Jurnal llmu Pertanian Indonesia, Agustus 2008, hlm.80-89 ISSN 0853-4217
B A K T E R I PROBIOTIK D A L A M B U D I D A Y A UIIANG:
SELEKSI, MEKANISME AKSI, KARAKTERISASI, D A N APLIKASINYA SEBAGAI
A G E N B I O K O N T R O L
~ i d a n a r n i " ' , Sukenda, Mia Setiawati
ABSTRACT
PROBIOTIC BACTERIA IN SHRIMP CULTURES: ITS SELECTION, MECHANISM OF
ACTION, CHARACTERIZATION, AND APPLICATION AS A BIOCONTROL AGENT
Bacterial disease a t t a c k occurs a t the hatchery stage, which is considered to be the most serious threat, a n d often results in mass mortality of s h r i m p larvae by vibrosis which is t h a t c a u s e d by a luminous bacterium identified a s Vibrio ltarveyi. This research w a s c a r r i e d out to obtain local isolates of probiotic bacteria t h a t w e r e able to inhibit the growth of V. ltarveyi a n d effectively apply it a s a biocontrol of vibriosis in s h r i m p cultures. T h e research was carried out a s follows: (1) I n vitro a n d in vivo selection of probiotic bacteria candidates, (2) S t u d y of the action mechanism a n d characterization of t h e selected probiotic bacteria, (3) S t u d y on application of t h e selected probiotic bacteria a s a biocontrol a g e n t in s h r i m p cultures. Results of irt vitro a n d in vivo selection provided t h e best three isolates, which w e r e IUb, S K T - b a n d Ua. T h e survival r a t e of s h r i m p l a r v a e which w e r e not only inoculated by V.
ltnrvevi but also with l U b , S K T - b a n d Ua probiotic bacteria w e r e 88.33,83.33, a n d 81.67% respectively; whereas t h e positive control treatment (merely inoculated with V . lrnrveyi) gave a 41.67% survival r a t e a n d t h e negative control (without bacterial addition) w a s 68.33%. Studies using a rifampicin resistant m a r k e r ( R f ) demonstrated t h a t t h e n u m b e r of V. Irnrveyi MR5339
RP
cells in treatments without probiotic addition w e r e higher t h a n t h e treatment with the probiotic bacteria, in d e a d larvae, living larvae, a s well a s in t h e c u l t u r e media. Partial sequencing of the 16s-rRNA gene showed t h a t t h e 1 U b isolate w a s similar to Pseurlonlterontonnspiscicirlr~, w h e r e a s t h e S K T - b a n d Ua isolates w e r e similar to Vibrio nlginolyticus. Selected probiotic bacteria could be applied directly to s h r i m p larva culture media, o r orally through e n r i c h m e n t of both n a t u r a l a n d artificial food.Keywords: Perrnerrs ntonodon larvae, probiotic bacteria, vibriosis ABSTRAK
Penyakit yang disebabkan b a k t e r i y a n g paling serius d a n sering menyebabkan terjadinya kematian massal pada larva u d a n g windu di tingkat pembenihan adalah penyakit vibrosis; terjadi a k i b a t s e r a n g a n bakteri b e r p e n d a r y a n g diidentifikasi sebagai C'ibrio lr(rrreyi. Penelitian ini b e r t u j u a n u n t u k m e n d a p a t k a n isolat lokal bakteri probiotik yang potensial m a m p u nlenghambat p e r t u m b u h a n V. harveyi s e r t a efektif tliaplikasikan d a l a m penanggulangan penyakit vibriosis. T a h a p a n penelitian mencakup: (1) S t u d i t e n t a n g seleksi
in vitro d a n in vivo bakteri k a n d i d a t probiotik, (2) Studi tentang mekanisme aksi d a n karakterisasi bakteri probiotik terpilih, (3) S t u d i t e n t a n g aplikasi bakteri plwbiotik terpilih sebagai agen biokontrol pada butlidaya udang. Hasil seleksi in vitro d a n in vivo
diperoleh tiga isolat terbaik yaitu l U b , SKT-b, d a n Ua. Kelangsungan h i d u p larva u d a n g yang selain diinokulasi P! lznrveq'i juga diberi b a k t e r i probiotik l U b , SKT-b d a n Ua b e r t u r u t - t u r u t a d a l a h 88,33, 83,33, d a n 81,67%, sedangkan perlakuan kontrol positif (hanya
diinokulasi V. harveyi s : ~ j a ) se b e s a r 41,67% d a n kontrol negatif ( t a n p a p e n a m b a l l a n b a k t e r i ) sebesar 68,33%. Hasil studi m e n g g u n a k a n p e n a n d a rifampisin resisten
( R P ) m e n u n j u k k a n b a h w a j u m l a h sel V. ltnrveyi
MR5339
RP
pada p e r l a k u a n t a n p a p e n a m b a h a n probiotik lebih tinggi d i b a n d i n g p a d a p e r l a k u a n dengan p e n a m b a h a n probiotik, baik p a d a larva mati, larva hidup, m a u p u n a i r media pemeliharaan. Hasil analisis sekuen sebagian gen 16-rRNA m e n u n j u k k a n bahwa isolat 1 U b memiliki k e m i r i p a n dengan Pseudo- nlteronzortns piscicirln, setlangkan isola t S K T - b d a n Ua mcmiliki kemiripan d e n g : ~ n Vibrio alginolyticus. Bakteri probiotik terpilih d a p a t diaplikasikan langsung pada media pemeliharaan l a r v a u d a n g a t a u melalui pengayaan p a k a n baik p a k a n a l a m i m a u p u n p a k a n buatan.K a t a kunci: b a k t e r i p r o l ~ i o t i k , larva Penneus monodon,
vibriosis
PENDAIIULUAN
I) Departe~nen Budidaya Pera~ran, Fahultas Perlkanan dan Illmu Serangan penyakit bakteri pada tingkat pembenihan Kela~ltan IPB, .I1 A g a l ~ s . K a ~ n p ~ l s IPB Darlnaga, Bogor 16680 yallg paling serius dan sering menyebabkan terjadinya
8 1 Vo1.13. No. 2 J.llrnu.Pert.lndones
kematian massal pada larva udang windu adalah serangan bakteri berpendar yang diidentifikasi sebagai Vibrio harveyi (Lavilla-Pitogo el a1 1990; Karunasagar el a/. 1994; Ruangpan el a 1 1998). Serangan ini menyebabkan penyakit vibriosis. Bakteri ini pada umumnya menyerang larva udang pada stadia zoea, mysis dan awal p a s c a l a ~ a (Lavilla-Pitogo et (11 1990) sehingga menjadi kendala dalam penyediaan benih udang yang sehat dalanl jumlah besar yang diperlukan untuk produksi udang.
Usaha untuk menanggulangi penyakit vibriosis telah dilakukan dengan menggunakan berbagai jenis antibiotik. Namun penggunaan antibiotik secara terus-menerus dengan dosis sub-optimal telah mengakibatkan IT hot.veyi ~nenjadi resisten (Karunasagar et 01. 1994; Tjahjadi et 01. 1994; Teo et NI 2000). Penggunaan vaksin juga sulit diterapkan karena galur V. ha~.veyi yang menyerang larva udang sangat beragam (Suwanto el al. 1998).
Dengan adanya kelemahan-kelemahan dari berbagai upaya yang telah dilakukan, penggunaan bakteri probiotik sebagai agen biokontrol pada pembenihan udang menawarkan alternatif pemecahan untuk menanggulangi per~nasalahan tersebut. Dasar pendekatan ini adalah dengan menggunakan aktivitas mikroorganisme yang dapat menekan atau menghambat pertumbuhan 1 : harveyi tanpa menimbulkan dampak buruk pada sistem keseirnbangan ekologis mikrob. Cars ini telah terbukti berhasil dan banyak digunakan pada usaha hewan ternak (Fuller 1992; Ohhira el al. 1996), namun baru akhir-akhir ini diteliti untuk diaplikasikan pada sistem budidaya perairan, misalnya pada budidaya ikan (Skjermo , Vadstein 1999; Gram et a/. 1999), kerang-kerangan (Douillet
.
Langdon 1994; Riquelme el a 1 1997) , udang (Tjahyadi el ol. 1994; Rengpipat et al. 1998a, 1998b, 2000; Gomez-Gil el trl 2000).Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat lokal bakteri probiotik yang potensial lnarnpu menghambat pertumbuhan I ' harveyi patogen dan efektif diaplikasikan dalam penanggulangan penyakit vibriosis.
BAHAN DAN METODE
Sclcksi In Vitro d a n In Vivo Bakteri Kandidat Probiotik Isoli~si Bakteri Kandidat Probiotik
Bakteri kandidat probiotik diisolasi dari berbagai lingkungan tambak dan hatchery yaitu di Balai Pengembangan Benih Ikan Laut Payau dan Udang (BPBILAPU), Pangandaran, Jawa Barat dan hatchery udang PT Biru Laut Khatulistiwa serta tambak udang intensif di Lampung. Contoh diambil meliputi berbagai stadia udang dau media pemeliharaannya, pakan alanli larva udang berupa kultur alga dan artemia. Setiap contoh disebar pada media semvater complete (SWC)-agar (5g bactopeptone, I g ekslrak khamir, 3ml gliserol, 15g agar, 750n1l air laut, dan 250ml akuades) dan selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang (28 hingga 3 l)"C selama 24 jam.
Koloni yang terpisah kemudian dipilih secara acak untuk n~endapatkan isolat murni dan dipelajari lebih lanjut.
Vibrio hat.veyi yang digunakan dala~n penelitian ini adalah L! harveyi MR5339, diisolasi dari udang sakit dan merupakan koleksi Balai Penelitian Perikanan Pantai, Maros, Sulawesi Selatan, serta telah diuji sifat patogennya pada larva udang windu.
Uji In Vitro Bakteri Kandidat Probiotik
Uji In Vitro Baktcr-i Kandidat Probiotik dengan Metode Kirby-Baucr
Semua isolat murni yang diperoleh, diuji daya hambatnya terhadap V. hcrrveyi MR5339 secara in vitro dengan metode Kirby-Bauer, yakni dengan mengamati diameter zona hambat pada media SWC-agar. Masing- masing sebanyak 1 ose bakteri kandidat probiotik dan V. harveyi MR5339 disuspensikan ke dalam 500p1 larutan fisiologis (NaCI 0,85%) steril di dalam tabung eppendorf: Selanjutnya sebanyak 50 111 suspensi V. harveyi MR5339
disebar pada media SWC-crgar dan dibiarkan sampai agak kering. P a p e r disk steril merk Whatman nomor 42 dengan diameter 5nln1 diletakkan di atas media SWC-agar yang telah ditebarkan 1'. hal~vej~i MR5339 dan kemudian sebanyak 5p1 suspensi bakteri kandidat probiotik diteteskan di atas p a p e r disk tersebut. Pengujian dilakukan dengan 4 ulangan dan I kontrol (larutan fisiologis). Setelah diinkubasi pada suhu ruang selalna 24 jam, zona hambat bakteri diukur.
Uji In Utro Baktcri Kandidat Probiotik dengan Metode Kultur Bcrsama
Bakteri kandidat probiotik yang tidak menghasilkan zona hambat pada pengujian dengan metode Kirby-Bauer diseleksi kenibali untuk mengukur kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan C: harveyi dengan melakukan kultur bersama dalam media SWC-cair. Sebelum pengujian, bakteri kandidat probiotik dari golongan Vibrio diuji sensitivitasnya terhadap antibiotik rifampisin dengan cara menumbuhkan isolat-isolat tersebut pada media SWC-agar 10% W/V dan penambahan t,~fananlpisin 5 0 ~ g . m l - ' (SWC+Rf). Setelah diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam, dilakukan penganlatan pertumbuhan koloni pada media tersebut untuk mengetahui respon resistensi. Uji in vitro bakteri ini dilakukan untuk menseleksi bakteri kandidat probiotik sehubungan dengan penggunaan penanda resisten rifampisin ( R P ) pada V. harveyi.
Pengaruh penghambatan bakteri kandidat probiotik pada V. harveyi MR5339
RP
diketahui dengan cara menumbuhkan setiap isolat murni bakteri kandidat probiotik (Vibrio dan non-Vibrio) pada media SWC-cair 10% dengan kepadatan 1o4
cfu.ml-'. Selanjutnya di- tambahkan l o 4 cfu.ml" C: harveyi MR5339 R P . Setelah diinkubasi menggunakan larutan fisiologis steril sanlpai 10-I untuk kultur campuran dan sampai 10" untuk kontrol (V.
Vol. 13 No. 2 J.llmu.Pert.lndones
82
ldasil pengenceran kemudian disebar pada media SWC+Rf untuk bakteri kandidat probiotik dari golongan Iji'brio dan media TCBS-agar untuk isolat non-l'ibrio. Hasil pe- nyebaran kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Apabila 1' hurveyi MR5339
RP
pada tabung kontrol (tanpa isolat probiotik) tumbuh jauh lebih banyak dibanding pada kultur campuran (V. harveyi MR5339RP
dicampur dengan isolat probiotik), maka berarti isolat probiotik tersebut mampu menghambat pertumbuhan I.'. harveyi MR5339 R P .Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik Sebelum dilakukan uji tantang dengan b'. harveyi pada larva udang, sebanyak 6 isolat yang paling potensial berdasarkan uji in vitr.0 (masing-masing 3 isolat dari metode Kirby-Bauer dan kultur bersama) diuji pato- gc~iisitasnya pada larva udang. Pengujian dilakukan dengan menambahkan suspensi isolat kandidat probiotik berkonsentrasi l ~ ~ c f f u . m l - ' pada media pemeliharaan larva udang. Larva udang dipelihara dalam stoples berisi air laut steril 21 dengan kepadatan 10 ekor per 1 dan diberi pakan .4rtemia 3 hingga 5 individu per ml sebanyak 4 kali per hari. Penleliharaan larva udang dilakukan selanla 5 hari d a ~ i larva yang nlati dihitung setiap hari. Pada akhir per- cobaan dihitung kelangsungan hidup larva udang dan dibandingkan dengan kontrol, yakni perlakuan tanpa pe- nambahan isolat kandidat probiotik.
Uji Tantang Bakteri Kandidat Probiotik dengan K hnrveyi MR5339
RP
pada Larva Udang Windu Enam isolat bakteri kandidat probiotik yang paling potensial berdasarkan uji in vitro (masing-masing 3 isolat dari rnetode Kirby-Bauer dan kultur bersama) dan tidak bcrsifat patogen, diuji efektivitasnya dalani nienghambat scrangan I : har~,evi pada larva udang. Isolat kandidat probiotik dengan konsentrasi 1 0 ~ c f u . m l ~ ' dimasukkan ke dalam wadah pemeliharaan udang sehari setelah larva udang dimasukkan. Larva udang dipelihara dalam stoples yang berisi air laut steril 21 dengan kepadatan 10 ekor per I . Setelah dilakukan kokultivasi dengan larva udang selama 6 jam, I:
hcrt.~vj,i MR5339RP
d i ~ i i a s u k k a ~ i dengan ko~isentrasi l ~ ~ ' c f u . ~ i i l ~ ' (LDS0). Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan termasuk kontrol (tanpa penambahan I : hcrt,vej,i dan isolat probiotik). Selama percobaan larva udang diberi pakan At.teniia sebanyak 3 hingga 5 individu per ml sebanyak 4 kali sehari. Pengantian air dan pe~iyiponan dilakukan setiap hari; air diganti sebanyak 10% dari volume total air dalam wadah pemeliharaan.Penganiatan dilakukan selama 5 hari, dan pada akhir percobaan dihitung kelangsungan hidup dan pertumbuhan larva udang. Kelangsungan hidup larva udang dihitung menggunakan ruliius Effendie (1979), sedangkan per- tu~nbuhan dihitung berdasarkan pertambahan bobot dan panjang dengan runlus Huisman (1987):
Keterangan:
SR: Tingkat kelangsungan hidup (%)
hlt : Jumlah udang yang hidup pada akhir perlakuan (ekor)
No : Jumlah udang yang hidup pada awal perlakuan (ekor)
a = [ ~ - l ] x l O O % dan
Keterangan:
a : Laju perturnbuhan panjang atau bobot udang (%) t : Lama waktu pemeliharaan udang (hari)
It't : Bobot rata-rata akhir udang (mg)
Wo : Bobot rata-rata awal udang (mg) Lt : Panjang rata-rata akhir udang (mm) L,, : Panjang rata-rata awal udang ( m m )
Mekanisme Aksi Bakteri Probiotik pada Larva Udang Mekanisme aksi bakteri probiotik dipelajari melalui esei pelekatan menggunakan penanda molekuler rifampisin resisten ( R P ) untuk mengctahui efektivitas penghambatan bakteri kandidat probiotik terhadap pelekatan dan kolonisasi V. harveyi pada larva udang.
Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1 Ub dan Ua (isolat terbaik yang dihasilkan pada penelitian tahap I) dan SKT-b (hasil isolasi oleh Widanarni et al. 2003). Ketiga isolat tersebut telah diuji dan mampu menghambat pertumbuhan V. harveyi patogen pada uji in vitro dan meningkatkan kelangsungan hidup larva udang windu.
Pembuatan Mutan Bakteri Probiotik Resisten Rifampisin ( R P )
Penibuatan bakteri probiotik
RP
dilakukan melalui mutasi spontan dengan menyebarkan 1 ,Om1 suspensi bakteri probiotik sensitif rifampisin yang telah dipekatkan menjadi 0 , l m l pada media SWC+llf. Koloni yang tumbuh pada media tersebut merupakan mutan bakteri probiotik R P .Pertumbuhan Baktcri Probiotik
RP
Bakteri probiotik tipc liar dan mutannya masing- masing ditumbuhkan pada media SWC-cair dalam shaker bergoyang pada suhu ruang. Konsentrasi setiap biakan diperoleh dengan mengukur kekeruhan suspensi biakan dengan metode turbidimetrik. Pengamatan dilakukan setiap jam selama 24 jam dan dibandingkan antara tipe liar dengan
83 Vol.13. No. 2 J.llmu.Pert.lndones
Uji Daya Harnbat Bakteri Probiotik
RP
t e r h a d a p V. harveqd pada Larva U d a n gTiga isolat mutan bakteri probiotik
RP
diuji kelnbali efektivitasnya dalani menghan~bat pertumbuhan V. harveyi patogen pada larva udang. Pengujian dilakukan sama seperti tipe liarnya, namun selain terhadap kelangsungan hidup dan pertumbuhan, pengalnatan juga dilakukan pada populasi bakteri probiotik dan C'. harveyi serta total bakteri baik pada air perneliharaan maupun larva udang. Pengalnatan dilakukan rnenggunakan media TCBS+Rf untuk isolat C'ibrio dan SWC+Rf untuk isolat non Vibrio. Pengujian dilakukan selalna 12 hari, dengan kepadatan larva 10 ekor per I . Selama pengujian, larva udang diberi pakan berupa nauplii .lr./ernia dengan frekuensi pemberian pakan 5 x schari. Pertumbuhan bobot dan pa~ljang total diamati pada awal dan akhir percobaan, sedangkan kelangsungan hidup dihitung pada akhir percobaan.Karakterisasi dan ldentifikasi Bakteri Probiotik Karakterisasi isolat probiotik terpilih dilakukan terhadap morfologi koloni, bentuk sel dan sifat gram dengan pewarnaan gram, sedangkan identifikasi isolat dilakukan berdasarkan hasil sekuensing gen 16s-rRNA (Marchesi ef (11 1998).
Aplikasi Bakteri Probiotik pada Larva Udang Aplikasi Bakteri Probiotik pada Berbagai Stadia Larva Udang
Percobaan ini menggunakan larva udang windu stadia nauplius yang dipclihara hingga stadia pasca-larva 10 ( P L l o ) dan diberi bakteri probiotik SKT-b dengan konsentrasi 10%fu.ml~' pada waktu yang berbeda. Secara keseluruhan, percobaan terdiri dari 6 perlakuan dan 1 kontrol dengan 3 ulangan yaitu: (A) Pernberian bakteri probiotik pada awal stadia nauplius, (B) Pelnberian bakteri probiotik pada awal stadia zoea, (C) Pernberian bakteri probiotik pada awal stadia rnysis, (D) Pernberian bakteri probiotik pada awal stadia pasca-larva 1 , (E) Pemberian baktcri probiotik pada awal stadia nauplius, zoea, mysis dan pasca-larva, (F) Pemberian bakteri probiotik setiap hari, (G) Kontrol (tanpa pe~nberian bakteri probiotik).
Pe~neliharaan larva dilakukan dalarn wadah stoples kaca dengan volutne air perneliharaan 2 liter dan padat penebaran 20 ekor per liter. Selarna perneliharaan, larva ~ ~ d a n g diberi pakan alami berupa Skelefonernu dan At.fernia. I'arameter yang diamati selama penelitian adalah ke- langsungan hidup larva udang, pertumbuhan panjang dan bobot larva, populasi bakteri dan kualitas air.
berian bakteri probiotik dengan konsentrasi 10~cfu.ml-', (B) Pemberian bakteri probiotik dengan konsentrasi 10~cfu.ml- I, (C) Pernberian bakteri probiotik dengan konsentrasi lo5 cfu.1111-I, (D) Pemberian bakteri probiotik dengan konsen- trasi 1 0 ~ c f u . m l - ' , (E) Pemberian bakteri probiotik dengan konsentrasi bertingkat dari 1
o3
hingga 1 ~ ~ c f u . m l - ' , (F) Kontrol (tanpa pemberian bakteri probiotik).Larva dipelihara dalam wadah stoples kaca dengan volume air perneliharaan 21 dan padat penebaran 20 ekor per I. Selarna perneliharaan, larva udang diberi pakan alarni Artemia. Parameter yang diarnati selarna penelitian adalah kelangsungan hidup larva udang, perturnbuhan panjang dan bobot larva, populasi baktcri dan kualitas air.
Aplikasi Bakteri Prohiotik Melalui Pengayaan Artemia
Percobaan menggunakan dua perlakuan, pertarna larva udang diberi pakan .'lt.femia yang diperkaya dengan Vibrio SKT-b dan kedua larva udang diberi pakan Artemia tanpa pengayaan (kontrol). Pengayaan dilakukan dengan cara rnenarnbahkan Vihrio SKT-b pada media pe- rneliharaan Arfemia dengan konsentrasi awal l
o6
cfu.ml-' media. Lama waktu pengayaan ditentukan berdasarkan lama waktu yang rnampu menghasilkan akurnulasi bakteri probiotik tertinggi pada ti~buh Arfemia. Arfemia diberikan ke larva udang selarna 14 hari. Perturnbuhan panjang dan bobot larva udang diarnati pada awal dan akhir percobaan, sedangkan kelangsungan hidup dihitung pada akhir perco baan.Aplikasi Bakteri Prohiotik Melalui Pakan Buatan Percobaan ini rnenggunakan udang windu PL 36 yang dipelihara s e l a ~ n a 42 hari dalam akuariurn dengan ke- padatan 15 ekor per akuarium (volume 30 liter). Pernberian pakan dilakukan 4 kali sehari, yaitu pada pukul 08.00, 12.00, 16.00, dan 22.00. Jurnlah pakan yang diberikan didasarkan pada Feeding Rule (FR) yang disesuaikan dengan peningkatan biomassa udang. Persiapan pakan uji rneliputi tahap kultur bakteri, pernisahan sel bakteri dengan media kultur, dan pencampuran bakteri pada pakan. Pencarnpuran pakan dengan bakteri probiotik dilakukan dengan nisbah 3:l (Rengpipat et al. 1998b). Sebagai perekat digunakan putih telur sebanyak 3% dari total campuran pakan dan bakteri. Secara keseluruhan, penelitian terdiri atas 3 perlakuan dan 1 kontrol dengan 3 ulangan, yaitu kontrol (pakan-1.3% putih telur), SKT-b (pakan+probiotik SKT-bt3% putih telur), 1 UB (pakan+probiotik I UB+3% putih telur), dan kornersil (pakan
+
probiotik kornersil+3% putih telur).Aplikasi Bakteri Probiotik pada Berbagai
Konsentrasi
lIASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini rnenggunakan larva udang windu stadia
seleksi
I,, Vitro d a n I,, Vi,,o Bakteri Kandidat Probiotik PLI dan dipelihara hingga stadia PLlo. Bakteri probiotikSKT-b ditambahkan ke dalarn media perneliharaan larva lsolat Bakteri Kandidat Probiotik udang dengan konsentrasi yang berbeda, yaitu (A) Pern-
Vol. 13 No. 2 J.llrnu.Pert.lndones 84
Bakteri kandidat probiotik y a n g berhasil diisolasi dari 34 sumber yang berbeda di lingkungan tambak dan hatchery adalah 11 8 isolat. Sebatlyak 2 2 isolat berasal dari tambak pembesaran udang v a n a m e di Desa Pinang Gading, Kalianda, Latnpung Selatan, 5 7 isolat dari lingkungan penlbenihan udang P T Biru Laut Khatulistiwa, L a m p u n g Selatan, dan 3 9 isolat dari Balai Pengembangan Benih lkan Laut Payau dari Udang ( B P B I L A P U ) Pangandaran, Cianlis, Jawa Barat.
PenampiIan warna dan bentuk koloni isolat-isolat tersebut pada media SWC-agar a d a beberapa m a c a m . Warna koloni terdiri dari kretn, kuning, oranye, dan putih deligall b e ~ i t u k koloni oval, bulat kecil, bulat besar dan heberapa menyebar ( s I I , ~ I . I I I ~ I ~ ~ ) . Koloni bakteri kandidat probiotik dari golongan I'ibrio menampilkan warna kuning d a ~ i hijau pada media T C B S .
Iiasil Uji I n fitro Bakteri K a n d i d a t Probiotik
Hasil Uji I n Vitro B a k t e r i K a n d i d a t P r o b i o t i k d e n g a n M e t o d e K i r b y - B a u e r
Penapisan in vitvo terhadap 1 18 isolat bakteri kandidat probiotik dalam menghambat perturnbuhan 1'. horveyi 5339, menghasilkan 6 2 isolat atau sebanyak 52,54% yang ~ilenghasilkatl zona hambat. Berdasarkan diameter zona han~batnya, dipilih 3 isolat terbaik, yaitu isolat 9 a yang berasal dari Cj~clorella (pakan alami) dengan z o n a hambat 12,8mm, isolat U a yang berasal dari saluran cerna udang vaname dengan zona hambat 14,5m1n, dan isolat P I 7 B b yang berasal dari air pemeliharaan kerapu bebek dengan zolia hambat 15,O tnm (Widanarni er a/. 2008a). Isolat- isolat bakteri telah diisolasi oleh Muliani er a/. (2003) scdikitnya 603 isolat bakteri asal laut dan 15 diantaranya (2,5%) potensial menghambat V. harveyi MR5339; Haryanti er a/. (2000) juga telah mengisolasi 2 7 3 isolat bakteri dan 3 di antaranya ( 1 % ) menunjukkan adanya hambatan terhadap pertumbuhan I/ harveyi secara in virro. Hasil penelitian Riquelme ei al. (1997) menunjukkan bahwa dari 5 7 isolat bakteri yang diisolasi dari air laut, 3 di alitaranya (5%) potensial nlenghanlbat pertumbuhan C<
crng~rilla~.lcr?i. Adanya peng-hanlbatan pertunlbuhan bakteri tidak selalu dapat dianlati dengan melihat adanya zona bening pada media padat. Komposisi media yang digunakan mungkiti mempengaruhi junllah senyawa antimikrob yang dihasilkan atau dilepaskan k e media. S c l a i ~ i itu, penghambatan pertutnbuhan tidak selalu hcrkaitali deligan produksi senyawa atltimikrob scpcrti antibiotik, tetapi dapat juga karena adanya senyawa metabolit primer atau adanya perubahan p H (Verschuere er trl. 2000).
Hasil Uji I n Vitro Bakteri K a n d i d a t Probiotik d e n g a n M e t o d e K u l t u r B e r s a m a
Sebanyak 5 1 isolat bakteri yang tidak menghasilkan rolia hanibat dengan metode Kirby-Bauer diuji ketnbali kemampuannya d a l a ~ n menghanlbat pertumbuhan
K
/icri.veyi menggunakan metode kultur bersama. Hasil uji
menunjukkan b a h w a hanipir s e m u a bakteri yang diuji manlpu menghatnbat pertunlbuhan V. harveyi MR5339
RP
walaupun dengan daya hanlbat yang berbeda-beda. Tiga isolat, yaitu I U b , P20Bf, dan IOa yang masing-masing diisolasi dari udang v a n a m c , air pemeliharaan udang galah dan Skeletonemu costarlllll tnenunjukkan hasil terbaik. Jutnlah V. harveyi M R 5 3 3 9RP
yang tumbuh dengan penatnbahan probiotik l U b , P20Br, dan 10a masing-masing sebanyak 1 cfu.ml-I, 16 cfi~.rnl-l, dan 30cfu.ml-I, sedangkan pada biakan kontrol (hanya diinokulasi dengan V harveyi M R 5 3 3 9 R P ) , jumlah I: han~eyi MR5339RP
yang tunlbuh nlencapai 7,6x I O ~ C ~ U . I ~ I - ' (Widanarni er a/. 2008b).P a t o g e n i s i t a s B a k t e r i K a n d i d a t P r o b i o t i k
Sebelutn diuji tantang dengan V. harveyi M R 5 3 3 9 pada larva udang, sebatlyak 6 isolat terbaik hasil uji in virro (masing-masing 3 isolat dari metode Kirby-Bauer dan kultur bersama) diuji patogenisitasnya terhadap pascalarva udang windu. Hasil uji patogenisitas memperlihatkan bahwa nilai kelangsungan hidup pada perlakuan dengan penambahan bakteri k a ~ i d i d a t probiotik adalah tidak berbeda nyata dengan kontrol; artinya s e m u a kandidat probiotik y a n g diuji tidak menimbulkan kenlatian yang berarti pada udang atau tergolong tidak patogen (Widanarni er a/. 2008a,b).
Hasil Uji T a n t a n g B a k t e r i K a n d i d a t P r o b i o t i k d e n g a n V . linrveyi MR5339 ~f~ p a d a l a r v a u d a n g w i n d u
Masing-masing tiga isolat bakteri kandidat probiotik yang paling potensial berdasarkan uji in vitro dari metode Kirby-Bauer dan kultur bersama serta tidak bersifat patogen, diuji efektifitasnya dalam menghambat serangan
V. har.veyi M R 5 3 3 9 pada larva udang windu. Hasil pengujian menunjukkan b a h w a s e m u a isolat yang diuji dapat tneningkatkan kelangsungan hidup larva udang. Nilai kelangsungan hidup larva pada perlakuan yang selain diinfeksi dengan V. har.ilej~i M R 5 3 9 9
RP
juga ditam bah probiotik adalah 76,7-90,0%, sedangkan pada perlakuan y a n g hanya diinfeksi dengan V. harveyi MR5399RP
tanpa probiotik nilai kelangsungan hidupnya hanya 65,O-73,3% (Widanarni et a/. 2008a,b). Petlingkatan nilai kelangsungan hidup larva tersebut diduga disebabkan oleh penghambatan pertumbuhan harveyi pada larva udang oleh bakteri probiotik. Hasil penelitian Rengpipat el a/. (1998b) menggunakan probiotik Lltr~.illzr.s S I I menunjukkan bahwa sctelah diberi perlakuan probiotik selama 100 hari dan kemudian diuji tantang dcrigan V. horveyi selatna 10 hari, nilai kelangsungan hidup udang windu mencapai 100% sedangkan pada kontrol 26%. Haryanti et ul. (2000) tllelaporkan b a h w a penambahan bakteri strain by-9 dengan konsentrasi l o 6 cfu.ml-' pada media pemeliharaan larva udang windu menghasilkan tingkat kelangsungan hidup 59,3%, sedangkan pada kotltrol 14,7%. Riquelme er ul. ( 1 9 9 7 ) juga melaporkan bahwa penambahan bakteri strain C 3 0 dan S V I pada media pemeliharaan larva kerang (Avgopecren pzr~.zrr.arz~s) sccara nyata dapat nleningkatkankelangsungan hidup larva tersebut walaupun tidak berpengaruh setelah diuji tantang dengan 1'. angzrillarzrni. Dalam uji in vitt.0 sebelumnya, diketahui isolat C 3 0 dapat mengharnbat pertunibuhan C'. angzrillarum patogen, sedangkan S V I tidak menunjukkan adanya penghambatan. hlekanisme Aksi d a n Karakterisasi Bakteri Probiotik
Uji In Vivo Bakteri Probiotik pada L a r v a U d a n g Isolat yang digunakan d a l a ~ n penelitian ini adalah I U b dan Ua (isolat terbaik y a n g dihasilkan pada penelitian Tahap I) serta SKT-b (diisolasi oleh Widanarni et al. 2003). I lasil pengujian mcnunjukkan b a h w a kelangsungan hidup larva yang diinokulasi dengan I: harveji dan diberi bakteri probiotik IUb, SKT-b dan Ua, berturut-turut adalah 88,33, 83,33, dan 81,67%, sedangkan perlakuan kontrol positif (hanya diinokulasi I: harvey! saja) sebesar 41,67% dan kontrol negatif (tanpa penambahan bakteri) sebesar 68,33% (Widanarni et al. 2 0 0 8 ~ ) .
Penggunaan Penanda
RP
p a d s Bakteri Probiotik Sebanyak l ~ ~ c f u . ~ n l - ' bakteri probiotik tipe liar sensitif rifampisin ditumbuhkan pada media SWC-agar yang mengandung rifampisin 5 0 pg.ml-', telah memberikan mutan resisten rifa~npisin 48-1 10 koloni. Morfologi koloni dan pendarannya s a m a seperti tipe liarnya. Sebelum digunakan pada uji mekanisnie penghambatan probiotik pada larva udang, nlaka niutanRP
yang telah diperoleh ini teslebih dahulu diuji pertumbuhannya dan dibandingkan dengan tipe liarnya.Pertumbuhan Bakteri Probiotik
RP
Hasil uji pertumbuhan bakteri probiotik baik tipe liar nlaupun yang diberi penanda resisten rifampisin ( R P ) , ~ n e m b e r i k a n laju pertumbuhan yang relatif sama. Pertumbuhan tertinggi ketiga strain bakteri probiotik ( I Ub, SKT-b, Ua) dicapai pada jam ke 10-14, dan menurun setelalinya (Widanarni et al. 2 0 0 8 ~ ) . Hal ini menunjukkan bahwa adanya mutasi resisten rifanipisin pada bakteri probiotik tidak berpengaruh terhadap pertumbuhannya. Dengan demikian penanda tersebut dapat digunakan sebagai penanda untuk ~ i i e m o n i t o r keberadaan bakteri tersebut pada larva udang dan media pemeliharaannya.
Daya Hambat Bakteri Probiotik
RP
t e r h a d a p V .korvcyi pada Larva U d a n g
Tiga isolat mutan bakteri probiotik diuji efektivitasnya d a l a ~ n mcnghambat scrangan I'. harveyi M R 5 3 3 9
RP
pada larva udang windu. Pengamatan dilakukan terhadap kelangsungan hidup larva, pertumbuhan panjang dan bobot larva serta populasi bakteri probiotik, C'. harveyi M R 5 3 3 9R P
dan total bakteri baik pada air pemeliharaan, udang liidup maupun udang mati.I-lasil peng~!jia~l menunjukkan b a h w a ketiga isolat n l ~ ~ t a n probiotik tersebut secara signifikan (p<0,05) dapat meningkatkan kelangsungan hidup larva udang seperti tipe
liarnya. Kelangsungan hidup larva pada perlakuan dengan penambahan SKT-b, I U b , dan U a berturut-turut adalah 88,33, 86,67 dan 83,33%, sedangkan perlakuan yang hanya diinokulasi dengan V. harveyi M R 5 3 3 9
RP
tanpa probiotik, nilai kelangsungan hidupnya hanya mencapai 5 1,67% (Widanarni et al. 2 0 0 8 ~ ) . Peningkatan nilai kelangsungan hidup larva udang terjadi karena adanya penghambatan pertumbuhan V. harveyi pada larva udang oleh bakteri probiotik. Hal ini ditunjukkan oleh lebih tingginya jumlah sel V. harveyi M R 5 3 3 9UP
pada perlakuan tanpa pe- n a ~ n b a h a n probiotik, dibanding perlakuan dengan penambahan probiotik, baik p a d a larva mati, larva hidup, maupun air niedia pemeliharaan (Widanarni et a1 2 0 0 8 ~ ) . Larva udang y a n g diberi probiotik memiliki nilai pertumbuhan p a ~ i j a n g lebill besar (5,16-5,32%) dibanding perlakuan tanpa probiotik (4,90-5,02%). Demikian pula untuk pertumbuhan bobot menunjukkan b a h w a larva yang diberi probiotik menghasilkan pertumbuhan bobot lebih besar (1 1,27-1 1,99%) dibanding perlakuan tanpa pem- berian probiotik (9,35-l0,63%) (Widanarni et a/. 2 0 0 8 ~ ) . Hal ini menunjukkan b a h w a penambahan bakteri probiotik dapat meningkatkan pertumbuhan panjang dan bobot pada larva udang windu. Diduga pada perlakuan tanpa penarnbahan probiotik, larva udang menggunakan sebagian energi pertumbuhannya untuk mengatasi serangan V. harveyi, sehingga pertumbuhan panjang dan bobotnya lebih rendah dibanding perlakuan dengan penambahan bakteri probiotik. Pada perlakuan dengan penambahan probiotik, bakteri probiotik bekerja mengeliminir populasi V. harveyi, sehingga larva u d a n g dapat ~iiemanfaatkan energi yang tersedia lebih banyak urituk pertumbuhannya. Selain itu, bakteri probiotik yang d i t a ~ n b a h k a n tersebut berkemung- kinan mengandung niakro dan mikro nutrien yang di- butuhkan larva udang atau dapat memberi kontribusi enzim untuk pencernaan yang menyebabkan udang dapat mencerna pakan lebih baik, sehingga nutrisi yang diserap oleh tubuh udang juga lebih banyak, yang akhirnya akan niemberikan pertumbuhan yang lebih baik.l d e n t i f i k a s i B a k t e r i I'robiotik
Hasil analisis sekuen sebagian gen 16-rRNA menunjukkan b a h w a isolat 1 Ub termasuk spesies Psezrdoalteronionas piscicida dengan indeks kemiripan 98%, S K T - b termasuk spcsies I'ibrio alginolyticus dengan indeks ke~iiiripan 88%, dan U a termasuk spesies Vibrio alginolyticzrs dengan indeks kemiripan 98%.
Aplikasi Bakteri Probiotik pada L a r v a U d a n g
Aplikasi Bakteri Probiotik pada Berbagai Stadia L a r v a U d a n g
Percobaan pemberian probiotik pada berbagai stadia larva udang windu menunjukkan bahwa tingkat kelangsungan hidup larva udang adalah 24,17%35,83% dengan nilai tertinggi terdapat pada perlakuan pemberian bakteri probiotik pada setiap pergantian stadia yaitu sebesar 35,83%, sedangkan terendah pada perlakuan kontrol (tanpa
Vol. 13 No. 2 J.llrnu.Pert.lndones 86
petnberian bakteri probiotik) yaitu 24,17%. Nilai laju pertunibuhan p a ~ i j a n g larva udang windu dengan penambahan bakteri probiotik Vibrio S K T - b sebesar 18,64%-19,09%, tidak berbeda nyata dengan kontrol ( 18,47%) (Widanarni et (11 2008d).
Aplikasi B a k t e r i P r o b i o t i k p a d a B e r b a g a i K o n s e n t r a s i
Percobaan peniberian berbagai konsentrasi bakteri probiotik pada larva udang windu nienunjukkan bahwa tingkat kelangsungan hidup larva udang 76,67%-94,17% dengan nilai tertinggi terdapat pada perlakuan pemberian bakteri probioti k dengan dosis 1
o4
cfu/nil yaitu sebesar 93,17%, sedangkan terendah pada perlakuan kontrol (tanpa pemberian bakteri probiotik) yaitu hanya 76,67%. Nilai laju pertumbuhan panjang larva udang windu dengan penambahan bakteri probiotik Vibrio S K T - b adalah 7,59%- 8.26% dan tidak berbeda nyata dibandingkan dengan kontrol (7,67%) (Widanarni et a / . 2008e).Aplikasi B a k t e r i P r o b i o t i k M e l a l u i P e n g a y a a n Artentin
Percobaan pemberian probiotik melalui pengayaan .-11.tetnia menunjukkan bahwa pertutnbuhan panjang dan bobot larva udang windu y a n g diberi Artemia dan diperkaya dengan I'ibrio SKT-b masing-niasing adalah 5,78% dan 18,87%, berbeda sangat nyata (p<0,01) dengan kontrol yang hanya diberi ,.lrtemia saja yaitu 4,23% dan 12,79% (Widanarni et al. 2 0 0 8 0 . Hal ini menunjukkan bahwa p e n a ~ n b a h a n Vihrio S K T - b pada Artemia lnampu meningkatkan laju pertumbuhan panjang dan bobot larva udang windu. Kelangsungan hidup larva udang tidak berbeda nyata antara perlakuan dan kontrol; dengan nilai 80-93% untuk yang diberi pakan Arfemia yang diperkaya dengan I'ihrio S K T - b dan 7 0 hingga 80% untuk kontrol (Widanarni et a/. 2 0 0 8 0 .
pemberian probiotik nielalui pakan dapat tneningkatkan pertumbuhan baik pada bobot niaupun panjang. Pening- katan laju pertunibuhan bobot dan panjang tersebut terjadi karena probiotik y a n g dibcrikan dapat meningkatkan nilai nutrisi (terutama protein) pakan yang diberikan (Tabel I ) . Selain itu, peningkatan pcrtumbuhan diduga disebabkan karena bakteri probiotik y a n g diberikan mengandung makro d a n m i k r o n u t r i e n y a n g t i d a k t e r d a p a t p a d a p a k a n , y a n g
Perlakuan
Keterangan : Huruf yang sama menu~~.jukkan tidak berbeda nyata
G a m b a r 1 Laju Pertumbuhan Bobot Udang Windu yang Diberi P i ~ k a n Uji
G a m b a r 2 Laju Pertumbuhan Panjang Udang Windu y a n g Diberi Pakan Uji.
~ ~ l i k ~ ~ i ~ ~probiotik ~k ~~ lp a k a n ~ ~ B~~~~~ ~l ~ ii Ketera~lgan : Huruf yang sama menunjukkan tidal; berbeda nyata
Setelah masa pemeliharaan selama 4 2 hari, pemberian
bakteri probiotik nielalui pakan menghasilkan laju dapat memacu p e r t u n ~ b u h a n udang. Kemungkinan lain, pertumbuhan bobot 7,47-9,03% ( G a m b a r 1 ) dan laju bakteri probiotik y a n g diberikan dapat memberikan pertumbuhan panjang 2,27-2,88% (Ganibar 2). Hasil kontribusi enzinl untuk pcncernaan yang menyebabkan analisa pada selang kepercayaan 95% tnenunjukkan bahwa udang dapat mencerna pakan dengan lebih baik, sehingga
Tabel I Kandungan Nutrien dalam Pakan Uji Selama Pemeliharaan U d a n g Windu Penaeus monodon Hasil Analisa Proksimat (% bobot Kering)
Karbohidrat
Perlakuan Protein L e m a k Kadar Abu Serat Kasar B E T N
Kontrol 38,50 8,13 8,97 3 , 7 8 40,62
SKT-b 46,50 8,78 7,55 2,85 34,32
I U B 42,62 8,27 7,3 1 2,02 39,78
87 Vo1.13. No. 2 J.llmu.Pert.lndones
nutrisi yang dapat diserap oleh tubuh juga lebih banyak; yang akhirnya akan memberikan pertumbuhan yang lebih baik. Hal senada diutarakan oleh Johnson (1986) dalam Rengpipat et 01 (1998b) bahwa probiotik mampu mening- katkan penyerapan pakan dalam saluran pencernaan.
Pemberian probiotik melalui pakan ~nenghasilkan
KESIMPULAN
lsolat probiotik yang dihasilkan yakni IUb, SKT-b, dan Ua adalah efektif n ~ e n g h a n ~ b a t pertumbuhan V. harveyi dan secara signifikan dapat meningkatkan kelangsungan hidup dan pertumbuhan larva udang windu. Peningkatan kelangsungan hidup larva udang tersebut terjadi karena adanya penghambatan pertumbuhan V. harveyi oleh bakteri probiotik yang kemungkinan terjadi karena adanya kompetisi tempat pelekatan atau sumber nutrisi antara V.
harveyi dengan bakteri probiotik baik pada larva udang maupun media pemeliharaannya. Bakteri probiotik yang diperoleh dapat diapliknsikan langsung pada media pemeliharaan larva udang atau melalui pengayaan pakan baik pakan alami maupun pakan buatan.
UCAPAN TERIMA KASIIJ
Ga~nbar 3 Tingkat Kelangsungan Hidup Udang Winduyang Diberi Pakan Uji
Keterangan: Huruf yang salna tnen~~niukkan tidak berbeda nyata
Perlakuan
Keterangan : H u r ~ ~ f yang salna rnenuti.jukkan tidak berbeda nyata.
Gambar 4 Konversi Pakan Udang Windu yang Diberi Pakan Uji
kelangsungan hidup 91,ll-97,78% (Gambar 3) dan tidak berbeda nyata antar perlakuan yang diberikan. Kandungan nutrisi yang berubah akibat penambahan probiotik masih berada pada kisaran yang baik bagi udang windu untuk hidup. Keadaan tersebut didukung dengan kisaran kualitas air yang masih berada dalam kisaran optimal bagi pertumbuhan udang windu. Pemberian probiotik melalui pakan menghasilkan nilai konversi pakan (FCR) 1,35-2,98 (Gambar 4). Pada selang kepercayaan 95%, semua per- lakuan probiotik berpengaruh nyata terhadap nilai FCR. Perlakuan peniberian probiotik yang menghasilkan nilai FCR lebih rendah dibandingkan kontrol ~nengindikasikan bahwa untuk menghasilkan pertumbuhan yang sama dibutuhkan jumlah pakan yang lebih sedikit pada perlakuan pen~berian probiotik sehingga penggunaan pakan lebih efisien. Hal ini diduga sebagai akibat dari adanya kerja bakteri yang me~nperbaiki penggunaan pakan.
Ucapan terima kasih disa~npaikan kepada: Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional, atas dana dan kepercayaan yang diberikan; seluruh anggota t i ~ n peneliti, teknisi dan mahasiswa yang terlibat dala~n penelitian ini, atas kerja sama yang telah terbina selama penelitian berlangsung; Balai Pengem- bangan Benih Ikan Laut Payau dan Udang (BPBILAPU), Pangandaran; Hatchery Udang PT Biru Laut Khatulistiwa dan Tanibak Udang Intensif, Lampung atas ijin yang diberikan untuk pengambilan contoh bakteri dan larva udang.
DAFTAR PUSTAKA
Alabi AO, Jones DA, Latchford JW. 1999. The Efficacy of Immersion as Opposed to Oral Vaccination of Penaeus indiczrs Larvae Against Ifibrio harveyi. Aquaculture
179:l-11.
Douillet PA, Langdon CJ. 1994. Use of a Probiotics for the Culture of Larvae of the Pacific Oyster (Crassostrea gigas Thunberg). Aqi~aculture 119:2540.
Effendie MI. 1997. Biologi Perikanan. Yayasan Pustaka Nusatama. Yogyakarta. 163 hal.
Fuller, R. 1992. History and Development of Probiotics. Di dalam: Fuller R, editor. Probiotics the Scientific Basis. London: Chapman and Hall. hlm 1-8.
Gram L, Melchiorsen J, Spanggaard B, Huber I, Nielsen TF. 1999. Inhibition of ki'h/.io anguillarum by Pseudomonas flzrorescens AH2, a Possible Probiotic Treatment of
Fish. Appl. Environ Microbial 65:969-973.
Gomez-Gil B, Roque A, T ~ ~ n i b u l I JF. 2000. The Use and Selection of Probiotic Bacteria for Use in the Culture of Larval Aquatic Organisms. Aquaculture 191 :259-270.
Vol. 13 No. 2 J.llmu.Pert.lndones 88
Haryanti, Suganla K. T s u ~ n u r a S, Nishijima T. 2000. Potentiality of Bacteria Isolated from Seawater as Biological Control Agent for Vibriosis in Black Tiger Shrimp Penae11.s monodon Larvae. International Sym- posium on Marine Biotechnology.
Huisman EA. 1987. Principles of Fish Production. Depart- ment of Fish Culture and Fisheries. Wageningen Agricultural University. Netherlands. I70hl1n. Karunasagar I, Pai R, Malathi GR, Karunasagar 1. 1994.
Mass mortality of t'et7aeln monodon Larvae Due to Antibiotic-Resistant I'ibrio harveyi Infection. Aqua- culture 128:203-209.
Lavilla-Pitogo CR, Baticados MCL, Cruz-Lacierda ER, De la Pena LD. 1990. Occurrence o f Luminous Bacterial Diseases of Pet~uez~s monodon Larvae in the Philiphines. Aquaculture 91: 1-13.
Marchesi JR et a/. 1998. Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers that Amplify Genes Coding for Bacterial 1 6 s rRNA. Appl Environ Microbiol 6 2 2 5 0 1-2507.
Muliani, Suwanto A, Hala Y. 2003. lsolasi dan Karakterisasi Bakteri Asal Laut Sulawesi untuk Biokontrol Penyakit Vibriosis pada Larva Udang Windu (Penaezrs n~onodon Fab.). Hayati 10:6-1 1.
Ohhira I , Tamura T, Fujii N, lnagaki K, Tanaka H. 1996. Antimicrobial Activity Against Methicillin-Resistant Staph~~lococc~rs azrrezrs in the Culture Broth of Ento~ococclrs,faecali.s TH 10, an Isolate from Malaysian Fermentation Food, Temph. Japanese J Dairy and Food Sci 45:93-96.
Rengpipat SS, Rukpratanporn S, Piyatiratitivorakul S, Menaveta P. 1998a. Probiotic in Aquaculture: A Case Study of Probiotics for Larvae of Black Tiger Shrimp (Penuel1.s monodon). D i dalam: Flegel TW, editor. Advances in Shrimp Biotechnology. Proceedings to the Special Session on Shrimp Biotechnology, 5'" Asian Fisheries Forum; Chiengmai, Thailand. Bangkok: National Center for Genetic Engineering and Biotechnology. hlm 1 76-1 8 1 .
Rengpipat SS, Rukpratanporn S, Piyatiratitivorakul S, Menaveta P. 1998b. Effects o f a Probiotic Bacterium on Black Tiger Shrimp Penaclrs monodon Survival and Growth. Aquaculture 167:301-3 13.
Rengpipat SS, Rirkpratanporn S, Piyatiratitivorakul S, Menaveta P. 2000. Immunity Enhancement in Black Tiger Shrimp (f'et7neu.s nlonodon) by a Probiont Bacterium (Bocilllrs S1 1). Aquaculture 19 1 : 2 7 1 2 8 8 .
Riquel~ne C el a/. 1997. Potential Probiotic Strains In The Culture of the Chi lean Scallop Argopecten purpuratus (Lamarck, 18 19). Aquaculture 154: 17-26.
Ruangpan L. 1998. Luminous Bacteria Associated with Shrimp Mortality. I)i dalam: Flegel TW, editor. Advances in Shrimp Biotechnology. Proceedings to the Special Session on Shrinlp Biotechnology, 51h Asian Fisheries Forum; Chiengmai, Thailand. Bangkok: National Center for Genetic Engineering and Biotechnology. hlni 205-21 1.
Skjenno J, Vadstein 0 . 1999. Techniques for Microbial Control in the Intensive Rearing of Marine Larvae. Aquaculture 177:333-343.
Suwanto A, Yuhana M, llerawaty E, Angka SL. 1998. Genetic Diversity o f I,uminous Vibrio Isolated from Shrinlp Larvae. Di dolun?: Flegel TW, editor. Advances in Shrimp Biotechnology. Proceedings to the Special Session on Shrimp Biotechnology, 5"' Asian Fisheries Forum; Chiengmai, Thailand. Bangkok: National Center for Genetic Engineering and Biotechnology. hlm 217- 224.
Teo JWP, Suwanto A, Poll CL. 2000. Novel p-lactamase Genes from Two Environmental Isolates of Vibrio hat.veyi. Antimicrob Agents Chemother 44: 1309-1 3 14. Tjahjadi MR, Angka SL, Suwanto A. 1994. Isolation and
Evaluation of Marinc Bacteria For Biocontrol of Luminous Bacterial Iliseases in Tiger Shrimp Larvae (Penaelrs n~onodon Fab.). Aspac J Mol Biol Biotechnol 2:234-352.
Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstraete W. 2000. Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture. Microbiol Mol Biol Rev 64:655471. Widanarni, Suwanto A, Sukenda, Lay BW. 2003. Potency O f
Ci'brio Isolates for Biocontrol of Vibriosis in Tiger Shrimp (Penael~s n7ot7o~ion) Larvae. Biotropia 20: 1 1- 23.
Widanarni, F Rajab, Sukenda, M Setiawati. 2008a. Isolasi dan Seleksi Bakteri Probiotik dari Lingkungan Tambak dan Hatchery untuk Pengendalian Penyakit Vibriosis pada Larva IJdang Windu Penaeus monodon (in press pada Jurnal Iciset Akuakultur).
Widanarni, I Tepu, Sukenda, M Setiawati. 2008b. Seleksi Bakteri Probiotik untuk Biokontrol Vibriosis pada Larva Udang Windu ( P e n a e l ~ s monodon) Meng- gunakan Cara Kultur Bersama (in press pada Jurnal Riset Akuakultur).
Widanarni, Eva Ayuzar, Sukenda. 2008c. Mekanisme Penghambatan Bakteri Probiotik Terhadap Per- Tumbuhan If'ibrio Mot.vcyi pada Larva Udang Windu
89 Vo1.13. No. 2 J.llmu.Pert.lndones
(Pencrerrs tnonodon). Jurnal Akuakulti~r lndonesia Widanarni, MA Lidaenni, D Wahjuningrum. 2008e.
7:181-190. Pengaruh Pemberian Bakteri Probiotik C'ibrio SKT-b
dengan Dosis yang I3erbeda terhadap Kelangsungan \i'idanarni, MS Arifin. Sukenda. 2008d. Pengaruh Hidup dan Pertumbuhan Larva Udang Windu Penaeus Pemberian Bakteri Probiotik C'ibrio SKT-b pada nlonodon (it7 press pada Jurnal Akuakultur Indonesia) Stadia yang Berbeda terhadap Kelangsungan Hidup
Larva Udang Windu Penaeus monodon) (in press Widanarni, Elly, D T Sulistyowti, A Suwanto. 2008f. pada Jurnal Akuakultur indonesia). Pemberian Bakteri Probiotik Ifibrio SKT-b pada Larva Udang Windu Melalui Pengayaan Arfemia. Jurnal Akuakultur Indonesia 7: 129-1 37.
