29 BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dan merupakan penelitian eksperimental murni (True Eksperimental). Rancangan penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental laboratorik in vitro dengan metode posttest-only control design. Metode yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri minyak atsiri sirih merah terhadap pertumbuhan S.typhi secara in vitro adalah metode difusi.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmasi Universitas Ma Chung pada bulan Mei 2020.
4.3 Subjek Penelitian 4.3.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah biakan bakteri Salmonella thypi yang diperoleh dari Laboratorium Farmasi Universitas Ma Chung. 4.3.2. Sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah bakteri Salmonella thypi yang diambil dengan menggunakan simple random sampling (Suryaningsih et al, 2015).
4.3.3. Besar Sampel
Penelitian menggunakan 8 kelompok perlakuan minyak atsiri sirih merah (Piper crocatum) dan 2 kelompok kontrol (1 kontrol bahan dan 1 kontrol bakteri). Sehingga terdapat 10 kelompok. Penentuan jumlah pengulangan dihitung dengan menggunakan rumus Degrees of Freedom (DF) berikut n adalah jumlah replikasi dan k adalah kelompok perlakuan. maka:
Degrees of Freedom (DF) = 10 (minimum) – 20 (maksimum) Dengan rumus : (n x k) – k
Maka dapat diperoleh :
Minimum: 10 = (n x 10) – 10 20 = 10n n = 2 Maksimum: 20 = (n x 10) – 10 30 = 10n n = 3 Keterangan: k = kelompok perlakuan n = jumlah replikasi
Dari perhitungan diatas, maka diperlukan 2-3 kali pengulangan untuk sampel.
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah destilat minyak atsiri sirih merah (Piper crocatum). Konsentrasi yang digunakan adalah 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, dan 0,78%.
4.4.2. Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah diameter zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada media MH di sekitar sumuran. Diameter diukur setelah S. typhi kontak selama 24 jam (inkubasi) dengan destilat minyak atsiri sirih merah dengan berbagai konsentrasi.
4.4.3. Variabel kontrol
Variabel kontrol dalam penelitian ini adalah Salmonella typhi, medium biakan, suhu inkubasi 37oC dan waktu inkubasi 24 jam, kloramfenikol 1mg sebagai kontrol positif, dan NaCMC 0,5% sebagai kontrol negatif.
4.5 Definisi Operasional
No Variabel Definisi Cara
Pengukuran Indikator Penilaian Skala 1. Minyak atsiri daun Sirih Merah (Piper crocatu m) Minyak atsiri yang digunakan dalam penelitian diidentifikasika n di Materia Medica, Kota Batu dalam bentuk bahan basah Konsentrasi : 1. 100% 2. 50% 3. 25% 4. 12,5% 5. 6,25% 6. 3,125% 7. 1,56% 8. 0,78% Kategorik: ordinal 2. Daya hambat minyak atsiri daun sirih merah (Piper crocatu m) Daya hambat minyak atsiri sirih merah adalah sifat antibakteri minyak atsiri sirih merah dalam menghambat pertumbuhan koloni Salmonella typhi Perhitungan dengan mengukur diameter zona hambatan pada media MH dengan menggunak an jangka sorong. Diameter di sekitar cawan petri yang sama sekali tidak ditemukan adanya pertumbuhan bakteri ditandai dengan adanya zona bening di sekitar sumuran Numerik : ratio
3. KHM (Kadar Hambat Minimal ) Kadar minimal ekstrak minyak atsiri daun sirih merah (piper crocatum) yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri Salmonella typhi yang ditandai dengan terdapatnya zona inhibisi terkecil disekitar sumuran. Metode difusi sumuran yang dilihat dari zona inhibisi terkecil disekitar sumuran. Diameter zona inhibisi terkecil di sekitar sumuran pada metode difusi sumuran Numerik : ratio
4.6 Alat dan Bahan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain: 1. Suspensi S. typhi
2. Aquades steril 3. Nutrient Broth
4. Minyak atsiri sirih merah 5. Suspensi kloramfenikol 1 mg 6. Media MH
7. Larutan twin
8. Larutan NaCl dan Na2SO4 9. Spirtus
10. Hexan
12. Serbuk Natrium Carboxil Methyl Cellulose (NaCMC 0,5%). Alat
Alat - alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain: 1. Tabung reaksi dan rak tabung reaksi
2. Vibrator/vortex 3. Autoklaf 4. Cawan petri
5. Timbangan atau neraca 6. Ose 7. Lampu bunsen 8. Disposable Syringe 9. Vial 10. Inkubator 11. Mikropipet 12. Yellow tip 13. Tabung Erlenmeyer 14. Sterilisator panas kering 15. Kompor listrik 16. Jangka sorong 17. Pipa alumunium 18. Pipa hidrolik 19. Evaporator 20. Oven vakum
21. Alat destilasi uap
22. Media Kromatologi Gas. 4.7 Instrumen Penelitian
4.7.1 Sterilisasi alat
Semua alat yang akan dipakai dalam penelitian ini terlebih dahulu dicuci bersih kemudian dikeringkan dan disterilkan. Sterilisasi alat dilakukan dengan :
a. Mencuci semua alat dengan sabun hingga bersi dan membiarkannya hingga kering
b. Alat-alat yang bisa disterilisasi dalam autoklaf dibungkus dengan kertas roti dan dimasukkan dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15 atm, selama 15 menit. Sedangkan alat-alat yang tidak bisa disterilisasi dengan autoklaf disterilkan dangan alkohol 70% (Yusmaini dan Bahar, 2018).
4.7.2 Produksi dan Pemurnian Minyak Atsiri Sirih Merah
Minyak atsiri yang digunakan diperoleh dengan cara destilasi uap air Teknik yang digunakan dalam pengambilan sampel minyak atsiri adalah consecutive sampling. Daun sirih yang sudah dipotong-potong sebanyak ± 10 kg dimasukkan ke dalam dandang yang berisi air. Alat destilasi uap kemudian dirangkai dengan merangkaikan pendingin (kondensor). Dandang kemudian dipanaskan dan dijaga agar tidak mencapai temperatur yang tinggi. Air dialirkan ke kondensor dan dijaga agar air terus mengalir. Temperatur kondensor dijaga tetap dingin
dengan menambahkan es, sehingga minyak yang menguap semuanya berubah menjadi embun dan tidak lepas ke udara.
Destilat yang diperoleh merupakan campuran minyak dengan air yang selanjutnya dipisahkan dalam corong pisah. Untuk pemisahan sempurna, destilat ditambah dengan natrium klorida (NaCl) agar minyak yang teremulsi terpisah. Fase air ditampung dengan erlenmeyer, untuk dipisahkan lagi karena kemungkinan masih mengandung sedikit minyak yang teremulasi. Fase air ini ditambahkan lagi dengan natrium klorida, kemudian dipisahkan dalam corong pisah. Cara ini dilakukan berulang-ulang sampai semua minyak terpisahkan. Fase minyak yang diperoleh kemungkinan masih bercampur dengan sedikit air, sehingga perlu ditambahkan natrium sulfat anhidrat (Na2SO4) dan didekantasi (Kusuma dan Uswatun, 2014).
4.7.3 Persiapan Minyak Atsiri Sirih Merah
Minyak atsiri hasil destilasi dan pemurnian, dibuat dalam berbagai konsentrasi 100%; 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,125%; 1,56%; dan 0,78% dengan menggunakan pelarut NaCMC yang dimasukkan ke dalam botol/vial berwarna gelap dan dihomogenkan dengan homogenizer. Konsentrasi minyak atsiri 100% didapat dari minyak atsiri murni dari hasil destilasi. Selanjutnya, 1 ml dari konsentrasi 100% (v/v) ditambahkan dengan 1 ml NaCMC di vial II, sehingga didapatkan konsentrasi 50%. Lalu dari larutan dengan konsentrasi 50%, diambil 1 ml dan ditambahkan dengan 1 ml NaCMC di vial III, sehingga
menghasilkan larutan dengan konsentrasi 25%. Pengenceran dilakukan secara bertingkat hingga didapatkan konsentrasi 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, dan 0,78%. Setiap vial diberi label sesuai dengan konsentrasinya, kemudian cakram kertas dimasukkan ke dalam vial lalu direndam.
2 ml minyak atsiri
1 ml NaCMC 0,5% 1 ml NaCMC 0,5% 1 ml NaCMC 0,5%
1 ml 1 ml 1 ml
100% (v/v) 50% (v/v) 25% (v/v) 12,5% (v/v) 1 ml NaCMC 0,5% 1 ml NaCMC 0,5% 1 ml NaCMC 0,5% 1 ml NaCMC 0,5%
1 ml 1 ml 1 ml
4.7.4 Pembuatan Suspensi Salmonella typhi
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Laboratorium Farmasi Universitas Ma Chung. Suspensi Salmonella 6,25%(v/v) 3,125%(v/v) 1,56%(v/v) 0,78%(v/v)
Gambar 4.1
thypi yang dipergunakan, dibuat dengan mengambil satu ose kuman dari kultur, kemudian dimasukkan ke dalam media Nutrient Broth, selanjutnya diinkubasi 37oC selama 24 jam. Setelah 24 jam suspensi kuman yang telah diinkubasi disesuaikan dengan standar Mc Farland dengan menambahkan aquades steril dan suspensi kuman (Efendi dan Hertiani, 2013).
4.7.5 Pembuatan Media Agar MH
Agar MH ditimbang sebanyak 3,4 gram, kemudian dimasukan dalam tabung erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml aquades. Bahan tersebut dicampur dan diaduk merata kemudian dipanaskan sampai mendidih dan larut. Larutan dimasukan ke dalam autoklaf dengan suhu 121oC selama 30 menit. Setelah proses autoklaf, 20 ml larutan dalam tabung erlenmeyer dituangkan ke dalam cawan petri steril secara aseptik, kemudian dimasukkan ke dalam inkubator yang bersuhu 37oC (Kusuma dan Uswatun, 2014).
4.7.6 Pembuatan Larutan Mc Farland
Sebanyak 16 µL BaCl2 1% dicampurkan dengan H2SO4 1% sebanyak 3,3 µL. Bahan tersebut kemudian divortex selama 60 menit sehingga tercampur merata (Kusuma dan Uswatun, 2014).
4.7.7 Penyediaan Kontrol Positif
Kloramfenikol 1 mg dalam sediaan serbuk dilarutkan dengan aquades steril sampai 1 ml sehingga didapatkan konsentrasi 1 mg/ml. Sediaan tersebut ditempatkan pada vial.
4.7.8 Penyediaan Kontrol Negatif
Sebagai kontrol negatif digunakan pelarut pengencer yaitu NaCMC 0,5%. Sediaan tersebut ditempatkan dalam vial.
4.7.9 Tahap Perlakuan
a. Siapkan cawan petri.
b. Tuangkan 100 µL suspensi Salmonella typhi dalam NB yang telah dibuat sebelumnya ke dalam media MH, kemudian digoyangkan supaya homogen. Kemudian tuang MH tersebut sebanyak 10 ml ke cawan petri yang sudah diletakkan sedotan sebelumnya
c. Kemudian cawan petri didiamkan pada suhu ruangan supaya media benar-benar kering sebelum dibuat sumuran.
d. Pada agar MH tadi dibuat sumuran dengan menggunakan pipa aluminium steril dengan diameter 6 mm, jumlah lubang disesuaikan dengan kebutuhan.
e. Selanjutnya minyak atsiri dengan konsentrasi 100%; 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,125%; 1,56%; dan 0,78% masing – masing diambil 100 µL, dimasukkan ke dalam lubang sumuran dengan menggunakan pipet. Sebagai kontrol positif digunakan kloramfenikol, sedangkan kontrol negatif adalah NaCMC 0,5% yang sudah disiapkan sebelumnya. Kemudian seluruh cawan petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.
Destilat minyak atsiri (%v/v)
K (-) 100% 50% 25% 12,5% 6,25% 3,125% 1,56% 0,78% K (+)
Media Mueller Hinton yang sudah dicampur dengan suspensi
S. typhi sesuai standar Mc Farland
K (+)
Tahap pengamatan
Setelah diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 370 C, masing-masing cawan petri diambil dari inkubator dan diamati zona hambatannya. Pengamatan dilakukan dengan cara mengukur zona hambatan pertumbuhan Salmonella typhi yang terjadi di sekeliling silinder pada media MH dengan menggunakan jangka sorong (Suswati dan Mufida, 2009). Zona hambatan adalah jarak terdekat (mm) dari tepi luar silinder hingga mulai terjadinya pertumbuhan bakteri.
Gambar 4.2 Skema tahap perlakuan
Masing-masing diambil 100 µL, dimasukan ke dalam lubang sumuran
Inkubasi pada suhu 37⁰C, selama 24 jam
Larutan uji K (+)
4.8 Analisis Data
1. Data yang akan diolah menggunakan skala data kategorik dan numerik, maka analisis data akan digunakan adalah komparatif numerik tidak berpasangan >2 kelompok yaitu menggunakan One Way ANOVA. Namun, sebelum melakukan uji One Way ANOVA perlu di periksa terlebih dahulu normalitas dan homogenitas datanya.
a. Uji normalitas yang digunakan adalah uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang digunakan ≤ 50. Data dianggap normal jika hasil p > 0,05. Jika hasil p < 0,05 maka data dapat ditransformasikan terlebih dahulu. Apabila setelah ditransformasi, data tetap tidak normal, maka dilakukan uji komparatif yaitu menggunakan uji Kruskal-Wallis + Post Hoc Mann Whitney.
b. Uji homogenitas yang digunakan adalah uji Levene. Jika nilai p > 0,05 maka ragam dikatakan homogen, begitu pula sebaliknya jika nilai p < 0,05 maka ragam dikatakan tidak homogen.
2. Bila didapatkan varian homogen, dilakukan uji One Way ANOVA + post hoc Bonferroni. Namun, jika didapatkan varian tidak homogen, maka digunakan uji post hoc Games Howell.
4.9 Alur Penelitian Langkah I
Penanaman bakteri Salmonella typhi di media Nutrient broth inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C
Gambar 4.3 Skema Alur Penelitian Langkah 2
Kloramfenikol dilarutkan (sebagai control + )
Pelarut pengencer
NaCMC (sebagai control -)
Dimasukkan dalam masing - masing tabung
Masing-masing diambil 100 µL, dimasukkan dalam lubang sumuran
Pembuatan Media Mueller Hinton
(MH)
MH yang sudah dicampur dengan suspensi S.typhi, dibuat lubang sumuran
Inkubasi pada suhu 37⁰ C, selama 24 jam
Diukur diameter zona hambat
Analisis Data
Pengenceran minyak atsiri dengan pelarut NaCMC sehingga menjadi 8 konsentrasi Produksi & Pemurnian minyak atsiri sirih merah dengan destilasi uap
