ACTIVITY TEST OF CLOVE OIL (Oleum caryophylli) AGAINST LIPID PEROXIDATION IN RATS (Rattus
norvegicus) BLOOD INDUCED BY ISONIAZID- RIFAMPICIN
ANDI DIAN ASLIN AGUSTIAH N111 14 302
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
ACTIVITY TEST OF CLOVE OIL (Oleum caryophylli) AGAINST LIPID PEROXIDATION IN RATS (Rattus norvegicus) BLOOD INDUCED BY
ISONIAZID-RIFAMPICIN
SKRIPSI
untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana
ANDI DIAN ASLIN AGUSTIAH N111 14 302
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
Andi Dian Aslin Agustiah N111 14 302
Disetujui oleh:
Pada tanggal : 9 Mei 2018 Pembimbing utama,
Yulia Y. Djabir, S.Si., MBM.Sc., M.Si., Ph.D., Apt.
NIP. 19780728 200212 2 003
Pembimbing pertama,
Dr. Mufidah, S.Si., M.Si., Apt.
NIP. 19730309 200112 1 002
Pembimbing kedua,
Sumarheni, S.Si., M.Sc., Apt.
NIP. 19811007 200812 2 001
ACTIVITY TEST OF CLOVE OIL (Oleum caryophylli) AGAINST LIPID PEROXIDATION IN RATS (Rattus norvegicus) BLOOD INDUCED BY
ISONIAZID-RIFAMPICIN Disusun dan diajukan oleh :
ANDI DIAN ASLIN AGUSTIAH N111 14 302
telah Dipertahankan di depan Panitia Ujian Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Pada Tanggal: 09 Mei 2018 Dan dinyatakan telah memenuhi syarat Panitia Penguji Skripsi
1. Ketua : Subehan, S.Si., M. Pharm.Sc., Ph.D., Apt. ………..
2. Sekretaris : Rina Agustina, S.Si., M.Pharm.Sc., Apt. ………..
3. Ex. Officio : Yulia Yusrini Djabir, S.Si., MBM.Sc., Ph.D., Apt ………..
4. Ex. Officio : Dr. Mufidah, S.Si., M.Si., Apt. ..………
5. Ex. Officio : Sumarheni, S.Si., M.Sc., Apt. ………..
6. Anggota : Drs. Hasyim Bariun, M.Si., Apt. ………..
Mengetahui:
Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt.
NIP. 19641231 199002 1 005
PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini adalah karya saya sendiri, tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila di kemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya ini tidak benar, maka skripsi dan gelar yang diperoleh, batal demi hukum.
Makassar, 9 Mei 2018
Yang menyatakan,
Andi Dian Aslin Agustiah N111 14 302
vi
UCAPAN TERIMAKASIH
Bismillahirrahmanirrahim. Alhamdulillahi robbil alamin segala puji bagi Allah SWT atas segala berkah, rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini sebagai salah satu persyaratan untuk menyelesaikan studi dan mendapatkan gelar di program S1 pada program studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin. Salawat serta salam tak henti-hentinya kita panjatkan kepada junjungan kita Rasulullah Muhammad SAW. Beserta para pengikut beliau.
Penulis juga menyadari bahwa selama penyusunan skripsi ini, banyak kendala dan masalah yang dihadapi, namun dengan adanya doa dan dukungan dari berbagai pihak maka skripsi ini dapat terselesaikan. Oleh karena itu perkenankan saya menyampaikan ucapan terima kasih saya yang tulus kepada :
1. Ibu Yulia Yusrini Djabir, S.Si., MBM.Sc., M.Si., Ph.D., Apt., selaku pembimbing utama, ibu Dr. Mufidah, S.Si., M.Si., Apt. selaku pembimbing pertaman dan Ibu Sumarheni, S.Si., M.Sc., Apt. selaku pembimbing kedua yang dengan ikhlas telah meluangkan banyak waktu, petunjuk, perhatian dan kesabaran dalam membimbing dan mengarahkan memberikan bimbingan kepada penulis baik berupa petunjuk maupun saran selama menyelesaikan skripsi ini.
2. Bapak Subehan, S.Si., M.Pharm.Sc., Ph.D., Apt., ibu Rina Agustina, S.Si., M.Pharm.Sc., Apt., dan Bapak Drs. Hasyim Bariun, M.Si., Apt. selaku tim
vii
penguji ujian skripsi yang telah meluangkan waktunya dan memberi kritik, saran serta masukan-masukan yang sangat membantu dalam penyusunan skripsi ini.
3. Kepada kedua orang tua penulis, Bapak Andi Asrul, S.S., dan Ibu Nurlina, S.ST., M.Kes., yang senantiasa terus mendoakan, membantu dan memberi saran, dukungan moral maupun batin selama penelitian berlangsung hingga penyusunan dan penulisan skripsi ini selesai. Kepada saudara-saudara penulis yang tersayang Andi Tenri Gading Nurul Azizah dan Andi Tenri Batari Ramadhani serta seluruh keluarga besar penulis besar yang selalu memberikan semangat, dan dukungan agar penulis bisa menyelesaikan pendidikan ini.
4. Dekan, Wakil Dekan, serta staf dosen dan pegawai Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas bantuan serta motivasi-motivasi yang diberikan.
5. Dosen pembimbing akademik, bapak Prof. Dr. M. Natsir Djide, MS, Apt., yang telah meluangkan waktunya dalam membimbing dan memberikan nasehat akademik yang membangun kepada penulis selama proses perkuliahan berlangsung.
6. Seluruh laboran laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin.
Khususnya Bu Adri dan Kak Cia, atas segala bantuan fasilitas selama penulis mengerjakan penelitian.
7. Teman-teman dan kakak-kakak yang membantu menyukseskan penelitian penulis, Kak Jaryn Samma, Putri Mandasari Yusuf, Mini Ariska Febrianty,
viii
Khaldun Hidayat, Anwar Sam dan kak Haslinda, yang telah sabar membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian maupun skripsi, terimakasih teman-teman.
8. Sahabat-sahabat yang selalu menyemangati penulis, Putri Mandasari Yusuf, Mini Ariska Febrianty dan Rezki Nabila Pratiwi terima kasih karena selama ini telah membantu penulis dalam mengerjakan penelitian ini, juga telah menjadi tempat menyampaikan keluh kesah penulis selama masa kuliah dan selama penelitian berlangsung.
9. Teman-temanku tersayang HIOS14MIN yang selalu menjadi semangat tersendiri bagi penulis serta seluruh Keluarga Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin dan seluruh pihak yang telah membantu, yang tak bisa disebutkan satu persatu yang selalu memberikan bantuan dan motivasi kepada penulis.
Permohonan maaf penulis sampaikan kepada seluruh pihak yang mungkin pernah merasa dirugikan oleh penulis, baik disengaja maupun tidak disengaja. Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan yang telah diberikan dan semoga karya kecil ini dapat bermanfaat bagi pembangunan dan pengembangan ilmu pengetahuan. Aamiin.
Makassar, 9 Mei 2018
Andi Dian Aslin Agustiah
ix
ABSTRAK
ANDI DIAN ASLIN AGUSTIAH. Uji Aktivitas Minyak Cengkeh (Oleum caryophylli) terhadap Peroksidasi Lipid Darah Tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi Isoniazid-Rifampisin. (dibimbing oleh Yulia Yusrini Djabir, Mufidah dan Sumarheni).
Isoniazid-rifampisin merupakan salah satu terapi tuberkulosis yang dapat menyebabkan terjadinya stres oksidatif termasuk peroksidasi lipid yang dapat merusak membran sel. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas minyak cengkeh (Oleum caryophylli) terhadap peroksidasi lipid darah tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi obat isoniazid-rifampisin melalui pengukuran kadar malondialdehid (MDA). Penelitian dilakukan menggunakan 15 ekor tikus jantan putih yang dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol negatif diberikan minyak pembawa, kelompok yang diberi minyak cengkeh 10 mg/kgBB tikus, minyak cengkeh 50 mg/kgBB tikus, minyak cengkeh 100 mg/kgBB tikus dan kelompok kontrol postitif diberi vitamin E. Tiap kelompok perlakuan diinduksi obat isoniazid- rifampisin secara per oral. Pengukuran kadar MDA dilakukan pada hari ke-0 dan ke-28, yang diukur menggunakan Spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 532 nm. Hasil penelitian setelah 28 hari perlakuan menunjukkan pada kelompok kontrol negatif, 2 dari 3 tikus mengalami peningkatan kadar MDA. Kelompok minyak cengkeh 10 mg/kgBB dan 100 mg/kgBB tikus, semua tikus mengalami peningkatan kadar MDA. Pada kelompok minyak cengkeh 50 mg/kgBB tikus dan kelompok kontrol positif vitamin E, 2 dari 3 tikus mengalami penurunan kadar MDA. Oleh karena itu minyak cengkeh dengan dosis 50 mg/kgBB tikus dan vitamin E dianggap mampu menurunkan aktivitas peroksidasi lipid pada tikus yang diinduksi isoniazid-rifampisin. Efek penurunan kadar MDA minyak cengkeh 50 mg/kgBB tikus setara dengan vitamin E sebagai antioksidan.
Kata kunci : Isoniazid-rifampisin, malondialdehid (MDA), lipid peroksidase, minyak cengkeh
x
ABSTRACT
ANDI DIAN ASLIN AGUSTIAH. Activity Test of Clove Oil (Oleum caryophylli) againts Lipid Peroxidation in Rats (Rattus norvegicus) Blood Induced by Isonazid-Rifampisin Isoniazid-Rifampisin. (supervised by Yulia Yusrini Djabir, Mufidah dan Sumarheni).
Isoniazid-rifampicin is one of tuberculosis therapy that can cause oxidative stress including lipid peroxidation that can damage cell membranes.
The aim of this research is to evaluate the activity of clove oil (Oleum caryophylli) againts rat blood lipid peroxidation (Rattus norvegicus) induced by isoniazid-rifampicin through measurement of malondialdehyde (MDA).
The study was conducted using 15 white male rats divided into 5 groups of treatment i.e. negative control that only given vehicle, clove-oil 10 mg/kgBB rats, clove oil 50 mg/kg body weight, clove oil 100 mg/kg body weight and postitive control group given vitamin E. Each of the treatment group was given isoniazid-rifampicin orally. Measurements of MDA levels were performed on days 0 and 28, using UV-Vis Spectrophotometry at 532 nm wavelength. Results of 28 days treatment showed that in the negative control group, 2 of 3 rats had elevated MDA levels. In clove oil dose 10 mg/kg body weight and 100 mg/kg body weight groups, all rats had elevated MDA levels.
In clove oil 50 mg/kg body weight and vitamin E, 2 of 3 rats had decreased MDA levels. Hence, clove oil 50 mg/kg body weight and vitamin E is assumed effective to decrease lipid peroxidation activity in rats induced by isoniazid-rifampicin. Decreased MDA levels by clove oil 50 mg/kg body weight equivalent with vitamin E with dose 250 mg/kg body weight as an antioxidant.
Keywords: Isoniazid-rifampicin, malondialdehyde (MDA), lipid peroxidase, clove oil
xi
DAFTAR ISI
halaman
UCAPAN TERIMA KASIH vi
ABSTRAK ix
ABSTRACT x
DAFTAR ISI xi
DAFTAR TABEL xiv
DAFTAR GAMBAR xvi
DAFTAR LAMPIRAN xvii
BAB I PENDAHULUAN 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4
II.1Pengobatan Tuberkulosis 4
II.2 Isoniazid 5
II.2.1 Mekanisme Kerja 6
II.2.2 Farmakokinetik 6
II.2.3 Penggunaan Klinik 7
II.2.4 Efek Samping 7
II.2.5 Isoniazid dan Pembentukan Radikal Bebas 8
II.3 Rifampisin 8
II.3.1 Mekanisme Kerja 9
xii
Halaman
II.3.2 Farmakokinetik 9
II.3.3 Penggunaan Klinik 10
II.3.4 Efek Samping 11
II.3.5 Rifampisin dan Pembentukan Radikal Bebas 11 II.4 Hubungan Hepatotoksisitas dengan Kombinasi 12
Isoniazid-Rifampisin
II.5 Peroksidasi Lipid 12
II.6 Malondialdehid 13
II.7 Tanaman Cengkeh 14
II.7.1 Klasifikasi Tanaman Cengkeh 14
II.7.2 Minyak Cengkeh 15
II.7.3 Cara Memperoleh Minyak Cengkeh 16
II.7.4. Manfaat Minyak Cengkeh 17
BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN 18
III.1 Alat dan Bahan 18
III.2 Metode Kerja 18
III.2.1 Penyiapan Hewan Coba 18
III.2.2 Pembuatan Suspensi Isoniazid-Rifampisin 19
III.2.3 Penyiapan Minyak Cengkeh 19
III.2.4 Pemberian Induksi Obat Isoniazid-Rifampisin 20
III.2.5 Penyiapan Vitamin E 20
III.3 Prosedur Percobaan 21
xiii
halaman
III.3.1 Pengambilan Darah Tikus 22
III.3.2 Pengukuran Kurva Baku 22
III.3.3 Pengukuran Kadar MDA 23
III.3.4 Analisis Statistik 23
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 24
BAB V PENUTUP 30
V.1 Kesimpulan 30
V.2 Saran 30
DAFTAR PUSTAKA 31
LAMPIRAN 34
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel halaman
1. Kandungan senyawa kimia minyak cengkeh yang berasal 16 dari Indonesia
2. Kadar malondialdehid serum tikus putih yang diinduksi 25 isoniazid-rifampisin dengan perlakuan tertentu
3. Hasil statistik perbandingan tiap kelompok perlakuan 29 menggunakan metode Mann Whitney U Test
4. Hasil pengujian statistik kadar MDA serum tikus 53 menggunakan metode Kruskal Wallis
5. Hasil pengujuan statistik kadar MDA serum tikus antar 54 kelompok pada hari ke-0 menggunakan metode analisis
One Way ANOVA
6. Hasil pengujian statistik kadar MDA serum tikus antar 56 kelompok pada hari ke-28 menggunakan metode analisis
One Way ANOVA
7. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 58 serum tikus antara kelompok perlakuan kontrol negatif
(minyak pembawa) dengan kelompok perlakuan minyak cengkeh 0,2% menggunakan metode Mann-Whitney Test
8. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 59 serum tikus antara kelompok perlakuan kontrol
negatif dengan kelompok perlakuan minyak
cengkeh 1% menggunakan metode Mann-Whitney
9. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 60 serum tikus antara kelompok perlakuan kontrol
negatif dengan kelompok perlakuan minyak
cengkeh 2% menggunakan metode Mann-Whitney
10. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 61 serum tikus antara kelompok perlakuan kontrol
negatif dengan kelompok perlakuan kontrol positif menggunakan metode Mann-Whitney
xv
halaman
11. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 62 serum tikus antara kelompok perlakuan minyak
cengkeh 0,2% dengan kelompok perlakuan minyak cengkeh 1% menggunakan metode Mann-Whitney
12. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 63 serum tikus antara kelompok perlakuan minyak
cengkeh 0,2% dengan kelompok perlakuan minyak cengkeh 2% menggunakan metode Mann-Whitney
13. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 64 serum tikus antara kelompok perlakuan minyak
cengkeh 0,2% dengan kelompok perlakuan kontrol positif menggunakan metode Mann-Whitney
14. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 65 serum tikus antara kelompok perlakuan minyak
cengkeh 1% dengan kelompok perlakuan minyak cengkeh 2% menggunakan metode Mann-Whitney
15. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 66 serum tikus antara kelompok perlakuan minyak
cengkeh 1% dengan kelompok perlakuan kontrol positif menggunakan metode Mann-Whitney
16. Hasil pengujian statistik perbandingan kadar MDA 67 serum tikus antara kelompok perlakuan minyak
cengkeh 2% dengan kelompok perlakuan kontrol positif (vitamin E) menggunakan metode
Mann-Whitney Test
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar halaman
1. Rumus struktur isoniazid 5
2. Rumus struktur rifampisin 9
3. Rumus struktur malondialdehid 14
4. Diagram kadar malondialdehid serum tikus putih 26 pada hari ke-0 dan hari ke-28
5. spektrum panjang gelombang larutan baku 46 6. Spektrum absorbansi kurva baku untuk pengukuran 47 hari ke-0
7. Spektrum absorbansi kurva baku untuk pengukuran 48 hari ke-28
8. Spektrum absorbansi kelompok perlakuan hari ke-0 49 9. Spektrum absorbansi kelompok perlakuan hari ke-28 50 10. Grafik kurva baku untuk pengukuran hari ke-0 51 11. Grafik kurva baku untuk pengukuran hari ke-28 52
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran halaman
1. Skema kerja 35
2. Penyiapan larutan baku 36
3. Perhitungan dosis dan kadar malondialdehid 37
4. Komposisi reagen 46
5. spektrum panjang gelombang larutan baku 47 6. Spektrum absorbansi kurva baku untuk pengukuran 48 hari ke-0
7. Spektrum absorbansi kurva baku untuk pengukuran 49 hari ke-28
8. Spektrum absorbansi kelompok perlakuan hari ke-0 50 9. Spektrum absorbansi kelompok perlakuan hari ke-28 51
10. Grafik kurva baku 52
11. Hasil pengukuran statistik kadar MDA serum tikus 53 menggunakan metode Kruskal Wallis
12. Hasil pengukuran statistik kadar MDA serum tikus pada 54 hari ke-0 menggunakan metode One Way ANOVA
13. Hasil pengukuran statistik kadar MDA serum tikus pada 56 hari ke-28 menggunakan metode One Way ANOVA
14. Hasil pengukuran statistik kadar MDA serum tikus 58 menggunakan metode Mann Whitney Test
15. Gambar Penelitian 68
BAB I PENDAHULUAN I.1. Latar Belakang
Kombinasi isoniazid-rifampisin merupakan salah satu pilihan terapi tuberkulosis yang saat ini banyak digunakan. Kombinasi isoniazid- rifampisin sebagai terapi tuberkulosis digunakan dalam jangka waktu yang lama, sehingga salah satu efek samping yang ditimbulkan akibat penggunaan jangka panjang adalah gangguan fungsi hati hingga nekrosis jaringan hati. Penggunaan kombinasi isoniazid-rifampisin memberikan resiko efek hepatotoksik yang lebih besar dibanding penggunaan isoniazid secara tunggal (Adhvaryu dkk. 2008). Hal ini disebabkan karena rifampisin dapat meningkatkan produksi metabolit toksik yang dihasilkan dari metabolisme isoniazid di hati yaitu acetylhidrazine dan hydrazin.
Berdasarkan studi in vitro, acetylhidrazine dapat berikatan secara kovalen dengan sel makromolekul di hati sehingga menyebabkan terjadinya kerusakan hati (Kalra dkk. 2007 dan Totsmann dkk. 2007).
Isoniazid-rifampisin dapat menginduksi kerusakan hati melalui peningkatan stress oksidatif, peroksidasi lipid, aktivasi enzim tertentu dan menurunkan kadar glutation. Isoniazid-rifampisin dimetabolisme di hati menjadi metabolit aktif. Metabolit aktif obat dapat menjadi radikal bebas yang merusak sel hati terutama ketika antioksidan endogen lebih rendah dibanding metabolit aktif obat (Totsmann dkk. 2007). Radikal bebas akan bereaksi dengan asam lemak tidak jenuh pada membran sel dan
1
membentuk lipid peroksida dengan produk akhir berupa malondialdehid (MDA). Malondialdehid dapat dideteksi dalam jaringan, darah maupun urin. Kadar MDA dalam darah dapat menjadi penanda terjadinya kerusakan sel akibat radikal bebas (Aliahmad dkk. 2012).
Proses oksidasi lipid dapat ditunda ataupun dihambat dengan adanya antioksidan. Antioksidan bekerja dengan menghambat tahapan inisiasi atau propagasi dari reaksi rantai oksidasi, sehingga proses oksidasi tidak terjadi (Gulcin dkk. 2010). Telah banyak hasil penelitian sebelumnya mengenai bahan alam dari tanaman berpotensi sebagai antioksidan dan bersifat hepatoprotektif, salah satunya adalah Cengkeh (Syzygium aromaticum) (El-Hadary, 2015). Cengkeh memiliki kandungan minyak atsiri dan telah diteliti memiliki aktivitas biologi seperti antibakteri, antijamur, insektisida, dan antioksidan (Lee dkk. 2001).
Berdasarkan hasil penelitian Sohilait dkk. (2015) menyatakan bahwa eugenol dan eugenil asetat yang terkandung dalam minyak cengkeh memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi sehingga dapat dimanfaatkan sebagai hepatoprotektif serta aktivitas penghambatan lipid peroksidase eugenol 5 kali lebih besar dibandingkan α-tokoferol (Nagababu dkk. 2010).
Bagaskaran dkk. (2010) melaporkan bahwa eugenol dapat mencegah terjadinya kerusakan hati pada tikus dengan menurunkan aktivitas enzim CYP2E1 di hati. Minyak cengkeh dapat menunjukkan adanya aktivitas antioksidan pada tikus dengan dosis oral yaitu 5-200 mg/kgBB tikus (Al-
3
Okbi dkk. 2014) dengan LD50 oral sebesar 5950 mg/kgBB pada tikus (El- Hadary dkk. 2015).
I.2. Rumusan Masalah
Apakah pemberian minyak cengkeh (Oleum caryophylli) dapat mencegah proses peroksidasi lipid darah tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi dengan obat TB isoniazid-rifampisin?
I.3. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas minyak cengkeh (Oleum caryophylli) dalam menghambat proses peroksidasi lipid darah tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi dengan obat TB Isoniazid- Rifampisin yang diukur berdasarkan produk akhir peroksidasi lipid yaitu MDA.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA II.1. Pengobatan Tuberkulosis
Tuberkulosis adalah infeksi penyakit menular yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, suatu basil aerobik tahan asam yang ditularkan melalui udara. Sejak tahun 2000, tuberkulosis telah dinyatakan oleh WHO sebagai remerging disease, karena angka kejadian TB yang telah dinyatakan menurun pada tahun 1990-an kembali meningkat.
Meskipun demikian, untuk kasus di Indonesia, angka kejadian TB tidak pernah menurun bahkan cenderung meningkat (Asih dkk. 2003 dan Muttaqin, 2008). Tuberkulosis menduduki peringkat 3 dari daftar 10 penyebab kematian di Indonesia, yang menyebabkan 146,000 kematian setiap tahunnya. Angka kematian karena infeksi TB berjumlah sekitar 300 orang per hari dan terjadi >100.000 kematian per tahun (Burhan, 2010).
Pengobatan tuberkulosis terbagi menjadi 2 fase yaitu fase intensif (2- 3 bulan) dan fase lanjutan 4 atau 7 bulan. Paduan obat yang digunakan terdiri dari paduan obat utama dan tambahan. Pemberian obat ada yang diberikan secara tunggal, obat dikombinasi tetapi di sajikan secara terpisah dan obat kombinasi dosis tetap atau disebut FDC (Fixed Dose Combination), kombinasi dosis tetap ini terdiri dari 3 atau 4 obat dalam satu tablet. Terapi lini pertama yaitu obat utama yang diberikan pada penderita tuberkulosis terdiri dari rifampisin, isoniazid, pirazinamid, streptomisin dan etambutanol. Obat-obat yang termasuk dalam lini
4
pertama dapat diberikan secara tunggal, kombinasi dan kombinasi dosis tetap. Kombinasi dosis tetap terdiri dari 3 atau 4 obat dalam satu tablet, untuk kombinasi dosis tetap dengan menggunakan 4 obat antituberkulosis dalam satu tablet, yaitu rifampisin 150 mg, isoniazid 75 mg, pirazinamid 400 mg dan etambutol 275 mg dan untuk tiga obat antituberkulosis dalam satu tablet, terdiri dari rifampisin 150 mg, isoniazid 75 mg dan pirazinamid 400 mg. Rekomendasi WHO pada tahun 1999 untuk kombinasi dosis tetap, penderita hanya minum obat 3-4 tablet sehari selama fase intensif, sedangkan fase lanjutan dapat menggunakan kombinasi dosis 2 obat antituberkulosis seperti yang selama ini telah digunakan sesuai dengan pedoman pengobatan. Terapi lini kedua atau obat tambahan terdiri dari kanamisin, amikasin, kuinolon (Kemenkes RI, 2011).
II.2. Isoniazid
lsoniazid atau isonikotinil hidrazid yang sering disingkat dengan lNH merupakan obat yang paling efektif digunakan dalam terapi tuberkulosis, isoniazid secara in vitro bersifat tuberkulostatik dan tuberkulosid dengan KHM (konsentrasi hambatan minimum) sekitar 0,025-0,05 µg/ml. Isoniazid mudah larut dalam air dan memiliki struktur yang mirip dengan piridoksin (Ganiswara, 2000).
Gambar 1. Rumus struktur isoniazid
II.2.1. Mekanisme Kerja
Isoniazid adalah “prodrug“ yang masuk ke dalam bakteri dengan cara pasif. Prodrug selanjutnya akan diubah oleh enzim katalase G pada bakteri menjadi bentuk aktif. Aktivasi menghasilkan berbagai oksigen dan senyawa reaktif yang menyerang target di dalam sel bakteri, yaitu sintesis asam mikolat, metabolisme NAD dan mungkin juga merusak DNA.
Akibatnya sel bakteri akan mudah mengalami lisis (Sjahrurachman, 2010) II.2.2. Farmakokinetik
lsoniazid mudah diabsorpsi pada pemberian oral maupun parenteral. Kadar puncak dicapai dalam waktu 1-2 jam setelah pemberian oral. Isoniazid mengalami proses asetilasi oleh enzim N-acetyltransferase di hati. Waktu paruh pada umumnya berkisar antara 1 sampai 3 jam.
Waktu paruh rata-rata pada asetilator cepat hampir 80 menit, sedangkan untuk penderita asetilatior lambat yaitu sekitar 3 jam. lsoniazid mudah berdifusi ke dalam sel dan semua cairan tubuh. Kadar dalam cairan serebrospinal kira-kira 20% dari kadar dalam cairan plasma. Antara 75- 95% isoniazid diekskresi melalui urin dalam waktu 24 jam dalam bentuk metabolit. Ekskresi terutama dalam bentuk asetil isoniazid yang merupakan metabolit proses asetilasi, dan asam nikotinat yang merupakan metabolit proses hidrolisis. Sejumlah kecil diekskresi dalam bentuk isonikotinil glisin dan isonikotinil hidrazon, dan dalam jumlah yang kecil berupa N-metil isoniazid (Ganiswara, 2000).
II.2.3. Penggunaan Klinik
Isoniazid masih tetap merupakan obat yang sangat penting untuk mengobati semua tipe tuberkulosis. Efek nonterapi dapat dicegah dengan pemberian piridoksin dan pengawasan yang cermat pada penderita. Untuk tujuan terapi, obat ini harus digunakan bersama obat lain, untuk tujuan pencegahan dapat diberikan tunggal (Ganiswara, 2000).
II.2.4. Efek Samping
Reaksi hipersensitivitas mengakibatkan demam, berbagai kelainan kulit, reaksi hematologik dapat juga terjadi seperti agranulositosis, trombositopenia, dan anemia. Gejala artritis seperti sakit sendi juga dapat terjadi. Kelainan mental dapat juga terjadi selama menggunakan obat ini.
lsoniazid dapat menimbulkan ikterus dan kerusakan hati yang fatal.
Penggunaan pada pasien yang menunjukkan adanya kelainan fungsi hati akan menyebabkan bertambah parahnya kerusakan hati. Umur merupakan faktor yang sangat penting untuk memperhitungkan risiko efek toksik isoniazid pada hati. Kelainan yang paling banyak ditemui ialah meningkatnya aktivitas enzim transaminase. Peningkatan aktivitas enzim transaminase di hati sampai 4 dari nilai normal dapat terjadi pada 10%
sampai 20% pasien, tetapi umumnya asimptomatik. Efek samping lain yang terjadi ialah mulut terasa kering, rasa tertekan pada ulu hati, methemoglobinemia, tinitus, dan retensi urin (Ganiswara, 2000).
II.2.5. Isoniazid dan Pembentukan Radikal Bebas
Hepatotoksisitas merupakan salah satu efek samping yang paling parah akibat penggunaan isoniazid. Beberapa penelitian menyatakan bahwa aktivitas isoniazid dalam menghambat bakteri dipengaruhi oleh radikal bebas dan senyawa hidrazin yang merupakan hasil metabolisme isoniazid dapat menghasilkan radikal bebas yaitu ROS (Reactive Oxygen Species). Diperkirakan bahwa selama proses metabolisme isoniazid membentuk metabolit hidrazin, monoasetilhidrazin, acetilisoniazid dan diasetilhidrazin akan menyebabkan terbentuknya radikal organik dan ROS yang berkontribusi untuk menyebabkan toksisitas (Smith dkk. 1998). Hasil penelitian menunjukkan bahwa radikal bebas dari isoniazid dihasilkan selama proses oksidasi oleh enzim horseradish peroxidase (HRP).
Berdasarkan hasil analisis spektroskpi EPR (Electron Paramagnetic Resonance) menunjukkan terdapat senyawa radikal antara lain H, OH, RC-O dan R (R mewakili cincin piridin dari isoniazid). Hasil ini dapat menjadi dasar adanya keterkaitan antara aktivitas antimikroba isoniazid dengan kemampuannya untuk membentuk senyawa radikal bebas (Wengenack dan Rusnak, 2001).
II.3. Rifampisin
Rifampisin adalah derivat semisintetik rifamimsin B yaitu salah satu anggota kelompok antibiotik makrosiklik yang disebut rifamisin. Kelompok zat ini dihasilkan oleh Streptomyces mediterranei. Obat ini merupakan ion zwitter, larut dalam pelarut organik dan air yang pHnya asam. Rifampisin
menghambat pertumbuhan berbagai bakteri gram positif dan gram-negatif.
Rifampisin merupakan obat yang aktif terhadap Mycobacterium tuberculosis yang tumbuh dan juga aktif terhadap Mycobacterium tuberculosis dalam fase stasioner. (Sjahrurachman A., 2010)
II.3.1. Mekanisme Kerja
Rifampisin bekerja dengan menghambat DNA-dependent RNA polymerase dari mycobacterium dan mikroorganisme dengan menekan proses pembentukan rantai dalam sintesis RNA. lnti RNA Polymerase dari berbagai sel eukariotik tidak mengikat rifampisin dan sintesis RNAnya tidak dipengaruhi. Rifampisin dapat menghambat sintesis RNA mitokondria mamalia tetapi diperlukan kadar yang lebih tinggi daripada kadar untuk penghambatan pada bakteri (Ganiswara, 2000).
II.3.2. Farmakokinetik
Pemberian rifampisin per oral menghasilkan kadar puncak plasma setelah 2-4 jam dosis tunggal sebesar 600 mg, menghasilkan kadar sekitar 7 µg/ml. Setelah diserap melalui saluran cerna, obat ini cepat
Gambar 2. Rumus struktur rifampisin
diekskresi melalui empedu dan kemudian mengalami sirkulasi enterohepatik. Penyerapannya dihambat oleh adanya makanan. Obat ini cepat mengalami deasetilasi, sehingga dalam waktu 6 jam hampir semua obat yang berada dalam empedu berbentuk deasetil rifampisin. Rifampisin menyebabkan induksi metabolisme, sehingga walaupun bioavailabilitasnya tinggi, eliminasinya meningkat pada pemberian berulang. Masa paruh eliminasi rifampisin bervariasi antara 1,5 sampai 5 jam dan akan memanjang bila terdapat kelainan fungsi hati. Pada pemberian berulang masa paruh ini memendek sampai kira-kira 40%
dalam waktu 14 hari. Pada penderita asetilator lambat masa paruh memendek bila rifampisin diberikan bersama isoniazid. Sekitar 75%
rifampisin terikat pada protein plasma. Obat ini berdifusi baik ke berbagai jaringan termasuk ke cairan otak. Luasnya distribusi ini dapat diidentifikasi dari warna merah pada urin, tinja, sputum, airmata dan keringat penderita.
Ekskresi melalui urin mencapai 30%, setengahnya merupakan rifampisin utuh sehingga penderita gangguan fungsi ginjal tidak memerlukan penyesuaian dosis (Ganiswara, 2000).
II.3.3. Penggunaan Klinik
Rifampisin merupakan obat yang sangat efektit untuk pengobatan tuberkulosis dan sering digunakan bersama isoniazid untuk terapi tuberkulosis jangka pendek. Efek sampingnya beraneka ragam, tetapi insidennya rendah dan jarang sampai perlu menghentikan terapi (Ganiswara, 2000).
II.3.4. Efek Samping
Dengan dosis biasa kurang dari 4% penderita tuberkulosis mengalami efek toksik. Yang paling sering ialah ruam kulit, demam, mual dan muntah. Pada pemberian berselang dengan dosis lebih besar sering terjadi flu like syndrome, nefritis interstisial, nekrosis tubular akut, dan trombositopenia. Hepatitis jarang terjadi pada penderita dengan fungsi hati normal. Pada penderita penyakit hati kronik, alkoholisme, dan usia lanjut insiden ikterus bertambah. SGOT dan aktivitas fosfatase alkali yang meningkat akan menurun kembali bila pengobatan dihentikan. Berbagai keluhan yang berhubungan dengan sistem saraf seperli rasa lelah, mengantuk, sakit kepala, pening, ataksia, bingung, sukar berkonsentrasi, sakit pada tangan dan kaki, dan melemahnya otot dapat juga terjadi (Ganiswara, 2000).
II.3.5. Rifampisin dan Pembentukan Radikal Bebas
Rifampisin berikatan dengan subunit beta RNA polimerase (RpoB) dari bakteri Mycobacterium tuberculosis. Pada bakteri gram negatif dan gram positif, telah diketahui bahwa antibiotik bakterisida menginduksi kematian sel dengan menstimulasi produksi radikal bebas yaitu ROS (Reactive Oxygen Species). Hasil penelitan melaporkan bahwa rifampisin menginduksi pembentukan radikal bebas yaitu OH diinduksi oleh rifampisin, dimana radikal bebas ini terbentuk ketika terjadi penghambatan pertumbuhan bakteri Mycobacterium tuberculosis yang dibuktikan dengan
pengukuran menggunakan spektroskopi menggunakan EPR (Electron Paramagnetic Resonance) (Piccaro G dkk. 2014).
II.4. Hubungan Hepatotoksisitas dengan Kombinasi Isoniazid- Rifampisin
Isoniazid dan rifampisin keduanya merupakan terapi lini pertama pada pengobatan tuberkulosis. Dalam terapi tuberkulosis kedua obat ini digunakan dalam bentuk kombinasi dengan dosis tertentu. Isoniazid dan rifampisin masing-masing memiliki efek samping berupa hepatotoksik jika digunakan dalam jangka waktu yang lama, namun penggunaan kombinasi kedua obat ini memiliki resiko efek hepatotoksik yang lebih besar dibanding penggunaan secara tunggal. Hal ini disebabkan karena rifampisin dapat meningkatkan produksi metabolit toksik yang dihasilkan dari metabolisme isoniazid, antara lain asetilhidrazin dan hidrazin yang akan membentuk radikal organik dan ROS yang berkontribusi untuk menyebabkan toksisitas di hati (Adhvaryu dkk. 2008). Isoniazid-rifampisin dapat menginduksi kerusakan hati melalui peningkatan stres oksidatif, peroksidasi lipid, aktivasi enzim tertentu dan menurunkan kadar antioksidan alami dalam tubuh (Kalra dkk. 2007).
II.5. Peroksidasi Lipid
Peroksidasi lipid adalah reaksi yang terjadi antara radikal bebas dengan asam lemak tak jenuh (Polyunsaturated fatty acid, PUFA) yang sedikitnya memiliki tiga ikatan rangkap. Peroksidasi lipid terjadi melalui reaksi enzimatik maupun non enzimatik melibatkan spesies kimia aktif
13
yang dikenal sebagai spesies oksigen reaktif yang bertanggung jawab terhadap efek toksik pada tubuh melalui berbagai kerusakan jaringan.
Terdapat banyak molekul lipid yang mengandung ikatan ganda yang dapat mengalami peroksidasi pada kondisi tertentu. Mekanisme yang memicu peroksidasi lipid sangat kompleks, peroksidasi lipid merupakan suatu rangkaian reaksi yang terjadi dalam 3 fase. Diawali dengan fase inisiasi, dimana terjadi abstraksi ion H dari ikatan C-H lipid dengan paparan oksidan dan terbentuk carbon centred lipid radical. Kemudian diikuti dengan fase propagasi, dimana radikal lipid dengan cepat mengalami penggabungan dengan O2 dan terbentuk radikal peroksi.
Penggabungan O2 dengan lipid radikal yang baru terbentuk, menambah jumlah peroksidasi membran lipid. Disamping abstraksi ion H juga terjadi 3 reaksi penting lain yaitu fragmentasi, rearrangement dan cyclizations.
Akhirnya rangkaian peroksidasi lipid berakhir dengan satu atau lebih reaksi terminasi (Burcham, 1998).
II.6. Malondialdehid
Malondialdehid (MDA) adalah senyawa aldehida hasil produk akhir dari peroksida lipid di dalam tubuh. Senyawa ini memiliki tiga rantai karbon, dengan rumus molekul C3H4O2, MDA juga merupakan produk dekomposisi dari asam amino, karbohidrat kompleks, pentose dan heksosa. Selain itu, MDA juga merupakan produk yang dihasilkan oleh radikal bebas melalui reaksi ionisasi dalam tubuh dan produk sisa dari
biosintesis prostaglandin yang merupakan produk akhir oksidasi lipid membran.
Selain itu, MDA juga merupakan metabolit komponen sel yang dihasilkan oleh radikal bebas. Konsentrasi MDA yang tinggi menunjukkan adanya proses oksidasi dalam membran sel. Status antioksidan yang tinggi biasanya diikuti oleh penurunan kadar MDA (Marnett, 2002).
Uji TBARs (thiobarbituric acid reactive substances), merupakan salah satu uji yang paling lama dan paling sering digunakan untuk mengukur proses peroksidasi lipid asam lemak tidak jenuh. Uji TBARs dapat menilai stress oksidatif berdasarkan reaksi asam tiobarbiturat dengan malondialdehid (MDA). Supernatan plasma direaksikan dengan asam tiobarbiturat menghasilkan kromofor berwarna merah muda yang dibaca pada panjang gelombang 532 nm (Gutteridge dkk. 2000 dan Siswonoto, 2008).
II.7. Tanaman Cengkeh
II.7.1. Klasifikasi Tanaman Cengkeh Divisi : Spermatophyta
Sub Divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Sub kelas : Monochlamydae
Gambar 3. Rumus struktur malondialdehid
Bangsa : Caryophylalles Suku : Caryophillaceae Famili : Myrtaceae
Spesies : Oleum caryophylli (L.) Meer. & Perry (Syamsuhidayat dkk.
1991)
II.7.2. Minyak Cengkeh
Produk samping dari tanaman cengkeh adalah minyak cengkeh.
Tergantung dari bahan bakunya ada tiga macam minyak cengkeh, yaitu minyak bunga cengkeh, minyak tangkai cengkeh, dan minyak daun cengkeh. Rendemen dan mutu dari minyak yang dihasilkan dipengaruhi oleh asal tanaman, varietas, mutu bahan, penanganan bahan sebelum penyulingan, metode penyulingan serta penanganan minyak yang dihasilkan. Bunga cengkeh mengandung minyak sekitar 10–20%, tangkai cengkeh 5–10% dan daun cengkeh 1–4%. Pemisahan kandungan kimia dari serbuk bunga, tangkai bunga dan daun cengkeh menunjukan bahwa serbuk bunga dan daun cengkeh mengandung saponin, tannin, alkaloid, glikosida dan flavonoid, sedangkan tangkai bunga cengkeh mengandung saponin, tannin, glikosida dan flavonoid (Nurdjannah, 2004).
Kandungan utama dari minyak cengkeh secara umun adalah eugenol (49-87%), β-caryophyllene (4–21%), dan eugenil asetat (0.5–
21%). Untuk kandungan senyawa kimia utama minyak cengkeh yang berasal dari Indonesia tertera pada tabel 1 (Razafimamonjison dkk. 2014).
Tabel 1. Kandungan senyawa kimia minyak cengkeh yang berasal dari Indonesia kandungan senyawa kimia persentase (%)
methyl salicylate 0,04-0,16
chavicol 0,13-0,18
eugenol 77,32-82,36
α-copaene 0,17-0,27
methyl eugenol 0,04-0,08 β-caryophyllene 5,34-8,64
iso-eugenol 0,02-0,24
α-humulene 0,65-1,04
eugenyl acetate 8,61-10,55 caryophyllene oxide 0,06-0,32
II.7.3. Cara Memperoleh Minyak Cengkeh
Minyak cengkeh diperoleh melalui destilasi tanaman cengkeh, dimana tanaman tersebut disuling dengan cara uap dan air, atau cara uap langsung dengan periode waktu yang berlainan antara 8–24 jam tergantung dari keadaan bahan dan kandungan minyaknya. Bunga dan tangkai cengkeh membutuhkan waktu yang lebih lama karena kadar minyaknya yang jauh lebih tinggi daripada daun cengkeh. Kandungan eugenol dari minyak tergantung dari waktu destilasi. Waktu destilasi yang singkat menghasilkan minyak dengan kandungan eugenol yang jauh lebih tinggi daripada yang biasa dilakukan dengan waktu yang lebih lama (Nurdjannah, 2004).
Penyulingan minyak cengkeh dengan metode air dan uap dengan alat yang terbuat dari stainless steel, pernah dilakukan dan menghasilkan rendemen 5-6% dengan kadar eugenol 90-98%. Makin lama waktu
penyulingan, makin rendah kadar eugenol dari minyak yang dihasilkan (Nurdjannah, 2004).
II.7.4. Manfaat Minyak Cengkeh
Selain digunakan dalam industri makanan, minuman dan rokok kretek, cengkeh sudah sejak lama digunakan dalam pengobatan sehari – hari karena minyak cengkeh mempunyai efek farmakologi sebagai stimulan, anestetik lokal, karminatif, antiemetik, antiseptik, antispasmodik, dan antioksidan (Nurdjannah, 2004). Ekstrak tanaman cengkeh larut air dan larut alkohol menunjukkan penghambatan lipid peroksidasi pada emulsi asam linoleat (Nowak, K. dkk. 2014). Berdasarkan hasil penelitian Sohilait dkk. (2015) eugenol dan eugenil asetat yang terkandung dalam minyak cengkeh memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi sehingga dapat dimanfaatkan sebagai hepatoprotektif. Eugenol sebagai antioksidan diperkirakan bekerja dengan menghambat proses peroksidasi lipid, baik pada tahap inisiasi, propagasi ataupun keduanya (Ogata, M dkk. 2000).
WHO menetapkan nilai asupan eugenol yang dapat diterima yaitu 2,5 mg/kgBB per hari. Pada manusia, dosis letal oral minyak cengkeh yaitu 3,75 g/kgBB sedangkan pada tikus memiliki LD50 oral sebesar 5.950 mg/kgBB tikus (El-Hadari dkk. 2015).
BAB III
PELAKSANAAN PENELITIAN III.1. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sentrifuge (Hettich®), mikropipet (Socorex®), labu ukur, aluminium foil, magnetic strirer, lemari pendingin, spektrofotometer UV-Visible (Agilent®), waterbath, gelas ukur (Pyrex®), timbangan analitik (Sartorius®), tabung vakutainer dan tabung effendorf
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu minyak cengkeh (Happy Green®), tablet isoniazid (Kimia Farma®), kapsul rifampisin (Kimia Farma®), vitamin E (Natur E®), minyak cengkeh (Mazola®), dietil eter, thiobarbituric acid (TBA) 0,1%, trichloroacetate acid (TCA) 10%, alkohol 70%, kapas, TMP (1,1,3,3-tetramethoxypropane), phosphate buffered saline pH 7,4 dan tikus putih (Rattus norvegicus)
III.2. Metode Kerja
III.2.1. Penyiapan Hewan Coba
Pada penelitian ini digunakan hewan coba tikus jantan putih sehat sebanyak 15 ekor dengan berat badan rata-rata 150-200 gram. Hewan coba kemudian diadaptasikan sesuai dengan situasi dan kondisi lingkungan laboratorium. Hewan coba diberi pakan dan air minum secukupnya selama 7 hari. Kemudian ditimbang dan dibagi secara acak menjadi 5 kelompok perlakuan.
18
III.2.2. Pembuatan Suspensi Isoniazid-Rifampisin
Pada pembuatan suspensi isoniazid-rifampisin, pensuspensi yang digunakan yaitu NaCMC dengan konsentrasi 1%. NaCMC 1% dibuat dengan menimbang sebanyak 1 gram NaCMC kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam 50 ml air suling panas (suhu 70C) sambil diaduk dengan pengaduk elektrik hingga terbentuk larutan koloidal lalu larutan tersebut dicukupkan volumenya dengan air suling dalam labu tentukur hingga 100 ml.
Untuk isoniazid dan rifampisin terlebih dahulu ditentukan bobot rata-rata dengan menimbang 20 tablet kemudian dirata-ratakan. Bobot isoniazid yang ditimbang sesuai perhitungan keseragaman bobot yaitu 2,437 g. Isoniazid yang telah ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur dan disuspensikan dengan NaCMC 1% sebanyak 100 ml, dihomogenkan lalu dipindahkan ke wadah botol coklat. Untuk kapsul rifampisin ditimbang 2,151 g dan dilakukan pengerjaan yang sama seperti isoniazid. Dalam 1 ml suspensi terdapat 10 mg isoniazid dan 20 mg rifampisin.
III.2.3. Penyiapan Minyak Cengkeh
Minyak cengkeh yang digunakan diperoleh dari PT. Happy Green.
Berdasarkan penelitian Al-Okbi dkk. (2014), dosis oral minyak cengkeh yang memiliki aktivitas antioksidan pada tikus yang digunakan adalah 5-200 mg/kg BB tikus.
Dosis yang dipilih untuk diberikan pada tikus pada penelitian ini adalah 10, 50 dan 100 mg/kgBB. Jadi, dosis minyak cengkeh yang diberikan pada hewan uji adalah 2 mg, 10 mg dan 20 mg untuk bobot tikus 200 gram.
Pembawa yang digunakan untuk mengencerkan minyak cengkeh yaitu minyak jagung dengan volume pemberian 1 ml, sehingga konsentrasi minyak cengkeh yang diberikan adalah 0,2%, 1%, 2% 𝑣⁄ . 𝑣
III.2.4. Pemberian Induksi Obat Isoniazid-Rifampisin
Tikus putih yang digunakan diberikan induksi obat isoniazid-rifampisin secara per-oral. Dosis kombinasi Isoniazid-Rifampisin yang diberikan sesuai dengan hasil penelitian Kalra dkk. (2007) yaitu isoniazid 50 mg/kg dan rifampisin 100 mg/kg. sehingga untuk tikus dengan bobot 200 g yaitu 10 mg untuk isoniazid dan 20 mg untuk rifampisin. Dengan volume pemberian 1 ml/200g BB tikus, sehingga untuk tikus dengan bobot 180 gram diberikan sebanyak 0,9 ml.
Namun, setelah 21 hari penelitian dengan menggunakan dosis tersebut, tidak terjadi perubahan yang signifikan pada kelompok kontrol negatif, sehingga dosis isoniazid dan rifampisin yang digunakan dinaikkan masing-masing sebanyak 2 kali lipat dari dosis sebelumnya, yaitu isoniazid 20 mg/200g BB tikus dan rifampisin 40 mg/200g BB tikus.
III.2.5. Penyiapan Vitamin E (Natur E®)
Vitamin E yang digunakan diperoleh dari produk Natur E® 100 IU.
Dosis vitamin E yang digunakan pada hewan coba yaitu 250 mg/kg BB, dosis ini menunjukkan perbaikan nilai MDA pada tikus yang diberi doksorubisin (Pramitha 2016). Jadi dosis vitamin E yang diberikan untuk hewan uji adalah 50 mg/200gBB setara dengan 74,96 IU. Tiap kapsul Natur E® berisi 0,37 ml vitamin E setara dengan 66,7 mg vitamin E, sehingga untuk dosis 50 mg
vitamin E yang dipipet adalah 27,73 ml. Vitamin E yang telah dipipet dimasukkan ke dalam labu tentukur dan dicukupkan volumenya dengan minyak jagung hingga 100 ml lalu dihomogenkan. Volume pemberian yang diberikan pada tikus secara per-oral adalah 1 ml/200gBB. Tiap 1 ml mengandung 0,2773 ml vitamin E yang setara dengan 50 mg/200g BB.
III.3. Prosedur Percobaan
Hewan coba dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu :
1) kelompok I sebagai kontrol negatif hanya diberikan minyak pembawa (minyak jagung) sebagai pembawa + suspensi INH-RIF
2) kelompok II diberikan minyak cengkeh 0,2% setara dengan 2 mg/200g BB tikus dalam minyak pembawa + suspensi INH-RIF
3) kelompok III diberikan minyak cengkeh 1% setara dengan 10 mg/200g BB dalam minyak pembawa + suspensi INH-RIF
4) kelompok IV diberikan minyak cengkeh 2% setara dengan 20 mg/200g BB dalam minyak pembawa + suspensi INH-RIF
5) kelompok V sebagai kontrol positif diberikan vitamin E 50 mg/200g BB dalam minyak pembawa + suspensi INH-RIF
Perlakuan untuk masing-masing kelompok dilakukan selama 28 hari berturut-turut, minyak cengkeh dan vitamin E diberikan 2 jam sebelum induksi INH-RIF. Pengambilan darah dilakukan sehari sebelum perlakuan dan pada hari ke-28 (Ramappa dkk. 2013).
III.3.1 Pengambilan Darah Tikus
Pengambilan darah tikus melalui vena ekor (vena lateral), pengambilan darah dilakukan setelah tikus dianastesi menggunakan dietil eter. Sampel darah sebanyak 3 ml diambil, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Diambil bagian serumnya dan disimpan pada suhu -200C hingga sampel dianalisis.
III.3.2. Pengukuran Kurva Baku
Larutan standar dibuat dari larutan standar 1,1,3,3- tetrametoksipropana (TMP) 1000 ppm dengan memipet 10 µl larutan standar kedalam labu tentukur 10 ml dan dilarutkan dengan PBS pH 7,4, TCA 10%
dan TBA 1% dengan perbandingan berturut-turut 0,5 : 1 : 1. Kemudian dibuat larutan standar 100 ppm dengan memipet 1 ml larutan standar 1000 ppm ke dalam labu tentukur 10 ml. Dibuat larutan stok 5 ppm dengan memipet 0,5 ml larutan standar 100 ppm ke dalam labu tentukur 10 ml. Deret standar dibuat pada konsentrasi 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,30 ppm dengan memipet masing- masing 100; 150; 200; 250; 300 μl larutan stok 5 ppm ke dalam labu tentukur 5 ml. Semua larutan kemudian dipanaskan selama 20 menit pada suhu 90- 1000C menggunakan waterbath. Kemudian didinginkan pada suhu kamar, setelah didinginkan larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan pada lapisan atas diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 532 nm (Samma, 2016).
III.3.3. Pengukuran Kadar Malondyaldehid (MDA)
Untuk pengukuran kadar malondialdehid, sampel plasma dipipet sebanyak 0,5 ml ditambahkan 1,0 ml TCA (Trichloro acetic acid) dan 1,0 ml TBA (thiobarbituric acid). Campuran dipanaskan 90-1000C selama 20 menit menggunakan waterbath, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan pada lapisan atas diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 532 nm untuk mengetahui kadar MDA (Samma, 2016).
III.3.4. Analisis Statistik
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan software SPSS 20. Data dibuat dalam bentuk kategori, dimana kategori 1 kadar MDA pada hari ke-28 mengalami peningkatan >20% dari darah awal (hari ke-0), kategori 2 kadar MDA pada hari ke-28 relatif tidak mengalami penurunan atau peningkatan
≤20% dari darah awal (hari ke-0) dan kategori 3 kadar MDA pada hari ke-28 menurun >20% dari darah awal (hari ke-0). Data kategori peningkatan MDA diuji dengan metode non-parametrik Kruskal Wallis dan apabila p<0,05 dilanjutkan dengan Mann-Whitney Test untuk melihat perbedaan antar dua kelompok. Perbedaan dinyatakan signifikan apabila nilai p<0,05.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas peroksidasi secara fisiologis terjadi karena pada umumnya tubuh kita menghasilkan ROS (Reactive Oxygen Species) atau radikal bebas melalui metabolisme yang terjadi dalam tubuh. Radikal bebas ini sangat mudah bereaksi dengan asam lemak tak jenuh pada membran sel sehingga membentuk lipid peroksida dengan produk akhir berupa malondialdehid (MDA). Pada kadar yang rendah, terjadinya peroksidasi lipid secara fisiologis dapat menstimulasi pemeliharaan sel dan kelangsungan hidup sel melalui sistem pertahanan dengan adanya antioksidan. Normalnya, peroksidasi lipid di dalam tubuh masih dapat diatasi oleh antioksidan alami (antioksidan endogen) seperti katalase, superokside dismutase (SOD) ataupun glutation peroksidase.
Kadar malondialdehid serum diukur dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-Visible, hasil pengukuran ditunjukkan pada tabel 2.
24
Tabel 2. Kadar malondialdehid serum tikus putih yang diinduksi isoniazid-rifampisin dengan perlakuan tertentu
Kelompok Kode
kadar MDA (µg/ml)
∆ Kadar
MDA kategori Hari ke-0 Hari ke-28
Kontrol Negatif (Minyak Pembawa)
I 0,295 0,287 -0,008 2
II 0,159 0,288 0,129 1
II 0,053 0,285 0,232 1
Rerata ± SD 0,169 ± 0,121 0,287 ± 0,001 - -
Minyak Cengkeh 0,2%
I 0,054 0,359 0,305 1
II 0,117 0,286 0,169 1
III 0,104 0,23 0,126 1
Rerata ± SD 0,092 ± 0,033 0,292 ± 0,065 - -
Minyak Cengkeh 1%
I 0,067 0,036 -0,031 3
II 0,057 0,044 -0,013 3
III 0,062 0,042 -0,02 2
Rerata ± SD 0,062 ± 0,005 0,041 ± 0,004 - -
Minyak Cengkeh 2%
I 0,089 0,399 0,31 1
II 0,077 0,275 0,198 1
III 0,104 0,393 0,289 1
Rerata ± SD 0,09 ± 0,014 0,355 ± 0,07 - -
Kontrol Positif (Vitamin E)
I 0,197 0,166 -0,031 2
II 0,227 0,045 -0,182 3
III 0,071 0,033 -0,038 3
Rerata ± SD 0,165 ± 0,083 0,081 ± 0,073 - -
Keterangan :
Kategori 1, kadar malondialdehid pada hari ke-28 mengalami peningkatan >20% dari darah awal (hari ke-0)
Kategori 2, kadar malondialdehid pada hari ke-28 relatif tidak mengalami penurunan atau peningkatan ≤20% dari darah awal (hari ke-0)
Kategori 3, kadar malondialdehid pada hari ke-28 menurun >20% dari darah awal (hari ke-0)
Tabel 2 menunjukkan kadar MDA sebelum perlakuan (hari ke-0) dan setelah 28 hari perlakuan (hari ke-28). Data sebelum perlakuan, kadar MDA tikus sangat bervariasi, dimana untuk kelompok kontrol negatif dan kelompok vitamin E mempunyai range yang cukup tinggi dibandingkan kelompok yang diberi minyak cengkeh.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45
kontrol negatif
minyak cengkeh 0,2%
minyak cengkeh 1%
minyak cengkeh 2%
vitamin e hari ke-0 hari ke-28
MDA (µg/ml)
*
α
Gambar 4. Diagram kadar malondialdehid serum tikus putih pada hari ke-0 dan hari ke-28
Hasil analisis statistik menunjukkan perbedaan kadar MDA antar kelompok sebelum perlakuan berbeda nyata (p<0,05). Fluktuasi kadar MDA dapat disebabkan oleh berbagai faktor, diantaranya faktor lingkungan atau makanan yang menyebabkan tikus menjadi stres dan kondisi fisiologis tikus juga dapat mempengaruhi. Oleh karena itu untuk menghindari bias, maka penilaian perbedaan kadar MDA antar kelompok perlakuan akan dinilai berdasarkan rentang kategori, yaitu kategori 1 kadar MDA pada hari ke-28 mengalami peningkatan >20% dari darah awal (hari ke-0), kategori 2 kadar MDA pada hari ke-28 relatif tidak mengalami penurunan atau peningkatan
*
* α
α β
β
β
Keterangan :
* = p<0,05, antara kelompok perlakuan kontrol negatif dengan minyak cengkeh 1%
dan vitamin E
α = p<0,05, antara kelompok perlakuan minyak cengkeh 0,2% dengan minyak cengkeh 1% dan vitamin E
β = p<0,05, antara kelompok perlakuan minyak cengkeh 2% dan minyak cengkeh 1% dan vitamin E
≤20% dari darah awal (hari ke-0), kategori 3 kadar MDA pada hari ke-28 menurun >20% dari darah awal (hari ke-0).
Setelah 28 hari perlakuan, kontrol negatif yang diberi minyak pembawa (minyak jagung) dan induksi obat isoniazid-rifampisin, mengalami peningkatan kadar MDA pada dua tikus >20% dari nilai kadar MDA darah awal (hari ke-0). MDA merupakan produk akhir yang dihasilkan dari proses peroksidasi lipid. Isoniazid-rifampisin dapat menginduksi kerusakan organ dengan menghasilkan metabolit reaktif berupa radikal bebas yang dapat berikatan secara kovalen dengan makromolekul sel sehingga menyebabkan terjadinya kerusakan sel yang menginduksi stres oksidatif (Kalra dkk. 2017 dan Totsmann dkk.2007). Apabila senyawa radikal bebas ini berikatan dengan makromolekul sel akan menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid yang ditandai dengan peningkatan nilai MDA (Santhosh S, dkk 2011).
Untuk kelompok 2 dengan perlakuan minyak cengkeh 0,2% dan induksi obat isoniazid-rifampisin, pada hari ke-28 menunjukkan nilai kadar MDA pada semua tikus meningkat >20% dari nilai kadar MDA awal. Sehingga dapat dikatan bahwa minyak cengkeh 0,2% tidak dapat menurunkan nilai kadar MDA tikus. Hal ini dapat terjadi dikarenakan minyak cengkeh dengan konsentrasi 0,2% diduga memiliki aktivitas penghambatan radikal bebas yang sangat kecil sehingga menyebabkan nilai kadar MDA tetap meningkat.
Namun, peningkatan kadar MDA >20% juga terjadi pada tikus yang diberi minyak cengkeh dosis tinggi (2%), dimana semua tikus mengalami peningkatan kadar MDA pada hari ke-28. Peningkatan nilai kadar MDA untuk
kelompok yang diberi minyak cengkeh konsentrasi 2% dikarenakan dosis minyak cengkeh yang terlalu tinggi. Berdasarkan jurnal penelitian Cortes- Rojes. dkk. (2014) menyatakan bahwa eugenol dapat berfungsi sebagai antioksidan pada konsentrasi yang tidak terlalu tinggi namun bersifat prooksidan pada konsentrasi tinggi. Sehingga dapat disimpulkan minyak cengkeh konsentrasi 2% tidak mampu menurunkan kadar MDA karena eugenol yang terkandung dalam minyak cengkeh berperan sebagai prooksidan, bukan sebagai antioksidan sehingga nilai kadar MDA tidak menurun namun tetap meningkat. Berdasarkan jurnal penelitian Sohilait dkk.
(2015), menyatakan bahwa dosis oral minyak cengkeh yang memiliki aktivitas antioksidan yaitu berada pada kisaran 5-200 mg/kgBB tikus.
Berdasarkan perhitungan dosis, untuk konsentrasi 0,2% dosis yang digunakan adalah 10 mg/kgBB tikus dan untuk konsentrasi 2% yaitu 100 mg/kgBB tikus. Meskipun dosis tersebut berada dalam rentang dosis 5-200 mg/kgBB, namun hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dosis minyak cengkeh sebagai antioksidan harus lebih tinggi dari 10 mg/kgBB dan lebih rendah dari 100 mg/kgBB tikus.
Pada kelompok 3 yang diberi minyak cengkeh 1% dan induksi obat isoniazid-rifampisin, menunjukkan pada hari ke-28 dua dari tiga tikus mengalami penurunan kadar MDA >20% dari nilai kadar MDA awal.
Berdasarkan hasil tersebut, menunjukkan minyak cengkeh dengan konsentrasi 1% dapat menurunkan kadar MDA serum tikus yang diinduksi isoniazid-rifampisin. Sehingga minyak cengkeh konsentrasi 1% atau dosis 50
mg/kgBB tikus merupakan dosis yang paling baik untuk digunakan sebagai antioksidan dibandingkan minyak cengkeh konsentrasi 0,2% dan 2% pada penelitian ini. Minyak cengkeh mengandung senyawa eugenol dan eugenil asetat dimana keduanya memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi, sehingga dengan konsentrasi tertentu dapat dimanfaatkan sebagai antioksidan untuk mencegah terjadinya kerusakan sel akibat radikal bebas (Sohilait dkk.2015).
Untuk kontrol positif menggunakan vitamin E, pada hari ke-28 juga diperoleh hasil yaitu dua dari tiga tikus mengalami penurunan kadar MDA
>20% dari nilai kadar MDA awal. Vitamin E merupakan salah satu antioksidan alami yang potensial untuk mengurangi radikal bebas dengan memproduksi PUFA (Polyusaturated Fatty Acid), dimana PUFA ini yang merupakan komponen penyusun utama pada membran sel dan lipoprotein plasma. Terjadinya penurunan kadar MDA menandakan bahwa vitamin E dapat mengatasi terjadinya kerusakan sel akibat radikal bebas.
Tabel 3. Hasil statistik perbandingan tiap kelompok perlakuan menggunakan metode Mann Whitney U Test
Keterangan :
1, menunjukkan hasil yang signifikan (p<0,05) 2, menunjukkan hasil yang tidak signifikan (p>0,05)
kelompok
kontrol negatif (minyak pembawa)
minyak cengkeh
0,2%
minyak cengkeh
1%
minyak cengkeh
2%
Kontrol positif (Vitamin
E) kontrol negatif
(minyak pembawa) - 2 2 2 2
minyak cengkeh
0,2% 2 - 1 2 1
minyak cengkeh 1% 2 1 - 1 2
minyak cengkeh 2% 2 2 1 - 1
kontrol positif
(vitamin E) 2 1 2 1 -
Berdasarkan hasil statistik menggunakan metode Kruskal Wallis, diperoleh perbedaan hasil penurunan/peningkatan kadar MDA antar kelompok (p<0,05), sehingga dilanjutkan dengan metode Mann Whitney U Test pada masing-masing kelompok.
Hasil analisis statistik Mann Whitney U Test, diperoleh hasil bahwa pemberian minyak cengkeh 1% secara signifikan menurunkan kadar MDA dibanding tikus yang diberi minyak cengkeh 0,2 dan 2%. Efek penurunan MDA minyak cengkeh 1% tidak berbeda nyata dengan kontrol positif yang diberi vitamin E. Oleh karena itu disimpulkan bahwa untuk mencegah lipid peroksidasi yang diinduksi isoniazid-rifampisin, pilihan antioksidan yang terbaik pada penelitian ini adalah minyak cengkeh 1% dan vitamin E. Hasil penelitian yang diperoleh sejalan dengan penelitian Djabir dkk. (2016) yang menunjukkan terjadinya penurunan kadar MDA serum pada tikus putih yang diinduksi doksorubisin untuk kelompok perlakuan vitamin E. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian vitamin E dapat mencegah terjadinya peroksidasi lipid yang diinduksi doksorubisin.
BAB V KESIMPULAN V.1. Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh dari hasil penelitian ini yaitu minyak cengkeh dengan konsentrasi 0,2% dan 2% yang setara dengan dosis 10 mg/kgBB dan 100 mg/kgBB tidak dapat menurunkan kadar MDA darah tikus yang diinduksi isoniazid-rifampisin sedangkan minyak cengkeh dengan konsentrasi 1% atau setara dengan dosis 50 mg/kgBB tikus dapat menurunkan kadar MDA tikus yang diinduksi isoniazid-rifampisin. Efek penurunan kadar MDA minyak cengkeh 1% setara dengan vitamin E sebagai antioksidan.
V.2. Saran
1. Melihat tingginya kadar MDA serum yang bersifat sistemik, sebaiknya dilakukan penelitian MDA lebih lanjut terhadap organ hati maupun ginjal, karena isoniazid-rifampisin bersifat toksik terhadap hati dan ginjal.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai dosis minyak cengkeh yang paling optimal sebagai antioksidan.
31
32
DAFTAR PUSTAKA
Adhvaryu, M.R., Reddy, N.M., Vakharia, B.C., 2008, ‘Prevention of hepatotoxicity due to anti tuberculosis treatment: A novel integrative
approach’, World J Gastroenterol, vol. 14, no.30, hh. 4753-4762
Al-Okbi, S.Y., Mohamed, D.A., Hamed, T.E., Edris, A.E. 2014, ‘Protective Effect of Clove Oil and Eugenol Microemulsions on Fatty Liver and Dyslipidemia as Component of Metabolic Syndrome’, Journal of Medicinal Food, vol.7, hh. 764-771.
Aliahmad, N.S., Noor, M.R.M., Yusof, W.J.W., Makpol, S., Ngah, W.Z.W., Yusog, Y.A.M., 2012, ‘Antioxidant enzyme activity and malondialdehyde levels can be modulated by Piper betle, tocotrienol rich fraction and Chlorella vulgaris in aging C57BL/6 mice’, Clinics, vol.
67, no.12, hh.1447-1454
Asih N., Effendy, C. 2003, Keperawatan Medikal Bedah Klien dengan Gangguan Sistem Pernapasan, Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC
Baskaran, Y., Periyasamy, V., Venkatraman, A.C. 2010, ‘Investigation of antioxidant, anti-inflamatory and DNA-Protective Properties of Eugenol in Thioacetamide-induced Liver Injury in Rats’ Toxicol, vol, 286, hh.
204-212.
Burcham P.C. 1998, ‘Genotoxic lipid peroxidation products : their DNA damaging properties and role in formation of endogenous DNA adducts’, Mutagenesis, Vol. 13, hh. 287 – 305.
Cherubini A., Polidori C., Bedetti C., Ercolani S., Senin U., Mecocci P. 1999, Assosiation Between Ischemic Stroke and Increased Oxidative Stress.
Cortes-Rojes, D.F., Fernandes de soura, C.R., and Oliveira, W.P., 2014, 'Clove (Syzygium aromaticum): a Precious Spice', Asian Pasific Journal of Tropical Biomedicine, Vol.4, no.2, hh : 90-96.
Djabir, Y.Y., Usmar., Wahyudin, E., Mamada, S.S., Hamka, I.R.N., Putri, D.P.S., Amalia, I. 2016. 'Roles of Vitamin C and Vitamin E on Doxorubicin-Induced Renal and Liver Toxicity in Rats', Nusantara Medical Science Jurnal, vol. 1, no.2, hh. 16-23
Droge W. 2002, ‘Free Radical In The Physiological Control of Cell Function’, American Physiological Society, vol. 82, hh. 47 – 95.
