Fungi Dekomposer Penghasil Enzim Ekstraseluler Lakase, Mangan Peroksidase, dan Lignin Peroksidase dari Kawasan Kebun Raya Bogor: Isolasi, Seleksi, Identifikasi dan
Kajian Aktivitas Enzimnya
[Decomposer Fungi Producing Extracellular Enzymes Laccase, Mangan Peroksidase, and Lignin Peroksidase from The Botanic Gardens areas: Isolation, Selection,
Identification and Study of Their Enzyme Activities]
Riki Ruhimat1,2, Gunawan Djajakirana1, & Sarjiya Antonius2
1Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, 2Pusat Riset Biologi, Badan Riset Inovasi Nasional.
Email: [email protected] Memasukkan: Februari, Diterima: April 2022
ABSTRACT
This study aimed to obtain the candidate isolates of superior decomposer from several plant block areas in the Bogor Botanic Gardens (KRB). Those candidates were expected to be able to utilize in the fermentation process of solid organic waste. The superior decomposer fungi candidates were selected based on their abilities to produce extracellular enzymes (laccase - Lac, manganese peroxidase - MnP, and lignin peroxidase - LiP) using 0.05% guaiacol as a substrate. The highest abundance of decomposer population was found in the block 4 with 9.9 x 106 CFU ml-1, and the lowest in block 6 with 1.9 x 106 CFU ml-1 density. Three superior decomposer isolates were obtained, namely KRB 3.1 (from block area 3), KRB 4.6 (from block area 4), KRB 6.7 isolate (from block area 7). The KRB 6.7 isolate has the highest Lac and MnP enzyme activities, as the following 24.10 U ml-1 and 186.3 U ml-1, while KRB 3.1 isolate from block area 3 has the highest LiP activity with the value 598.57 U ml-1. According to the molecular analysis, those candidate isolates of superior decomposers were identified as Coriolopsis hainanensis (KRB 3.1 isolate), Polyporus thailandensis (KRB 4.6 isolate), and Cerrena aurantiopora (KRB 6.7 isolate). Those are potentially used as the decomposers in solid organic waste fermentation.
Keywords: decomposer microbes, laccase enzymes, organic waste ABSTRAK
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh kandidat isolat-isolat dekomposer unggulan dari berbagai blok tanaman koleksi kawasan Kebun Raya Bogor (KRB) yang berbeda yang dapat dimanfaatkan dalam proses fermentasi limbah organik padat. Kandidat fungi dekomposer unggulan diseleksi berdasar kemampuannya menghasilkan enzim ekstraseluler (lakase-Lac, mangan peroksidase-MnP, dan lignin peroksidase-LiP) dengan menggunakan substrat Guaiacol 0,05%. Kelimpahan populasi dekomposer paling tinggi didapatkan pada blok 4 dengan kepadatan 9,9 x 106 CFU ml-1, dan terendah pada blok 6 dengan kepadatan 1,9x106 CFU ml-1. Diperoleh tiga isolat dekomposer unggulan yaitu isolat KRB 3.1 (dari blok 3), isolat KRB 4.6 (dari blok 4), isolat KRB 6.7 (dari blok 7) memiliki aktivitas enzim Lac dan MnP tertinggi yaitu masing-masing 24,10 U ml-1 dan 186,36 U ml-1, sedangkan isolat KRB 3.1 dari blok 3 memiliki aktivitas LiP tertinggi yaitu 598,57 U ml-1. Kandidat isolat dekomposer unggulan terseleksi berdasarkan analisa molekular diidentifikasi sebagai Coriolopsis hainanensis (isolat KRB 3.1), Polyporus thailandensis (isolat KRB 4.6), dan Cerrena aurantiopora (isolat KRB 6.7) berpotensi sebagai dekomposer dalam fermentasi limbah organik padat.
Kata Kunci: mikroba dekomposer, enzim lakase, limbah organik PENDAHULUAN
Enzim ligninolitik mikroba telah mendapat banyak mendapat perhatian dan diteliti seperti lakase, mangan peroksidase, dan lignin peroksidase yang merupakan kontributor utama dalam bio- degradasi lignin (Dashtban et al. 2010). Enzim- enzim tersebut memiliki potensi aplikasi yang besar dan banyak peluang untuk dimanfaatkan di berbagai bidang seperti, pertanian, pulp dan kertas, bio-
energi, kosmetik, tekstil, dan industri makanan (Senthivelan et al. 2019).
Kebun Raya Bogor dengan 18.310 spesimen koleksi tanaman mampu menghasilkan bahan organik antara 300 ton per tahun (KRB 2018).
Kondisi lingkungan KRB memiliki kelembaban yang tinggi (sekitar 80%) dan suhu yang ideal, memungkinkan sebagai ekosistem yang cocok untuk tumbuhnya berbagai mikroba dekomposer seresah daun yang mengandung lignin dari
berbagai pohon koleksi tersebut. Fungi merupakan organisme yang berperan penting dalam proses perombakan bahan organik, seperti seresah yang jatuh ke lapisan permukaan tanah. Perombakan bahan organik secara alami maupun artifisial (fermentasi) membutuhkan bantuan mikroba dekomposer untuk merombak struktur polimer di dalam jaringan tanaman seperti selulosa, hemi- selulosa, dan lignin. Gerke (2018) menyatakan bahwa substrat lignin sulit terurai karena resisten terhadap serangan mikroba. Lignin berasal dari polimer aromatik phenilpropanoid, hasil sintesa koniferil, sinapil, dan p-koumaril monomer (Tan 2014).
Fungi pelapuk putih secara umum diketahui menghasilkan satu atau lebih enzim ekstraseluler yang bertanggung jawab dalam mendegradasi lignin (polimer aromatik) dan fraksi alipatik (Baruah et al. 2018). Aktivitas fungi, terutama fungi pelapuk putih selain berperan dalam proses perombakan bahan organik juga dapat meng- inisiasi pembentukan senyawa humik pada bahan organik yang sudah stabil (Janusz et al. 2017 &
Khatami et al. 2019). Enzim ekstraseluler yang dapat mengkatalis depolimerisasi senyawa lignin terdiri dari phenol oksidase (lakase), lignin peroksidase (LiP), mangan peroksidase (MnP), dan versatil peroksidase (VP) (Dashtban et al.
2010).
Beberapa fungi penghasil enzim ekstraseluler yang hidup tersebar di tanah diantaranya Basidio- mycetes dan kelompok mikroba dari Actinomycetes (Kowalczyk et al. 2019). Pemanfaatan di bidang pertanian, seperti transformasi mikroba sebagai agen dekomposer diterapkan dalam meningkatkan kualitas degradasi bahan organik seperti serasah daun yang kaya lignin. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat fungi unggul terseleksi sebagai dekomposer penghasil enzim ekstraseluler lakase (Lac.), mangan peroksidase (MnP), dan lignin peroksidase (LiP) yang sangat bermanfaat dalam proses fermentasi limbah seresah daun dan limbah organik padat yang kaya kandungan lignin menjadi pupuk organik yang yang berkualitas dengan kandungan asam humat yang tinggi.
BAHAN DAN CARA KERJA
Sampel serasah diambil dari 7 lokasi tanaman koleksi berdasarkan tingkat keragaman
jenis pohon yang bervariasi di Kebun Raya Bogor.
Sampel serasah yang telah melapuk di atas permukaan tanah diambil dari 10 titik kemudian dicampur secara komposit setiap blok tumbuhan koleksi dan masing-masing blok diberi kode sampel KRB 1, KRB 2, KRB 3, KRB 4, KRB 5, KRB 6, dan KRB 7. Sampel dimasukan kedalam plastik steril dan diberi label yang berisi identitas sampel seperti blok koleksi dan tanggal, kemudian dibawa ke laboratorium dengan menggunakan cool box.
Isolasi fungi seresah diawali dengan seri pengenceran (dilution method) yaitu mensuspensi- kan 10 g sampel serbuk seresah ke dalam 90 ml larutan fisiologis (NaCl 0,85%), digoyang pada rotary shaker. Pembuatan dua seri pengenceran terakhir 10-4 dan 10-5 diambil 100 µl dan dituang dalam cawan petri steril yang berisi media potato dextrose agar (PDA) dan diinkubasi pada suhu 30oC ± 2oC selama 4-8 hari (Sukmawati 2018).
Masing-masing koloni fungi terpilih dengan visual yang berbeda dari hasil pemurnian ditumbuhkan pada cawan steril berisi larutan PDA yang diperkaya 0,05% guaiacol sebagai substrat pada
Blok Vak Koleksi
Famili 1 XXI,
XXIV, XXV
Poaceae, Rutaceae, Malvaceae, Ebenaceae, Sapotaceae,
Dipterocarpaceae, Euphorbiaceae 2 XIII, IX,
XI
Anacardiaceae, Sapindaceae, Apocynaceae, Sapotaceae, Euphorbiaceae, Clusiaceae, Meliaceae, Malvaceae 3 XVI,
XVII
Connaraceae, Menispermaceae, Caesalpiniaceae, Papilionaceae, Annonaceae, Dilleniaceae, Vitaceae, Tilliaceae, Sterculiaceae
4 V, VI Myrtaceae, Lecythidaceae, Clusiaceae, Dipterocarpaceae 5 III, IV, V Meliaceae, Sapindaceae,
Polygolaceae, Celastraceae, Cardiopteridaceae, Icacinaceae, Rubiaceae, Apocynaceae, Sapotaceae, Flacoutiaceae, Dilleniaceae, Podocarpaceae
6 XXV,
XVI Gnetaceae, Dioscoreaceae, Smilacaceae, Flagellariaceae, Euphorbiaceae, Piperaceae, Verbenaceae, Bignoniaceae, Loganiaceae, Acanthaceae, Verbenaceae, Convolvulaceae 7 XIX, XX Euphorbiaceae, Lauraceae,
Bombacaceae, Malvaceae
Tabel 1. Keragaman tanaman koleksi di lokasi pengambilan sampel KRB
suhu 30 oC selama 3-7 hari (Ranimol et al. 2018).
Setelah masa inkubasi dapat terbentuk endapan berwarna coklat kemerahan di sekitar zona koloni sebagai indikasi penghasil enzim ekstraseluler phenol oksidase (laccase). Tiga strain potensial dengan aktivitas phenol oksidase tertinggi dipilih sebagai kandidat unggulan sebagai agen dekom- poser berdasarkan pengujian laju tumbuh dan perubahan warna pada kultur fungi. Untuk menyeleksi berdasar laju pertumbuhan dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat dalam media PDA kemudian diukur setiap hari diameter pertumbuhan miseliumnya dan pigmentasi warna yang muncul di sekitar koloni (Ranimol et al.
2018).
Penentuan aktivitas enzim laccase (EC 1.10.3.2; Lac) mengacu pada metode Ranimol et al. (2018) menggunakan guaiacol sebagai substrat.
Campuran reaksi terdiri dari 300 µl larutan penyangga asetat, 100 µl guaiacol, dan 100 µl ekstrak enzim kasar (supernatan fungi). Larutan blanko diisi 100 µl aquades sebagai pengganti enzim dan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 15 menit, kemudian dibaca nilai absorbansinya pada panjang gelombang (λ) 450 nm menggunakan UV -vis spectrophotometer. Aktivitas laccase dihitung menggunakan koefisien absorptivitas molar 12.1 x 103 L mol-1 cm-1.
Aktivitas Mangan peroksidse (EC 1.11.1.13;
MnP) diuji berdasarkan metode Chauhan (2019) dimodifikasi menggunakan mangan sulfat (MnSO4) sebagai substrat. Pengujian enzim dikerjakan dalam campuran reaksi yang mengandung 300 µl larutan penyangga aquades ( pH- 4,5), 300 µl guaiacol (4 mM), 600 µl MnSO4 (1 m M), 300 ekstrak enzim kasar, 1200 µl air bebas ion. Larutan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 2 menit dan direaksikan dengan penambahan 300 µl hidrogen peroksida (H2O2, 1m M). Nilai absorbansi larutan dibaca dengan λ 465 nm pada UV Vis Spectrofotometer 1800.
Aktivitas Lignin peroksidase (EC 1.11.1.14:
LiP) diuji berdasarkan metode Chauhan (2019) menggunakan veratril alkohol sebagai substrat.
Pengujian enzim dikerjakan dalam campuran reaksi yang mengandung 600 µl larutan penyangga sitrat (0.3 M, pH-4.5), 300 µl veratril alkohol (8 mM), 1890 µl air bebas ion dan 60 µl ekstrak enzim kasar. Larutan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 2 menit dan direaksikan dengan penambahan
150 µl hidrogen peroksida (H2O2, 5 mM). Nilai absorbansi larutan dibaca pada λ 310 nm. Satu unit aktivitas lakase, MnP, dan LiP didefinisikan sebagai jumlah enzim yang ditransformasikan 1 µmol substrate per menit.
Proses ekstraksi DNA fungi dilakukan meng- gunakan ZYMO RESEARCH Quick-DNA Fungal/
Bacterial Kit sesuai petunjuk produsen. Amplifikasi DNA fungi dilakukan pada mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) TaKara PCR Thermal Cycler.
Teknik PCR digunakan untuk amplifikasi target DNA fungi yaitu daerah Inter Transcribed Spacer yang sering digunakan sebagai marker untuk identifikasi fungi. Ekstraksi genom DNA fungi diamplifikasi menggunakan primer universal ITS1 dan ITS4. Primer ITS1 (5’-TCT GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) dan ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) (White et al. 1990). DNA hasil amplifikasi dikirimkan ke perusahaan jasa sekuensing untuk dianalisis urutan basa DNA dari isolat target. Hasil sekuen DNA yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan sekuen pada GenBank database menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BlastN) yang tersedia pada pangkalan data NCBI (National Center for Biotechnology Information).
HASIL
Isolasi dan seleksi fungi dekomposer
Berdasarkan hasil perhitungan total populasi fungi di setiap vak koleksi terdapat perbedaaan jumlah populasi. Pada lokasi sampel blok 1 sampai blok 7 secara berurutan masing-masing memiliki kelimpahan populasi fungi sebesar 5.4 x 106 CFU ml-1, 6,1 x 106 CFU ml-1, 3,8 x 106 CFU ml-1, 9,9 x 106 CFU ml-1, 2,4 x 106 CFU ml-1, 1,9 x 106 CFU ml-1, dan 2,4 x 106 CFU ml-1. Kelimpahan populasi fungi di lokasi pengambilan sampel Kebun Raya Bogor berkaitan erat dengan komposisi koleksi tumbuhan yang ada di masing-masing lokasi sampel. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa lokasi sampel blok 4 memiliki kelimpahan populasi fungi tertinggi dibandingkan lokasi sampel lainnya di Kebun Raya Bogor (Gambar 1).
Pengukuran aktivitas enzimatik menunjukkan bahwa terdapat 13 isolat yang memiliki aktivitas enzim ekstraseluler antara lain KRB 1.4, KRB 1.5, KRB 2.2, KRB 3.1, KRB 3.2, KRB 3.8, KRB 4.2, KRB 4.6, KRB 5.4, KRB 5.6, KRB 6.2,
KRB 6.7, dan KRB 7.3. Selanjutnya isolat fungi dengan laju pertumbuhan dan perubahan warna tertinggi dipilih sebagai kandidat dekomposer.
Hasil pengujian menunjukkan adanya variasi laju
pertumbuhan dan perubahan warna di sekitar koloni pada masa inkubasi 7 hari (Gambar 2).
Aktivitas enzim ekstraseluler isolat dekomposer Berdasarkan hasil pengujian isolat KRB 3.1, KRB 4.6, dan KRB 6.7 memiliki nilai aktivitas enzim yang berbeda-beda selama 0-8 hari masa inkubasi. Pleurotus ostreatus (PO) digunakan sebagai isolat pembanding dalam pengujian aktivitas enzim. Berdasarkan laju aktivitas enzim Lac, MnP, dan LiP pada Gambar 3 menunjukkan nilai maksimum yang dicapai oleh isolat KRB 3.1, KRB 4.6, dan KRB 6.7 lebih tinggi dibandingkan isolat Pleuorotus ostreatus selama masa inkubasi.
5.4 6.1 3.8
9.9
2.4 1.9 2.4
0.00 5.00 10.00 15.00
1 2 3 4 5 6 7
Total populasi fungi (x106CFU/ml)
Blok lokasi sampel
Gambar 1. Total populasi fungi dari setiap blok berdasarkan pengelompokan koleksi tumbuhan di kawasan Kebun Raya Bogor.
Gambar 2. Laju pertumbuhan (A) dan aktivitas (B) isolat fungi dekomposer
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
KRB 1.4 KRB 1.5 KRB 2.2 KRB 3.1 KRB 3.7 KRB 3.8 KRB 4.2 KRB 4.6 KRB 5.4 KRB 5.6 KRB 6.2 KRB 6.7 KRB 7.3
Pertumbuhan (Growth, cm)
Isolat
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
KRB 1.4 KRB 1.5 KRB 2.2 KRB 3.1 KRB 3.7 KRB 3.8 KRB 4.2 KRB 4.6 KRB 5.4 KRB 5.6 KRB 6.2 KRB 6.7 KRB 7.3
Perubahan warna (Decolorization, cm)
Isolat
a b
0 200 400 600 800
0 2 4 6 8
LiP activity (U ml-1)
Time (day) c
0 50 100 150 200 250
0 2 4 6 8
MnP activity (U ml-1)
Time (day) b
0 5 10 15 20 25 30
0 2 4 6 8
Laccase activity (U ml-1)…
Time (day) a
Keterangan:
Gambar 3. Aktivitas enzim ekstraseluler pada ke tiga kandidat isolat dekomposer dan Pleuorotus ostreatus (PO) dengan masa inkubasi 0-8 hari
Analisis molekuler kandidat terbaik fungi penghasil enzim ekstraseluler
Hasil analisis molekuler menunjukkan bahwa ukuran pita DNA dari 3 isolat fungi KRB 3.1, KRB 4.6, dan KRB 6.7 antara 600-700 bp dan teramplifikasi dengan baik. Hasil perunutan DNA dari masing-masing isolat tersebut dapat dijadikan dasar untuk analisis lebih lanjut. Berdasarkan hasil perunutan sekuen DNA pada masing-masing isolat menunjukkan urutan yang berbeda. Susunan DNA pada strain KRB 3.1 memiliki kemiripan dengan Coriolopsis hainanensis sebagai spesies terdekat.
Isolat pada strain KRB 4.6 diketahui memiliki kemiripan terdekat dengan Polyporus thailandensis.
Isolat dengan nomor strain KRB 6.7 memiliki kekerabatan dekat dengan Cerrena aurantiopora.
Secara lengkap hasil BLAST berdasarkan urutan fragmen DNA dari ke tiga sampel KRB 3.1, KRB 4.6, dan KRB 6.7 tersaji pada Tabel 3.
PEMBAHASAN
Isolasi dan seleksi fungi dekomposer
Total fungi yang berhasil diperoleh dari hasil eksplorasi berdasar visual koloni yang berbeda dari masing-masing blok berjumlah 42 isolat. Total dari 42 fungi yang berhasil diisolasi terdapat 13 strain yang mampu menunjukkan aktivitas enzim ekstraseluler secara kulitatif dengan indikasi perubahan warna di sekitar zona koloni (Ranimol et al. 2018) (Gambar 4).
Reaksi perubahan warna pada media dengan substrat guaiacol terjadi akibat proses oksidasi dan adanya reaksi pemecahan ikatan kuinon oleh enzim ekstraseluler (Efiyanti dan Hidayat, 2017). Isolat yang diperoleh berasal dari 7 titik lokasi pengambilan sampel di kawasan KRB.
Diantara isolat ini kemudian diseleksi lebih lanjut melalui pengujian laju pertumbuhan biomasa dan tingkat perubahan warna sebagai dasar dalam penentuan tiga kandidat isolat terbaik secara kualitatif.
Blok 4 memiliki kelimpahan fungi tertingi 9.9x106 CFU ml-1 dibandingkan blok lainnya.
Kepadatan dan keaneragaman koleksi tumbuhan di blok 4 cukup tinggi. Koleksi tumbuhan di dalam blok empat umumnya terdiri dari family Myrtaceae, Lecythidaceae, Clusiaceae, dan Dipterocarpaceae.
Tanaman koleksi yang tumbuh didominasi oleh tanaman jambu-jambuan, manggis, dan tanaman kayu dari famili Dipeterocarpaceae. Kondisi limbah serasah daun di blok ini cukup tinggi sehingga menjadi faktor utama tingginya kelimpahan fungi yang tumbuh. Selain itu blok 4 sebagai lokasi sampel jarang diakses oleh pengunjung sehingga kondisi tempatnya relatif tidak sering terganggu.
Pengujian kuantitatif berdasarkan laju pertumbuhan miselia menunjukkan bahwa isolat KRB 6.7 memiliki pertumbuhan tertinggi (8,40
±1,66 cm), diikuti oleh KRB 3.7 (7,80±1,28 cm), KRB 5.6 (7,30±0,23 cm), KRB 7.3 (7,10±0,58 cm) KRB 2.2 (6,80±0,48 cm), dan KRB 4.2 (6,70±0,58 cm). Isolat-isolat tersebut memiliki laju pertumbuhan rata-rata cukup tinggi akan tetapi hanya satu isolat yang terpilih yaitu KRB 6.7 karena yang lainnya memiliki kesamaan penampakan koloni secara makroskopis. Isolat KRB 3.1 dan KRB 4.6 memiliki perbedaan secara morfologi dengan KRB 6.7 sehingga ketiga isolat ini dipilih sebagai kandidat dekomposer. Isolat
Tabel 2. Hasil BLAST urutan fragmen DNA tiga isolat
Gambar 4. Bentuk koloni fungi penghasil enzim ekstraseluler (A) KRB 3.1/H-6; (B) KRB 4.6/
H-6; (C) KRB 6.7/H-6 tampak dari bawah (I) dan dari atas (II)
Sampel No. Asesi. Deskripsi Nilai
maksimum
Nilai Total Cakupan Nilai E Maksimum identikasi
KRB 3.1 NR169651.1 Coriolopsis hainanensis 1011 1011 91% 00.00 99,46%
KRB 4.6 NR155033.1 Polyporus thailandensis 682 682 85% 00.00 92,40%
KRB 6.7 NR158290.1 Cerrena aurantiopora 702 702 98% 00.00 90,00%
Berdasarkan hasil seleksi secara kualitatif menunjukkan bahwa strain terpilih KRB 3.1, KRB 4.6, dan KRB 6.7 berpotensi menghasilkan enzim lakase, MnP dan LiP (Gambar 5). Hattaka (1994) melaporkan bahwa hampir semua fungi pelapuk putih menghasilkan enzim Lac dan MnP tetapi hanya beberapa fungi yang menghasilkan enzim LiP. Hasil analisis secara in vitro menunjukkan bahwa kemampuan aktivitas enzimatik baik Lac, MnP, dan LiP memiliki kapabilitas yang berbeda- beda pada setiap individu KRB 3.1, KRB 4.6, dan KRB 6. Produktivitas enzim ekstraseluler masing- masing strain bervariasi karena tergantung pada perbedaan variasi genetik dan substrat alami (Rajwar et al. 2016).
Aktivitas enzim ekstraseluler telah dikuanti- fikasi pada pengujian kultur cair dari tiga isolat terpilih berdasarkan evaluasi laju pertumbuhan miselium dan perubahan warna. Seluruh pengujian aktivitas enzim dilakukan dalam kultur tunggal pada suhu 28 0C selama 8 hari inkubasi. Aktivitas enzim Lac, MnP, dan LiP tertinggi yang dihasilkan oleh strain KRB 3.1 masing-masing yaitu 7,48 U ml-1 dalam 2 hari inkubasi, 23,42 U ml-1 dalam 2 hari inkubasi, dan 598.57 U ml-1 dalam 4 hari inkubasi. Level tertinggi aktivitas enzim Lac, MnP, dan LiP pada strain KRB 4,6 masing-masing yaitu 8,12 U ml-1 setelah 6 hari inkubasi, 67,77 U ml-1 setelah 8 hari inkubasi, dan 516,13 U ml-1 setelah 4 hari inkubasi. Level KRB 3.1, KRB 4.6, dan KRB 6.7 dipilih ber-
dasarkan adanya perubahan warna coklat kemerahan di sekitar koloni dengan luas masing- masing yaitu 4,78±0,63 cm, 5,53±0,14 cm, dan 6,12±0,53 cm. Isolat KRB 6.7 memiliki laju perubahan warna tertinggi dibandingkan isolat KRB 3.1 dan KRB. 4.6. Menurut Efiyanti dan Hidayat (2017) menyatakan bahwa perubahan warna pada media padat umumnya berkorelasi dengan laju aktivitas enzim yang dihasilkan.
Aktivitas enzim ekstraseluler
Kandidat strain terpilih sebanyak 3 strain fungi mampu menunjukkan perubahan warna optimal pada kultur padat PDA yang mengandung substrat guaiacol. Guaiacol merupakan senyawa phenolik sintetis yang umum digunakan untuk analisis produksi enzime lakase dengan indikator terbentuknya zona berwarna merah kecoklatan di sekitar koloni (Hadibarata et al. 2020). Lakase merupakan jenis enzim yang memiliki peran penting dalam proses degradasi bahan yang mengandung lignin (Mulyawan et al. 2019).
Semakin tinggi proporsi lignin dalam bahan organik maka semakin tinggi pula resisten terhadap degradasi kimia dan ensimatik. Peran enzim ekstraseluler berupa lakase, mangan peroksidase, dan lignin peroksidase sangat penting dalam mendegradasi senyawa lignin (Saskiawan et al. 2021).
Gambar 5. Hubungan filogenetik dari fungi penghasil enzim ekstraseluler phenol oksidase dan peroksidase berdasarkan sekuen pada region ITS1 dan ITS4.
tertinggi aktivitas enzim Lac, MnP, dan LiP pada strain KRB 6.7 masing-masing yaitu 24,10 U ml-1 dalam 2 hari inkubasi, 186,36 U ml-1 dalam 2 hari inkubasi, dan 485.,6 U ml-1 dalam 6 hari inkubasi.
Hasil ini sesuai dengan pengamatan yang dilakukan oleh Xavier et al. (2007) yang melapor- kan bahwa inisiasi aktivitas enzim ekstraseluler maksimum dimulai dari 2 sampai 4 hari masa inkubasi, dan tidak melewati fase pertumbuhan eksponensial. P. ostreatus (PO) dipilih sebagai strain pembanding dengan nilai maksimum aktivitas enzim Lac, MnP, dan LiP masing-masing adalah 1,61 U ml-1 dalam 2 hari inkubasi, 18,46 U ml-1 dalam 4 hari masa inkubasi, 360,22 U ml-1 dalam dalam 4 hari masa inkubasi (Gambar 3).
Strategi yang terbaik untuk mendapatkan fungi dengan produktivitas enzim tinggi dan stabil adalah dengan mengkultur fungi dalam bentuk konsorsium lebih dari satu atau dua spesies (Rodrigues et al. 2020).
Analisis molekuler kandidat terbaik fungi penghasil enzim ekstraseluler
Ekstrak DNA hasil proses amplifikasi daerah ITS bahwa isolat KRB 3.1, KRB 4.6, dan KRB 6.7 memiliki ukuran 500-560 bp. Berdasarkan hasil konstruksi pohon filogenetik menggunakan metode neighbor-joining tree (NJ) dan analisis bootstrap sebanyak 1000 ulangan. Spesies Mixia osmundae (NR 119614.1) dipilih sebagai outgroup. Pohon filogenetik bahwa sampel KRB 3.1 berada dalam satu cabang dengan sekuen pembanding Coriolopsis hainanensis (NR169651.1) dengan nilai bootstrap 97%. Sampel KRB 4.6 memiliki kekerbatan terdekat atau satu cabang dengan Polyporus thailandensis (NR155033.1) dengan nilai bootstrap 89%. Sampel KRB 6.7 berada dalam satu cabang dengan sekuen pembanding Cerrena aurantiopora (NR158290.1) dengan nilai bootstrap 99%. Hasil analisis filogenetik berdasarkan gen ITS bahwa 3 isolat bioaktivator merupa-kan jenis spesies yang berbeda satu sama lain.
Hasil tersebut menunjukkan bahwa habitat KRB dengan sumber serasah dari berbagi jenis pohon koleksinya merupakan ekosistem yang tepat untuk ditumbuhi jamur-jamur penghasil enzim perombak lignin. Laporan kemampuan dari ketiga jenis fungi yang sama dari habitat yang berbeda yang mampu menghasilkan aktivitas
enzim Lac, MnP, dan LiP telah dilaporkan sebelumnya oleh Yang et al. (2014) bahwa kelompok Cerrena sp. merupakan fungi yang pada umumnya memiliki aktivitas enzim Lac yang tinggi sehingga sering dipakai untuk produksi enzim Lac dalam jumlah besar.
Kelompok dari genus Polyporus sp. juga pernah dilaporkan oleh Temp et al. (1999) bahwa hasil pengujian aktivitas enzim isolat Polyporus ciliates mampu menghasilkan enzim Lac dan MnP di dalam media yang ditambahkan asam humat dari batu bara. Sedangkan dari genus Coriolopsis sp.
juga sudah diketahui mampu menghasilkan enzim Lac seperti Coriolopsis gallica yang memiliki aktivitas enzim Lac tinggi pada level 83,07 U ml-1 dan 96,66 U ml-1 pada media yang diperkaya gliserol dan amonium dihidrogen sebagai sumber karbon dan nitrogen (Xu et al. 2016). Ke tiga isolat tersebut berpotensi untuk dimanfaatkan terutama sebagai agen dekomposer dalam kegitan fermentasi limbah organik serasah daun di Kebun Raya Bogor. Bagaimanapun, hasil dari penelitian ini merupakan informasi baru bahwa di KRB yang merupakan koleksi berbagai tumbuhan eksitu dari lingkungan tropis di Indonesia menyimpan juga kekayaan jamur-jamur penghasil enzim perombak lignin, yang tidak hanya berperan penting dalam dekomposisi seresah sebagai rangkain penting siklus nutrisi, tetapi juga berpotensi untuk keperluan penting industri lainnya.
KESIMPULAN
Koleksi tumbuhan eksitu KRB berpotensi mendukung tumbuhnya mikroba berupa fungi dekomposer pada lapisan permukaan tanah, dan keberadaan fungi memiliki peran penting dalam proses dekomposisi limbah organik di KRB. Tiga isolat fungi sebagai unggul yang berhasil diidentifikasi dari kawasan KRB diantaranya Coriolopsis hainanensis, Polyporus thailandensis, dan Cerrena aurantiopora. Isolat Cerrena aurantio-pora memiliki aktivitas enzim Lac dan MnP tertinggi yaitu masing-masing 24,10 U ml-1 dan 186,36 U ml-1, sedangkan isolat Coriolopsis hainanensis memiliki aktivitas LiP tertinggi yaitu 598,57 U ml-1. Isolat tersebut berpotensi sebagai unggul dalam proses fermentasi limbah organik padat.
tb00039.x.
Janusz, G., A. Pawlik, J. Sulej, U. Swiderska- Burek, A. Jsrosz-Wilkolazka & A.
Paszczynski. 2017. Lignin degradation:
microorganisms, enzymes involved, geno- mes analysis and evolution. FEMS Micro- biology Reviews. 41(6):941-962. https://
doi.org/10.1093/femsre/fux049.
Kebun Raya Bogor. 2018. Laporan Rencana Kegiatan Tahunan Unit Kebersihan Koleksi. [Laporan Tahunan]. Bogor : Kebun Raya Bogor - LIPI
Khatami, S., Y. Deng, M. Tien & PG. Hatcher.
2019. Lignin contribution to aliphatic constituents of humic acids through fungal degradation. Journal Environmental Quality. 48(6):1565-150. https://doi.org/
10.2134/jeq2019.01.0034.
Kowalczyk, JE., M. Peng, M. Pawlowski, A.
Lipzen, V. Ng, VR. Singan, M. Wang, IV.
Grigoriev & MR. Makela. 2019. The white -rot Basidiomycete Dichomitus squalens show highly specific transcriptional response to lignocellulose-related aromatic compounds. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 229(7): 1-12. https://
doi.org/10.3389/fbioe.2019.00229.
Mulyawan, R., LT. Indriyati, H. Widiastuti & S.
Sabiham. 2019. Uji aktivitas lakase dan selulase pada lignoselulosa gambut dengan berbagai kadar air. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia. 24(1):20-27. https://doi.org/
10.18343/jipi.24.1.20.
Rajwar, D., S. Joshi & JPN. Rai. 2016.
Ligninolytic enzymes production and decolorization potential of native fungi isolated from pulp and paper mill sludge.
Nature Environment and Pollution Technology. 15(4):1241-1248.
Ranimol, G., T. Venugopal, S. Gopalakrishnan &
S. Sunkar. 2018. Production of laccase from Trichoderma harzianum and its application in dye decolourisation.
Biocatalysis Agricultural Biotechnology.
16:400-404. https://doi.org/10.10.16/j.bcab.
2018.09.003.
Saskiawan, I., N. Widhyastuti, Kasirah & D.
Sutardi. 2021. Pola aktivitas enzim lakase, selulase, dan xilanase pada masa pertumbuhan budidaya jamur tiram putih UCAPAN TERIMAKSIH
Penelitian ini didanai RISPRO MANDATORI PRN-LPDP Tahun 2020 dan Riki Ruhimat merupakan penerima beasiswa by research LIPI.
Kepada Sdr Achirul Ndhitasari M.Sc, BRIN, terima kasih atas bantuannya dalam analisis molekuler.
DAFTAR PUSTAKA
Baruah, J., BK. Nath, R. Sharma, S. Kumar, RC.
Deka, DC. Baruah, & E. Kalita. 2018.
Recent trends in the pretreatmen of lignocellulosic biomass for value-added products. Frontiers in Energy Research. 6 (141):1-19. doi:10.3389/fenrg.2018.00141.
Chauhan, R. 2019. Nitrogen sources and trace elements influence Laccase and peroxidase enzymes activity of Grammothele fuligo.
Vegetos. 32:316-323. https://doi.org/
10.1007/s42535-019-00049-w.
Dashtban, M., H. Schraft, TA. Syed & W. Qin.
2010. Review article: fungal biodegra- dation and enzymatic modification of lignin. International Journal of Bioche- mistry and Molecular Biology. (1)1: 36-50.
Efiyanti, L. & A. Hidayat. 2017. Seleksi jamur pelapuk putih hutan tropis Indonesia sebagai penghasil ezim lakase (Lac) dan mangan peroksidase (MnP). Jurnal Penelitian Hasil Hutan. 35(3):185-195.
https://doi.org/10.20886/jphh.
Gerke, J. 2018. Concept and misconception of humic substances as the stable part of soil organic matter: a review. Agronomy. 76 (8):1-16. https://doi.org/10.3390/agronomy 8050076.
Hadibrata, T. & A. Yuniarto. 2020.
Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by high-laccase basidio- mycetes fungi isolated from tropical forest of Borneo. Biocatalysis Agricultural Biotechnology. 28:101717. doi:10.1016/
j.bcab.2020. 101717.
Hatakka, A. 1994. Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi: production and role in lignin degradation. FEMS Microbiology Reviews. 13:125-135. https://
doi.org/10.1111/j.1574-6976.1994.
[Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.].
Jurnal Biologi Indonesia 17(2):145-151.
https://doi.org/10.47349/jbi/17022021/145.
Senthivelan, T., J. Kanagaraj, RC. Panda & T.
Narayani. 2019. Screening and production of a potential extracellular fungal laccase from Penicillium chrysogenum: Media optimization by response surface methodology (RSM) and central composite rotatable design (CCRD). Biotechnology Reports (Amst). 23:e00344. https://doi.
org/10.1016/j.btre.2019.e00344.
Sukmawati. 2018. Isolasi bakteri selulolitik dari limbah kulit pisang. Biotropic 2(1):46-52.
Tan, KH. 2014. Humic Matter in Soil and the Environment, Principles and Controversies.
Second Edition. CRC Press. New York (USA).
Temp, U., H. Meyrahn & C. Eggert. 1999.
Extracellular phenol oxidase patterns during depolymerization of low-rank coal by three basidiomycetes. Biotechnology Letters. 21(4):281–287. https://doi. org/
10.1023/A:1005491818192.
White, TJ., TD. Bruns, SB. Lee & JW. Taylor.
1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA Genes for
phylogenetics. Dalam: Innis, M.A., Gelfand, D.G., J.J. Sninsky & Thomas W.
(eds.). PCR - Protocol and Aplication - A Laboratory Manual. Academic Press., London (UK). 315-322. https://doi.
org/10.1016/B978-0-12-372180-8.50042- 1.
Xavier, AMRB., APM Tavares, R. Ferreira & F.
Amado. 2007. Trametes versicolor growth and laccase induction with by-products of pulp and paper industry. Electronic Journal of Biotechnology 10(3):444-451.
https://doi.10.2225/vol10-issue3-fulltext-1.
Xu, X., L. Feng, Z. Han, S. Luo, A. Wu & J. Xie.
2016. Selection of high laccase-producing Coriolopsis gallica strain T906: mutation breeding, strain characterization, and the features of extracellular laccases. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (9):1570–1578. http://doi.org/10.4014/jmb.
1604.04011.
Yang, J., Q. Lin, T. Ng, X. Ye & J. Lin. 2010.
Purification and Characterization of a Novel Laccase from Cerrena sp. HYB07 with Dye Decolorizing Ability. PLoS ONE. 9(10): e110834. http://doi.org/
10.1371/journal.pone.0110834.
