BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini menggunakan jenis eksperimental. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi dan pengujian antifungi menggunakan metode difusi cakram yang dilakukan secara in vitro. Tahapan penelitian:
1. Preparasi Bahan
2. Penarikan komponen senyawa/ekstraksi
3. Pemisahan komponen senyawa dengan metode KLT 4. Pengujian antifungi dengan metode difusi cakram 4.2 Bahan Penelitian
Dalam penelitian ini menggunakan serbuk herba daun sendok (Plantago major L.) yang sudah dideterminasi oleh UPT Materia Medika Batu. Mikroba uji yang digunakan pada penelitian ini yaitu Candida albicans yang diperoleh dari Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.
4.3 Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Sintesis dan Laboratorium Biomedik Program Studi Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Malang.
4.4 Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan September 2019 – Februari 2020.
4.5 Instrumen Penelitian
Adapun nama-nama alat dan bahan yang akan digunakan pada penelitian ini adalah:
4.5.1 Alat
1. Timbangan Analitik (Fujitsu) 2. Gelas Ukur (Pyrex)
3. Cawan Porselen 4. Toples kaca
5. Penyaring Buchner 6. Batang Pengaduk
7. Alat Moisture Analyzer ( Mettler Toledo) 8. Rotary evaporator vacuum
9. Chamber (Camag) 10. Pinset
11. Lampu detector UV (Vilber Lourmat) 12. Kertas Saring
13. Vortex ( Heildolph) 14. Pipet Volume
15. Lemari pendingin (Samsung) 16. Penjepit
17. Plat KLT (Merck)
18. Pipa Kapiler (Blaubrand) 19. Inkubator (Memmert)
20. Autoclave (Hirayama Autoclave HVE-50) 21. Mikro pipet (Gilson)
22. Oven (Binder ED 56) 23. Hot Plate (Heidolph) 24. Cutton bad
25. Bunsen
26. Laminar Air Flow (Thermo Fisher Scientific) 27. Cawan Petri (Labware)
28. Eppendrof ( One med) 29. Tabung reaksi (Pyrex) 30. Corong kaca (Pyrex)
31. Kertas cakram (Macherey Nagel) 4.5.2 Bahan
1. Serbuk herba daun sendok (Plantago major L.) 2. Etanol 70%
3. SD Agar
4. Sabouraund Dextrose Broth (SDB) 5. Etil Asetat ( Bratachem)
6. n-Heksan ( Bratachem) 7. Aquadest steril
8. Pereaksi Dragendorff (Merck) 9. Asam sulat 10% (Merck) 10. Pereaksi FeCl3 1% (Merck)
11. Pereaksi anisaldehid - asam sulfat (Merck) 12. Kalium hidroksida 10% dalam etanol (Merck) 4.6 Variabel Penelitian
4.6.1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak etanol daun sendok (Plantago major L.) dengan konsentrasi 80 mg/ml, 120 mg/ml dan 160 mg/ml pada Candida albicans (Widayat, 2016).
4.6.2 Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah diameter zona hambat yang dihasilkan oleh senyawa uji yang ditandai dengan adanya daerah bening disekitar senyawa uji.
4.7 Metode Penelitian 4.7.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimental yang bertujuan untuk mengetahui aktivitas antifungi untuk zona hambat Candida albicans dari pelarut etanol daun sendok (Plantago major L.) secara in vitro dengan metode difusi cakram. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yakni kelompok uji dan kelompok control. Dalam penelitian ini dilakukan beberapa tahapan yaitu:
1. Preparasi Bahan
2. Penarikan komponen senyawa/ekstraksi
3. Pemisahan komponen senyawa dengan metode KLT 4. Pengujian antifungi dengan metode difusi cakram.
4.7.2 Kerangka Operasional
4.8 Prosedur Penelitian
4.8.1 Penyiapan Sterilisasi Alat
Setiap alat yang akan digunakan pada penelitian ini dilakukan proses sterilisasi agar dapat meminimalisir terjadinya kontaminasi. Alat yang disterilkan yaitu kawat ose, spatel, pinset, batang pengaduk dilakukan dengan metode sterilisasi kering dengan menggunakan api langsung. Selain menggunakan api langsung ada beberapa alat yang disterilkan menggunakan metode sterilisasi kering (oven) dengan suhu 160oC selama 1-2 jam yaitu pipet tetes, tabung reaksi dan cawan.
4.8.2 Tahap persiapan bahan
Serbuk herba kering dilakukan determinasi di UPT Materia Medika untuk mengetahui bahwa herba yang kami peroleh valid. Kemudian dilakukan pengujian kadar air menggunakan alat MC untuk mengetahui jumlah air yang terdapat dalam
Pembuatan ektstrak herba Plantago major L.
Sterilisasi alat
Identifikasi senyawa dengan KLT
Preparasi Media Agar Preparasi Candida albicans
Pengujian difusi cakram
Kelompok Uji Ekstrak Etanol Herba Plantago major L. dengan konsentrasi 80mg/ml, 120mg/ml dan 160mg/ml
Kontrol Negatif (DMSO 1% + aquadest steril) Kontrol Positif
(Nystatin 50 μg/disk)
Analisis Data
Gambar 4. 1 Kerangka Operasional Kerangka Operasional
herba Plantago major L. Untuk MC ditimbang serbuk sebanyak 3 g dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
4.8.3 Pembuatan ekstrak herba Plantago major L.
Pada penelitian ini proses ekstraksi yang dilakukan yaitu dengan metode maserasi perendaman 3x24 jam menggunakan serbuk herba Plantago major L.
sebanyak 1,5 kilogram yang diekstraksi dengan pelarut etanol 70%.
1) Serbuk herba Plantago major L. ditambahkan dengan pelarut etanol 70%
sebanyak 15000 ml (perbandingan 1:10), direndam selama 24 jam, kemudian disaring dengan corong buchner dan ditampung filtratnya. (Filtrat 1 dan residu 1),
2) Residu 1 dimaserasi kembali dengan etanol 70% sebanyak 7500 ml (perbandingan 1:5), direndam selama 24 jam, kemudian disaring dengan corong buchner dan ditampung filtratnya (filtrat 2 dan residu 2),
3) Residu 2 dimaserasi kembali dengan etanol 70% sebanyak 7500ml (perbandingan 1:5), direndam selama 24 jam, kemudian disaring dengan corong buchner dan ditampung filtratnya (filtrat 3),
4) Filtrat 1, 2, dan 3 dicampur lalu dilakukan pemisahan menggunakan rotary evaporator vacum dengan suhu 45o C sampai diperoleh pemisahan antara pelarut dengan ekstrak,
5) Ekstrak dipindahkan ke dalam cawan lalu dipekatkan dengan waterbath pada suhu 45o C dan oven pada suhu 45o C hingga didapatkan ekstrak kental,
6) Ekstrak dilakukan tes pada KLT dengan bantuan sinar UV untuk melihat ada atau tidaknya noda yang terbentuk.
Dimaserasi kembali dengan pelarut etanol 70% sebanyak 7,5 L (perbandingan 1 : 5)
Direndam selama 24 jam, lalu disaring dengan corong buchner. Filtrat di tampung (Residu 2).
Ditambahkan pelarut etanol 70% 15 L ( Perbandingan 1 : 10 ). Direndam selama 24 jam, lalu disaring dengan corong buchner. Filtrat di tampung
(Residu 1).
4.8.4 Pemisahan Senyawa dengan Plat KLT
Pemisahan yang dilakukan dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ini menggunakan fase diam silica gel TLC 60 F254 dan dengan menggunakan eluen:
1. n-heksan : etil asetat (8:2) 2. n-heksan : etil asetat (2:5) 3. n-heksan : etil asetat (2:8) 4. n-heksan : etil asetat (7:3) 5. n-heksan : etil asetat (6:4)
Dimaserasi kembali dengan pelarut etanol 70% 7,5 L ( perbandingan 1 : 5). Direndam selama 24 jam, lalu disaring dengan corong buchner. Filtrat
di tampung (Residu 3).
Dilakukan pemisahan dengan rotary evaporator vacum dengan suhu 45oC sampai pelarut dan ekstrak terpisah. Ekstrak di letakkan pada cawan.
Ekstrak dipekatkan dengan oven pada suhu 40oC dan waterbath pada suhu 40oC hingga didapatkan ekstrak kental.
Ditimbang serbuk herba Plantago major L. sebanyak 1,5 kg. Di masukkan ke dalam toples.
Dilakukan tes pada KLT untuk melihat ada atau tidaknya noda yang terbentuk..
Filtrat 1, 2, dan 3 dicampur menjadi satu.
Gambar 4. 2Bagan Alir Proses Ekstraksi
4.8.5 Identifikasi Senyawa
Senyawa yang sudah di pisahkan dengan menggunakan metode KLT selanjutnya dilakukan identifikasi terhadap senyawa metabolit yang terkandung di dalam ekstrak Plantago major L. dengan penampak noda sebagai berikut :
Alkaloid : Warna noda coklat atau jingga setelah penyemprotan dengan pereaksi Dragendorf.
Flavonoid : Warna noda kuning atau kuning kecoklatan setelah diberi uap ammonia atau asam sulat 10%.
Polifenol : Warna noda hitam setelah penyemprotan dengan pereaksi FeCl3 1%.
Terpenoid / Steroid
: Warna noda ungu atau ungu-merah setelah penyemprotan dengan pereaksi anisaldehid-asam sulfat dan panaskan lempeng pada suhu 100°C selama 5-10 menit.
Antrakuinon : Warna noda jingga atau merah setelah penyemprotan kalium hidroksida 10% dalam etanol. (Wagner and Bladt, 1996)
4.8.6 Pembuatan Konsetrasi Larutan Uji
Ekstrak etanol daun sendok ditimbang 80 mg, 120 mg, dan 160 mg kemudian ditambahkan DMSO 1 % dengan melarutkan 0,01 ml DMSO dalam aquadest steril sampai 1 ml sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji ekstrak adalah 80 mg/ml; 120 mg/ml; 160 mg/ml.
4.8.7 Pembuatan Media
Pada penelitian ini digunakan dua media yakni Sabouraud Dextrose Agar (SDA) dan juga Sabouraud Dextrose Broth (SDB) untuk media pengujian aktivitas anti jamur.
a. Pembuatan Media Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
Pembuatan media Sabouraud Dextrose Agar (SDA) dilakukan dengan langkah- langkah sebagai berikut :
1. Mensuspensikan SDA sebanyak 65 g dalam 1 L aquadest didalam erlenmayer.
2. Dicampur dengan baik sampai didapatkan suspensi yang homogen,lalu direbus selama 1 menit.
3. Setelah itu diletakkan di dalam autoklaf dengan suhu 118-121ºC selama 15 menit, dilakukan secara hati-hati untuk menghindari panas yang berlebih.
4. Disimpan pada suhu 8-15ºC (Pronadisa).
b. Pembuatan Media Sabouraud Dextrose Broth (SDB)
Pembuatan media Sabouraud Dextrose Broth (SDB) dilakukan dengan langkah-langkah sebagai berikut :
1. Mensuspensikan SDB sebanyak 30 g dalam 1 L aquadest didalam erlenmayer.
2. Dicampur dengan baik sampai didapatkan suspensi yang homogen, lalu direbus selama 1 menit.
3. Setelah itu diletakkan di dalam autoklaf dengan suhu 118-121ºC selama 15 menit, dilakukan secara hati-hati untuk menghindari panas yang berlebih, lalu dinginkan.
4. Disimpan pada suhu 8-15ºC (Pronadisa).
4.8.8 Pembuatan Standar Mc Farland
Pembuatan standar Mc Farland 0,5 sebagai berikut, 0,05 ml Barium clorida (BaCl2) 1% dalam aquades lalu tambahkan 9,95 ml Asam sulfat (H2SO4) 1%
kemudian disimpan ditempat yang terhindar dari sinar matahari langsung. Campuran kedua larutan dalam tabung tersebut, kocok sampai homogen dan terbentuk larutan keruh. Larutan ini merupakan standar McFarland 0,5 ekuivalen sebagai suspensi mikroba uji yang konsentrasinya 1,4x106 CFU/ml dan digunakan sebagai pembanding
.
Tabel IV. 1 Tabel Standar Kekeruhan Mc. Farland untuk jamur
(Sumber : Rapid Antifungal Susceptibility Determination for Yeast Isolates by Use of Etest Performed Directly on Blood Samples from Patients with Fungemia, Guina dkk., 2010
4.8.9 Pengujian Antifungi dengan Difusi Cakram
1. Dilakukan peremajaan jamur serta penyiapan media. Di ambil biakan jamur murni pada tabung reaksi dengan cutton bad 3 kali, kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer. Dilakukan inkubasi pada biakan jamur yang ada dalam media SDB dengan suhu 37º C selama 48 jam lalu di kocok menggunakan shaker dengan kecepatan 120 rpm. Setelah 48 jam biakan dari SDB diambil sebanyak 10 ml dan dibandingkan dengan larutan standart Mc Farland 1,4x106CFU/ml. Apabila hasil perbandingannya sama dengan larutan standart Mc Farland 1,4x106CFU/ml, maka dilakukan pengenceran, hal ini dilakukan untuk mendapat konsentrasi biakan 107 CFU/ml yaitu dengan mengambil 1 ml larutan dan di masukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 9 ml NaCl 0,85%. Pengenceran dilakukan kembali sampai di dapatkan konsentrasi yang dikehendaki yaitu 106 CFU/ml. Selanjutnya, media dioleskan biakan bakteri menggunakan kapas lidi steril secara horizontal, putar cawan 180º kemudian diratakan.
2. Dilakukan pengujian Candida albicans dengan metode difusi cakram dilakukan secara aseptis di dalam LAF.
3. Disiapkan larutan uji masing-masing yang telah di masukkan Eppendorf dengan konsentrasi 80 mg/ml (konsentrasi 1), 120 mg/ml (konsentrasi 2), 160 mg/ml (konsentrasi 3), kontrol positif (Nystatin 50 μg/disk) dan control negative (DMSO 1% , aquadest steril).
4. Dipipet 10 μl larutan uji Plantago major L. pada konsentrasi 1, konsentrasi 2, dan konsentrasi 3. Letakkan kertas cakram kosong diatas kaca arloji yang sudah berisi kombinasi larutan uji,kemudian direndam selama 20 menit dengan dilakukan pengulangan sebanyak 6 kali, tiap selesai perendaman (sampai rendaman ke-5) dikeringkan dengan oven selama 5 menit pada suhu 37º C. Setelah perendaman ke- 6 cukup diangin-anginkan di dalam LAF agar kertas cakram tidak terlalu kering.
Untuk kontrol negatif perlakuannya sama dengan larutan uji, hanya saja mengggunakan DMSO 1% serta di oven selama 10 menit pada suhu 37º C.
5. Dilakukan preparasi sebanyak 3 kali.
6. Pada permukaan media Sabouraund Dextrose Broth (SDB) diletakkan kertas cakram yang telah berisi konsentrasi larutan uji. Untuk mendapatkan kontak yang baik antara kertas cakram dan media SDB, tekan lembut kertas cakram pada permukaannya. Atur jarak antara kertas cakram satu dengan yang lain sehingga jaraknya berjauhan.
7. Dilakukan inkubasi selama 48 jam pada suhu 37º C.
8. Dilakukan pengamatan setiap 48 jam untuk melihat diameter zona bening di sekitar kertas cakram. Zona hambat yang muncul diukur menggunakan jangka sorong dengan satuan millimeter (mm) Gholampour-Azizi, et al., (2015)
4.9 Analisis Data
Analisis data yang dilakukan pada penelitian ini yaitu secara deskriptif. Dilakukan skrining fitokimia untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak dan dilakukan pengamatan ukuran pada diameter zona hambat pada daerah yang berwarna bening dari komponen senyawa yang telah dipisahkan pada ekstrak herba daun sendok (Plantago major L.).
Permukaan media telah diisolasi dengan Candida albicans
Diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam
Analisis data Diukur zona hambat
Jarak cakram dengan tepi plate tidak kurang
dari 15 mm dan jarak antar cakram tidan kurang dari 25 mm Keterangan:
1. 1: Konsentrasi ekstrak 80 mg/ml
2. 2: Konsentrasi ekstrak 120 mg/ml
3. 3: Konsentrasi ekstrak 160 mg/ml
4. KP: Kontrol Positif (Nystatin 50 μg/disk) 5. KN: Kontrol Negatif
(DMSO 1% dan Aquadest)
Replikasi sebanyak 3 kali
Gambar 4. 3Pengujian Antifungi dengan Difusi Cakram
KP 3
2 1
KN
