DIKTAT PRAKTIKUM KIMIA KLINIK GLORY DIAGNOSTICS PENYUSUN DGD. DHARMA SANTHI

(1)

DIKTAT PRAKTIKUM KIMIA KLINIK

GLORY® DIAGNOSTICS

PENYUSUN

DGD. DHARMA SANTHI

BAGIAN PATOLOGI KLINIK

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS UDAYANA

2017

(2)

KATA PENGANTAR

Puji syukur Penulis panjatkan ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa/ Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat dan rahmat-Nya kami dapat menyelesaikan Diktat Praktikum Kimia Klinik Glory ® Diagnostics ini tepat pada waktunya. Buku ini dimaksudkan untuk menuntuk mahasiswa S1 Farmasi dalam melakukan praktikum kimia klinik menggunakan reagen Glory ® Diagnostics.

Penulis menyampaikan terima kasih kepada rekan – rekan yang telah membimbing dan meluangkan waktunya dalam tiap kesempatan sehingga menyelesaikan Diktat Praktikum Kimia Klinik ini dapat kami selesaikan tepat pada waktunya.

Penulis menyadari menyelesaikan Diktat Praktikum Kimia Klinik ini jauh dari sempurna, sehingga kritik dan saran membangun sangat penulis harapkan dari berbagai pihak untuk kesempurnaan menyelesaikan Diktat Praktikum Kimia Klinik ini. Semoga menyelesaikan Diktat Praktikum Kimia Klinik ini dapat diterima dan bermanfaat.

Denpasar, 1 Februari 2017

Penulis

(3)

DAFTAR ISI

SPEKTROFOTOMETRI ... 1

UREA/ BUN ... 12

CREATININ ... 16

GLUCOSA MR ... 19

ASAM URAT MR ... 23

CHOLESTEROL TOTAL MR ... 27

GAMMA – GLUTAMYLTRANSFERASE (Ƴ-GT) BR... 31

TOTAL PROTEIN ………... 35

BILIRUBIN TOTAL …...………..……... 39

BILIRUBIN DIRECT ………...………... 42

PUSTAKA ... 47

(4)

SPEKTROFOTOMETRI

Pengertian Dasar Spektrofotometer Vis, UV, UV-Vis

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.

Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari.

Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun spektroskopi emisi.

Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau pengertiannya lebih sempit karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang dilihat maupun tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya cahaya maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.

Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat dualistik cahaya yaitu:

1) Sebagai gelombang

2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.

(5)

Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya panjang gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Panjang

gelombang (l) didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak.

Energi dan frekuensi suatu foton akan berbanding terbalik dengan panjang gelombang tetapi energi yang dimiliki suatu foton akan berbanding lurus dengan frekuensinya. Misalnya: energi yang dihasilkan cahaya UV lebih besar dari pada energi yang dihasilkan sinar tampak. Hal ini disebabkan UV memiliki panjang gelombang (λ) yang lebih pendek (100–400 nm) dibanding panjang gelombang yang dimiliki sinar tampak (400–800 nm).

Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi.

Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip kerja yang sama yaitu “adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang gelombang yang digunakan.

Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri dari :

“Sumber cahaya – Monokromator – Sel sampel – Detektor – Read out”

(6)

Gambar 1. Instrumen Spektrofotometri

Fungsi masing-masing bagian:

1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer

 UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen

 VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram

 UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator

 Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR

2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik.

Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya

(7)

yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.

Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya.

dengan adanya pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel

– UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm.

– IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam sel natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal

4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :

 Kepekaan yang tinggi

 Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi

 Respon konstan pada berbagai panjang gelombang

 Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi

 Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi

(8)

Macam-macam detektor :

 Detektor foto (Photo detector)

 Photocell, misalnya CdS.

 Phototube

 Hantaran foto

 Dioda foto

 Detektor panas

5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektor.

Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri

Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.

Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi).

Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio.

Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang

(9)

tertentu. Ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan.

Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah I_t/I₀ atau I₀/I_t(perbandingan cahaya datang dengan cahaya setelah melewati materi (sampel)). Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut:

Gambar 2. Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel

Dari gambar terlihat bahwa zat sebelum melewati sel sampel lebih terang atau lebih banyak di banding cahaya setelah melewati sel sampel.

Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi: “jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan”.

Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan yang digunakan memenuhi kriteria-kriteria berikut:

1. Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan panjang gelombang tunggal (monokromatis).

(10)

2. Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.

3. Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang sama.

4. Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor.

Artinya larutan yang diukur harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan cahaya oleh partikel-partikel koloid atau suspensi yang ada di dalam larutan.

5. Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan menggangu kelinearan grafik absorbansi versus konsntrasi.

Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit:

1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.

2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik 3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi

sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).

Spektrum UV dan UV-VIS

Spektrofotometri uv-vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah ultraviolet (200-400 nm) dan sinar tampak (400-800 nm) oleh suatu senyawa. Serapan cahaya uv atau cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-elektron dari orbital keadaan dasar yang

(11)

berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi.

Panjang gelombang cahaya uv atau cahaya tampak bergantung pada mudahnya promosi elektron.

Molekul- molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi elektron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek.

Molekul yang memerlukan energi lebih sedikit akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap cahaya dalam daerah tampak (senyawa berwarna) mempunyai elektron yang lebih mudah dipromosikan dari padasenyawa yang menyerap pada panjang gelombang lebih pendek (Herliani, 2008).

Absorpsi spektrofotometri UV-Vis adalah istilah yang digunakan ketika radiasi ultraviolet dan cahaya tampak diabsorpsi oleh molekul yang diukur.

Alatnya disebut UV-Vis spektrofotometer. Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari sekian banyak instrumen yang biasa digunakan dalam menganalisa suatu senyawa kimia.

Spektrofotometer UV-Vis pada umumnya digunakan untuk:

1. Menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonyugasi dan ausokrom dari suatu senyawa organik.

2. Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang maksimum suatu senyawa.

3. Mampu menganalisis senyawa organik secara kuantitatif dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.

Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan. Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi tentang

(12)

struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm.

Panjang gelombang (λ) adalah jarak antara satu lembah dan satu puncak, sedangkan frekuensi adalah kecepatan cahaya dibagi dengan panjang gelombang (λ). Bilangan gelombang adalah (v) adalah satu satuan per panjang gelombang.

Kebanyakan penerapan spektrofotometri UV-Vis pada senyawa organik didasarkan n-π* ataupun π-π* karena spektrofotometri UV-Vis memerlukan hadirnya gugus kromofor dalam molekul itu. Transisi ini terjadi dalam daerah spektrum (sekitar 200 ke 700 nm) yang nyaman untuk digunakan dalam eksperimen. Spektrofotometer UV-Vis yang komersial biasanya beroperasi dari sekitar 175 atau 200 ke 1000 nm.

Identifikasi kualitatif senyawa organik dalam daerah ini jauh lebih terbatas daripada dalam daerah inframerah. Ini karena pita serapan terlalu lebar dan kurang terinci. Tetapi, gugus-gugus fungsional tertentu seperti karbonil, nitro dan sistem tergabung, benar-benar menunjukkan puncak yang karakteristik, dan sering dapat diperoleh informasi yang berguna mengenai ada tidaknya gugus semacam itu dalam molekul tersebut.

(13)

UREA/ BUN Urease/ GIDH Metode Enzimatik UV

Kinetik

TUJUAN

1. Tujuan Instruksional Umum

Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Urea/ BUN dalam serum.

2. Tujuan Instruksional Khusus

a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Urea/ BUN dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics

b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Urea/ BUN dalam sampel serum normal dan patologis

c. Mahasiswa dapat menginterpretasikan hasil pemeriksaan

PRINSIP

Urea dalam sampel akan dihirolisis oleh enzim urease menjadi amonia dan karbon dioksida. Dengan adanya NADH dan Oxoglutarat, Amonia yang terbentuk dikonversi menjadi glutamat dengan bantuan enzim glutamat dehydrogenae (GIDH).

Reaksi Enzimatis :

Urea + H₂O 2NH₄⁺ + CO₂

2 – Oxoglutarat + NH4+ + 2NADH L – Glutamate + 2NAD⁺+ 2H2O

ALAT DAN BAHAN Alat :

- Yellow tip - Blue tip

Urease

GIDH

(14)

- Mikropipet

- Spektrofotometer - Stopwatch

- Tabung reaksi 3 ml - Beaker glass

Bahan :

- Aquadest

- Reagen R1 (Buffer Urease/ GIDH: TRIS buffer 1125 mmol/L pH 7.4; 2-oxoglutarat 10 mmol/L; urease > 140 U/mL; Glutamate dehydrogenase > 120 U/mL)

- Reagen R2 (Coenzym NADH 1.50 mmol/L)

- Kalibrasi / Standar/ CAL: standar Urea 50 mg/dL (8.3 mmol/L) - Working reagent:

Campur 4 ml R1 dengan 1 ml R2. Stabil selama 2 bulan dalam suhu penyimpanan 2 – 8⁰C

- Sampel serum

CARA KERJA

1. Siapkan alat dan bahan yang digunakan serta dikondisikan dalam suhu percobaan 37⁰C

2. Siapkan spektrofotometri dengan absorbansi 0 menggunakan aquadest

3. Siapkan working reagent: Campur 4 ml R1 dengan 1 ml R2 4. Siapkan larutan CAL/ Standar

5. Disiapkan 3 buah tabung reaksi yang telah diberi label blanko, standar, sampel

(15)

6. Dipipet masing-masing ke dalam tabung :

Blanko Standar Sampel

Working reagen 1 mL 1 mL 1 mL

Aquadest 100 µl - -

Standar - 100 µl -

Sampel - - 100 µl

7. Campuran dihomogenkan, lalu diinkubasi selama 1 menit pada suhu 25ô/30ôC atau selama 30-40 detik pada suhu 37ôC

8. Lalu absorbansi larutan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm

9. Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar urea/ BUN pada sampel KALKULASI

Kadar Urea = X C Standar mg/dL

INTERPRETASI HASIL

Bayi (< 10 hari) : 6.4 – 53.5 mg/dL (1.1 – 9.0 mmol/ L)

Dewasa (12 - 60 tahun) : 15 – 40 mg/dL (2.5 – 6.6 mmol/ L) A sampel

A standar

(16)

KREATININ

Metode Kinetik Kolorimetri

TUJUAN

Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Kreatinin dalam serum.

a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Kreatinin dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics

b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Kreatinin dalam sampel serum normal dan patologis

PRINSIP

Prosedur pemeriksaan merupakan modifikasi dari metode Jaffe (reaksi pikrat). Dalam kondisi alkali, Kreatinin bereaksi dengan ion pikrat membentuk kompleks kemerahan. Kecepatan pembentukan kompleks dalam interval waktu tertentu sebnding dengan konsentrasi kreatinin dalam sampel.

Reaksi Kinetis :

Kreatinin + Asam Pikrat Kompleks berwarna kemerahan

- Yellow tip - Blue tip - Mikropipet

pH > 12 37⁰C

(17)

Bahan :

- Aquadest

- Reagen R1: Asam Pikrit 25 mmol/L

- Reagen R2: Buffer Alkaline (Phosfate buffer 300 mmol/L, pH 12.7, SDS 2.0 g/L (w/v)

- Kalibrasi/ Standar/ CAL: Standar Kreatinin 2 mg/dL (177 µmol/L) - Working reagent:

Campur 1 ml R1 dengan 1 ml R2. Stabil selama 1 minggu dalam suhu suhu ruangan dan terhindar dari cahaya

- Sampel serum CARA KERJA

1. Siapkan alat dan bahan yang digunakan serta dikondisikan dalam suhu percobaan 37⁰C.

3. Siapkan working reagent: Campur 4 ml R1 dengan 4 ml R2 4. Siapkan larutan CAL/ Standar

Blanko Standar Sampel Working reagen 1 mL 1 mL 1 mL

Standar - 100 µl -

Sampel - - 100 µl

(18)

6. Campuran dihomogenkan, absorbansi larutan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 510 nm.

7. Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar Kreatinin pada sampel.

KALKULASI

Kadar Kreatinin = X C Standar mg/dL

Laki - laki : 0.70 – 1.20 mg/dL (62 – 106 mol/ L) Perempuan : 0.50 – 0.90 mg/dL (44 – 80 mol/ L)

A sampel A standar

(19)

GLUKOSA MR

Metode Enzimatik Kolorimetri

TUJUAN

Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Glukosa dalam serum.

a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Glukosa dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics

b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Glukosa dalam sampel serum normal dan patologis

PRINSIP

Dalam reaksi Trinder, glukosa dioksidasi menjadi D-glukonat oleh glucose oxidase (GOD) serta terbentuk hidrogen peroksida. Reaksi oksidasi antara phenol dan 4-aminoantipyrine (4-AA) yang dikatalisasi oleh Peroksidase (POD) membentuk quioneimine yang berwarna merah yang sebanding dengan konsentrasi glukosa dalam sampel.

Reaksi Enzimatis :

-D-Glucose + H2O + O2 D-Gluconate + H2O2

4-AA + Phenol Quinoneimine + HH2O2 2O POD

GOD

(20)

Bahan :

- Aquadest

- Reagen RI (Monoreagen): Buffer phosfate 100 mmol/L, pH 7.5, glucose oxidase > 10 KU/L, Peroksidase > 2 KU/L, 4- Aminooantipyrine 0.5 mmol/L, phenol 5mmol/L

- Kalibrasi/ Standar/ CAL: Standar Glucosa 100 mg/dL (5.55 mmol/L)

3. Siapkan reagen R1 dan Kalibrasi

(21)

Blanko Standar Sampel Reagen R1 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Aquadest 10 µl - -

Standar - 10 µl -

Sampel - - 10 µl

8. Campuran dihomogenkan, inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan atau 5 menit pada suhu 37⁰C

9. Absorbansi larutan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm

10. Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar Glukosa dalam sampel

KALKULASI

Kadar Glukosa = X C Standar mg/dL

Dewasa : 70 - 105 mg/dL (3.89 – 5.83 mmol/ L) Anak - anak : 60 - 110 mg/dL (3.33 – 6.11 mmol/ L) Bayi Baru Lahir : 40 - 60 mg/dL (2.22 – 3.33 mmol/ L)

A sampel A standar

(22)

ASAM URAT MR

Metode Enzimatik Kolorimetri

TUJUAN

Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Asam Urat dalam serum.

a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Asam Urat dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics

b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Asam Urat dalam sampel serum normal dan patologis

PRINSIP

Uricase mengoksidasi asam urat menjadi allantoin dan hidrogen peroksida.

Dengan adanya peroksidase (POD) dan hidrogen peroksida (H2O2), campuran dichlorophenol (DCPS) dan 4-aminoantipyrine (4-AA) dioksidasi membentuk Quinoneimine yang sebanding dengan konsentrasi asam urat di dalam sampel.

Reaksi Enzimatis :

Asam Urat + 2H2O + O2 Allantoin + H2O2

4-AA + DCPS Quinoneimine + 4HH2O2 2O POD

Uricase

(23)

Bahan :

- Aquadest

- Reagen RI (Monoreagen): Buffer phosfate 100 mmol/L, pH 7.8, uricase > 50 U/L, Peroksidase > 1 KU/L, Ascorbate Oxidase >

0.1 mmol/L, 4-Aminooantipyrine 0.32 mmol/L, DCPS 2 mmol/L, non-ionic tensioactives 2g/L (w/v)

- Kalibrasi/ Standar/ CAL: Standar Asam Urat 6 mg/dL (357 µmol/L)

(24)

Aquadest 25 µl - -

Standar - 25 µl -

Sampel - - 25 µl

8. Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar Asam Urat dalam sampel

KALKULASI

Kadar Asam Urat = X C Standar mg/dL

Laki - laki : 3.5 – 7.2 mg/dL (208 – 428 µmol/ L) Perempuan : 2.6 – 6.0 mg/dL (155 – 357 µmol/ L)

A sampel A standar

(25)

CHOLESTEROL TOTAL MR Metode Enzimatik Kolorimetri

TUJUAN

Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Choleterol Total dalam serum.

a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Choleterol Total dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics

b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Choleterol Total dalam sampel serum normal dan patologis

PRINSIP

Pengukuran Cholesterol Total dalam serum melibatkan tiga enzim, yaitu:

Cholesterol Esterase (CE), Cholesterol Oxidase (CO), dan Peroksidase (POD). Reaksi oksidasi antara phenol dan 4-aminoantipyrine (4-AA) yang dikatalisasi oleh Peroksidase (POD) membentuk quioneimine yang sebanding dengan konsentrasi cholesterol total dalam sampel.

Reaksi Enzimatis :

Cholesteryl esters Cholesterol + Fatty Acids

Cholesterol + O2 Cholestenone + H2O2

4-AA + Phenol Quinoneimine + 4HH2O2 2O POD

CE

CO

(26)

Bahan :

- Aquadest

- Reagen RI (Monoreagen): PIPES 200 mmol/L, pH 7.0, Sodium Cholate 1 mmol/L, Cholesterol Esterase > 250 U/L, Cholesterol Oxidase > 250 U/L, Peroksidase > 1 KU/L, 4-Aminooantipyrine 0.33 mmol/L, Phenol 4 mmol/L, non-ionic tensioactives 2g/L (w/v)

- Kalibrasi/ Standar/ CAL: Standar Cholesterol 200 mg/dL (5.18 mmol/L)

(27)

Aquadest 10 µl - -

Standar - 10 µl -

Sampel - - 10 µl

8. Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar Cholesterol Total dalam sampel

KALKULASI

Kadar Cholesterol Total = X C Standar mg/dL

Risk Classification TOTAL CHOLESTEROL Desirable : < 200 mg/dL (< 5.18 mmol/L)

Borderline High : 200 – 239 mg/dL (5.18 – 6.2 mmol/L)

High : > 240 mg/dL (> 6.2 mmol/L) A sampel

A standar

(28)

GAMMA – GLUTAMYLTRANSFERASE (Ƴ-GT) BR Metode Enzimatik Kolorimetri

TUJUAN

Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Ƴ-GT dalam serum.

a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Ƴ-GT dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics

b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Ƴ-GT dalam sampel serum normal dan patologis

PRINSIP

Gamma-glutamyltrasferase (Ƴ-GT) mengkatalisis perpindahan Ƴ-glutamyl dari Ƴ-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide menjadi glycylglycine dengan membentuk L- Ƴ-glutamyl- glycylglycine dan 5-amino-2-nitro-benzoate.

Jumlah 5-amino-2-nitro-benzoate yang terbentuk dimonitor secara kinetis pada panjang gelombang 405nm, sebanding dengan aktivitas enzim Ƴ-GT dalam sampel.

Formula ini merupakan metode satndar dari IFCC yang terdapat dalam Clin.Chem Lab Med 2002;40(7): 734 – 738.

Reaksi Enzimatis :

(L-Ƴ-glutamyl)-3-carboxy-4-nitroanilide

(L- Ƴ-glutamyl)- glycylglycine + 5-amino-2-nitro-benzoate Ƴ-GT

GLYCYGLYCINE

(29)

Bahan :

- Aquadest

- Reagen RI (Buffer/ Glycyglycine): TRIS 133 mmol/L, pH 8.2, glycyglycine 138 mmol/L

- Reagen R2 (Substarte/ Glupa-C): (L-Ƴ-glutamyl)-3-carboxy-4- nitroanilide 23 mmol/L

- Working reagent:

Campur 4 ml reagen R1 dengan 1 ml regen R2. Stabil selama 3 minggu dalam suhu 2 – 8⁰C atau 5 hari dalam suhu 15 – 25⁰C

2. Siapkan spektrofotometri dengan absorbansi 0 menggunakan aquadest. Absorbansi larutan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm

3. Siapkan working reagent: Campur 4 ml reagen R1 dengan 1 ml regen R2

(30)

Blanko Standar Sampel Working reagen 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Sampel - - 100 µl

6. Campuran dihomogenkan, jalankan stopwatch

7. Inkubasi selama 1 menit, kemudian baca nilai absorbansi pada spektrofotometri

8. Ulangi pembacaan absorbansi setelah 1, 2 , dan 3 menit 9. Hitung selisih absorbansi

10. Hitung rata – rata hasil untuk memperoleh ΔA/min

KALKULASI

Kadar Ƴ-GT = ΔA/min X 1111 U/L

Sampel dengan ΔA/min mencapai 0.2 pada 405 nm, sebaiknya diencerkan 1 : 10 dengan larutan normal saline. Hasil yang diperoleh dikalikan 10

SUHU 37⁰C 30⁰C 25⁰C

Laki – laki 10 – 50 U/L 7 – 35 U/L 5 – 25 U/L Perempuan 8 – 35 U/L 6 – 25 U/L 6 – 25 U/L

(31)

TOTAL PROTEIN Metode Kolorimetri

TUJUAN

Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Total Protein dalam serum.

a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Total Protein dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics

b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Total Protein dalam sampel serum normal dan patologis

PRINSIP

Dalam reaksi Biuret, kelat terbentuk antara ion Cu²⁺ dengan ikatan peptide pada protein dalam larutan alkaline, kemudian membentuk kompleks yang berwarna violet (ungu) yang dapat terukur secara fotometri. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi protein di dalam sampel.

Reaksi Enzimatis :

Cu²⁺ + Serum Protein Kompleks Protein - Tembaga

pH > 12 25 – 37⁰C

(32)

Bahan :

- Aquadest

- Reagen R1 (Reagen Biuret): Cupri Sulfat 6 mmol/L, Sodium- Potasium-Tartrat 21 mmol/L, Potasium Iodide 6 mmol/L, sodium Hydroxide 0.75 mol/L

- Kalibrasi/ Standar/ CAL: Standar Total Protein 7 g/ dL (70g/L) - Sampel serum

CARA KERJA

Aquadest 20 µl - -

Standar - 20 µl -

Sampel - - 20 µl

6. Campuran dihomogenkan, inkubasi selama 10 menit pada suhu 37⁰C 7. Absorbansi larutan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 540 nm

(33)

8. Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar Cholesterol Total dalam sampel

KALKULASI

Kadar Total Protein = X C Standar mg/dL

Sampel dengan konsentrasi lebih dari 12 g/dL seebaiknya diencerkan dengan larutan normal saline 1 : 2. Hasil yang diperoleh dikalikan 2

Dewasa : 6.6 – 8.7 g/dL (66 – 87 g/L) Premature : 3.6 – 6.0 g/dL (36 - 60 g/L) Bayi Baru Lahir : 5.3 – 8.9 g/dL (53 - 89 g/L)

Wanita Hamil : Konsentrasi lebih rendah dari 69 – 61 g/L A sampel

A standar

(34)

BILIRUBIN TOTAL Metode Kolorimetri

TUJUAN

Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Bilirubin Total dalam serum.

a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Bilirubin Total dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics

b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Bilirubin Total dalam sampel serum normal dan patologis

PRINSIP

Bilirubin diubah menjadi Azobilirubin yang berwarna oleh diazotized sulfanilic acid yang dapat terukur secara fotometri. Dari dua fraksi bilirubin dalam serum – bilirubin – glucoronide dan bilirubin bebas yang berikatan dengan albumin, hanya bilirubin – glucoronide yang beraksi secara langsung, sedangkan bilirubin yang berikatan dengan albumin akan bereaksi setelah reaksi pertukaran dari protein dengan bantuan accelerator. Perbedaan dari dua pengukuran bilirubin total (dengan accelerator) dan bilirubin direct (tanpa accelerator) memungkinkan perhitungan bilirubin indirect.

(35)

- Mikropipet

Bahan :

- Aquadest

- Reagen RT tdd: Sulfanilic Acid 29 mmol/L, hydrochloric acid 0.24 mol/L, Duposol® 3% (w/v)

- Reagen RD tdd: Sulfanilic Acid 29 mmol/L, hydrochloric acid 0.24 mol/L

- Reagen RN tdd: Sodium Nitrite 11.6 mmol/L - Kalibrasi/ Standar/ CAL: Bilirubin Calibrator - Sampel serum

CARA KERJA

3. Siapkan working reagents: Campur 1 ml reagen RN dengan 4 ml reagen RT

4. Siapkan Standar/ Kalibrasi: Rekonstitusi vial dengan menambahkan secara tepat 1.0 ml aqua destilasi. Homogenkan campuran dan biarkan selama 5 – 10 menit sebelum dipergunakan.

(36)

Tabung Reagen

Blanko Sampel

Blanko Sampel CAL

Aqua destilasi 100 µL - - -

Sampel - 100 µL 100 µL -

CAL - 100 µL

RT - 1.0 mL - -

Working reagents 1.0 mL - 1.0 mL 1.0 mL

7. Campuran dihomogenkan, inkubasi selama 2 menit pada suhu ruangan

8. Baca absorbansi sampel blanko terhadap aqua destilasi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm

9. Baca absorbansi sampel terhadap reagen blanko dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm

10. Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar Bilirubin Total dalam sampel

KALKULASI

Kadar Bilirubin Total = X C Standar mg/dL

Sampel dengan konsentrasi lebih dari 20 mg/dL sebaiknya diencerkan dengan larutan normal saline 1 : 2. Hasil yang diperoleh dikalikan 2.

Dewasa : Mencapai 1.0 mg/dL

Bayi Baru Lahir Premature Cukup Bulan

Usia sampai 24 jam : 1.0 – 6.0 mg/dL : 2.0 – 6.0 mg/dL Usia sampai 48 jam : 6.0 – 8.0 mg/dL : 6.0 – 7.0 mg/dL

A sampel – A sampel blanko A Cal

(37)

BILIRUBIN DIRECT Metode Kolorimetri

TUJUAN

Mahasiswa dapat mengetahui cara pemeriksaan kadar Bilirubin Direct dalam serum.

a. Mahasiwa dapat melakukan pemeriksaan kadar Bilirubin Direct dalam serum menggunakan reagen Glory® Diagnostics

b. Mahasiswa dapat mengetahui kadar Bilirubin Direct dalam sampel serum normal dan patologis

PRINSIP

Bilirubin diubah menjadi Azobilirubin yang berwarna oleh diazotized sulfanilic acid yang dapat terukur secara fotometri. Dari dua fraksi bilirubin dalam serum – bilirubin – glucoronide dan bilirubin bebas yang berikatan dengan albumin, hanya bilirubin – glucoronide yang beraksi secara langsung, sedangkan bilirubin yang berikatan dengan albumin akan bereaksi setelah reaksi pertukaran dari protein dengan bantuan accelerator. Perbedaan dari dua pengukuran bilirubin total (dengan accelerator) dan bilirubin direct (tanpa accelerator) memungkinkan perhitungan bilirubin indirect.

(38)

- Mikropipet

Bahan :

- Aquadest

- Reagen RT tdd: Sulfanilic Acid 29 mmol/L, hydrochloric acid 0.24 mol/L, Duposol® 3% (w/v)

- Reagen RD tdd: Sulfanilic Acid 29 mmol/L, hydrochloric acid 0.24 mol/L

- Reagen RN tdd: Sodium Nitrite 11.6 mmol/L - Kalibrasi/ Standar/ CAL: Bilirubin Calibrator - Sampel serum

CARA KERJA

3. Siapkan working reagents: Campur 1 ml reagen RN dengan 4 ml reagen RD

4. Siapkan Standar/ Kalibrasi: Rekonstitusi vial dengan menambahkan secara tepat 1.0 ml aqua destilasi. Homogenkan campuran dan biarkan selama 5 – 10 menit sebelum dipergunakan.

(39)

Tabung Reagen

Blanko Sampel

Blanko Sampel CAL

Aqua destilasi 100 µL - - -

Sampel - 100 µL 100 µL -

CAL - 100 µL

RD - 1.0 mL - -

Working reagents 1.0 mL - 1.0 mL 1.0 mL

7. Campuran dihomogenkan, inkubasi selama 5 menit pada suhu 37⁰C 8. Baca absorbansi sampel blanko terhadap aqua destilasi dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm

9. Baca absorbansi sampel terhadap reagen blanko dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm

10. Absorbansi dicatat, lalu dihitung kadar Bilirubin Direct dalam sampel

KALKULASI

Kadar Bilirubin Direct = X C Standar mg/dL

Sampel dengan konsentrasi lebih dari 20 mg/dL sebaiknya diencerkan dengan larutan normal saline 1 : 2. Hasil yang diperoleh dikalikan 2.

Dewasa : Mencapai 0.2 mg/dL

A sampel – A sampel blanko A Cal

(40)

PUSTAKA

Allain., C.C., Poon, L.S., Clau, C.S.G. Richmond, W dan Fu. 1974. Clinical Chemistry. 20 : 470

Barham, D dan Trinder, P. 1972. Analyst. 97 : 142

Dachriyanus, Dr, 2004, Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi, Andalas University Press, Padang, Hal 1-2 dan 8-9

Day, R.A, dan Underwood A.L, 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi Kelima, Penerbit Erlangga, Jakarta, Hal 390

Fossati, P., Prencipe, L dan Berti, Q. 1980. Clinicl Chemistry 26 : 22

Friedmenand Young. 2000. Effects of Disease on Clinical Laboratory Tests.

5th Ed. AACC

Gornall, A. G., Bardawill, C.S., dan david, MM. 1994. Journal of Biol.

Chem.177:751

IFCC methods for the measurements of catalytic concentration of enzymes. Part 4. IFCC method for Ƴ-glutamyltransferase. 1983. J.

Clin.Chem.Clin.Biochem. 21:643 – 646.

Khopkar, S.M, 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, Universitas Indonesia (UI-Press), Jakarta, Hal 215-216

Pearlman, F.C dan Lee, R.T.Y. 1974. Clinical Chemistry. 20/4/447 Richmond, W. Ann. 1992. Clinical Biochemistry. 29 : 577

Special Report. 2001. Executive Summary of The Third Report of The Nationa Cholesterol Education Program (NCEP) Expert panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adults Treatment Panel III). JAMA 285: 2486

Szasz, G. 1969. Clin. Chem. 15: 124

(41)

Tietz, N.W. 1987. Fundamental of Clinical Chemistry. p/940. WB. Saunders Co., Philadelphia

Walters, M.I dan Gerarde, H.W. 1970. Microchemichal Journal. 15. 231

Whitfield, J.B., Moss, D.W., Neale, G., Orme, M., dan Breckenridge, A.

Brit.Meed.J.1: 136

Young DS. 2000. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. 5th ed AACC Press