら れ る こ と が 明 ら か と なり， さ ら に 感 受 性 の 異 な る が ん 細 胞 株 を 用 い た メ タ ボ ロ ー ム 解 析 結 果 か ら ，毒 性 の 生 じ る 濃 度 条 件 で は細胞内代謝変動が類似することも明らかとなった. 一 方 ，正 常 細胞に対するビタミンC の毒性は低 いと言われてきたが， これを再確認する目的で， がん細胞と正常細胞を用いてビタミン C に対する感受 性比較実験を行った.. さらに， これ ま で の 研 究 に お い て ビ タ ミ ン C感 受 性 株 と し て 用 い て い た ヒ ト 乳 が. ん 細 胞 株 で あ る M C F 7 と 同 一 組 織 由 来 の 正 常 細 胞 で あ る H M EC 細 胞 に お け る ビ タ ミ ン C 添 加 時 の 細 胞 内 代 謝 応 答 を 調 べ る た め の 予 備 実 験 と し て ， そ の 他 の 細 胞 種 と 同 様 に H M EC 細 胞 の ビ タ ミ ン C に 対 す る 感 受性を調査し比較した.. マ1^%|*15. g 纖 齡. mmm mm-i mmt 〇» ?. 鉍 鄉. num | | ecsi^x I. m n m. M. 〇?獅. mw v ^ i mn^mtr^ikm\mM\. W$mntt<Mlmmi. Fig.4 異なるビタミン C濃度条件において48時 間 培 養 し た 正 常 細 胞 お よ び が ん 細 胞 の 生 存 率 (縦軸は生 細 胞 の 割 合[%] (OmM ビタミン C条件における生存細胞数に対する各濃度における生存細胞数の割合)，横 軸はビタミン C濃 度 [mM]を示す.左図))，正常細胞およびがん細胞におけるビタミン c 添 加 時 の EC5〇の. 比較 (縦軸は 細胞株 ， 横軸はビタミンC添加時の ECsoを 示 す .（ 右 図 )).ま た ，（ a)は正常細胞株，（ b)はが 112.

ん細胞株である. 一般的に， がん細胞に比べ，正常細胞に対するビタミン C の毒性は低いと報告されていたが(C h e n 以 a /.， 2008). , がん細胞だけでなく H M E C 以外全ての正常細胞において高濃度ビタミン C による毒性が見ら. れた（ F ig .4 ) . これまでの報告では， ビタミン C 添加による毒性は正常細胞において顕著に低く， その理 由としてがん細胞に比べ正常細胞では抗酸化酵素を多く含み，抗酸イ匕能が高いことが挙げられている (Chen W a /., 2 0 0 8 ) . しかしながら，本実験においては H M E C を除く全ての正常細胞において高濃度のビ. 夕ミン C 添加による毒性が確認されたため， ビタミンC の選択毒性が， これまでの認識よりも不完全で あ る こ と が 示 唆 さ れ た .ま た 興 味 深 い こ と に E C 50に着目したところ， ビタミン C に対する感受性につい ては細胞株毎に顕著な差が見られたものの，感受性に関してがん細胞株と正常細胞との間に明確な差 は 確 認 で き な か っ た .し た が っ て ，先 行 研 究 で 示 唆 さ れ た （ C h e n 以 a /.， 2008)，正常細胞全般に対するが ん細胞全般のビタミン C に対する高感受性を結論づけることは難しく， ビタミン C 感受性は，正常ある いはがん細胞に拘わらず各々の細胞株が持つ毒性除去もしくは耐性機構などに依存する可能性が高 い .将 来 的 に ， ビタミン C に対する耐性の高い正常あるいはがん細胞の毒性回避機構を解明しそれを調 節することで， ビタミン C の及ぼすがん細胞に対する毒性の選択性の向上につながると考える.. 4 . 結論 ビタミン C に対し高感受性を示した M C F 7 および低感受性を示した H T 2 9 を用い， C E -T O F M S による経 時的なメ夕ボローム解析を行った結果，細胞毒性が生じるビタミン C 濃 度 条 件 で は （ M C F 7で 1 m M 以 上 ， H T 29で 10 m M 以上)， プロファイルの変動が類似しており，加えてエネルギー生成の低下が示唆さ れ た . ま た ，N A D , N A D H の低下に伴い，解糖系上流および T C A 回路上流に位置する物質濃度が増加 したことから，N A D の 分 解 に 起 因 す る エ ネルギー 代 謝 全 体 の 停 滞 が 示 さ れ た.さ ら に ，抗酸化物質を ビタミン C と共添加することにより両細胞株における細胞死が顕著に回避され， ビタミン C による毒性 が緩和されたことから， ビタミン C による細胞毒性が主に R O S の発生によるものであることが示唆され た .こ れ ら の 結 果 は ， ビタミン C による細胞毒性がエネルギー代謝に顕著な影響を与え， さらにビタミ ンC による細胞毒性かT R O S と密接な関係をもつことを浮き彫りにした .また， これまで正常細胞に対す る高濃度ビタミン C による毒性は， がん細胞のそれに比べ顕著に低いと報告されてきたが，本研究にお いては H M E C を除く全ての正常細胞において，がん細胞に対する毒性と同程度の毒性が生じた .よっ て， ビタミン C のがん細胞選択的毒性が， これまでに考えられていたよりも不完全なものであることが 示唆された. 今 後 ， ビタミン C を投与した正常細胞におけるメタボローム比較解析を行うことで， より効果的かつ 選択的な高濃度ビタミン C 点滴療法の開発に貢献できると考えられる. 謝辞 本研究では紙健次郎氏には今までの研究はもちろん，学会発表に対しても貴重なアドバイスを頂き， さらに本研究においても多くの時間有意義な議論を行って頂きました.また北川光洋氏にはあらゆる実 験 の手法に対して丁寧で細やかなご指導して頂きました .この場を借りて深く感謝を申します .またこ のような理想的なのびのびと研究できる環境と機会を与えて下さった冨田勝氏にも心よりお礼申し上 げます.. 参考文献 • • • •. Ahmad, I. M., Aykin-Bums, N., et a l . (2005) Mitochondrial 〇2 _ and H 2 O 2 mediate glucose deprivation-induced stress in human cancer cells. J. Biol. C hem ., 280,4254-4263. Antunes F, Cadenas E (2000) Estimation o f H2 O 2 gradients across biomembranes. F E B S L e tt 475, 121-126. Carosio, R., Zuccari, G., et al.(2007) Sodium Ascorbate induces apoptosis in neuroblastoma cell lines by interfering with iron uptake. M o le cu la r cancer, 6,1-11. Chen, Q., Esnev, M. G., et al. (2005) Pharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancer cells: action as a. 113.

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