61 BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A. Hasil Penelitian.
1. Variabel Penelitian
Variabel penelitian dalam studi ini meliputi 4 variabel yang bersifat kuantitatif, terdiri dari panjang tungkai bawah, jumlah kondrosit cakram epifise, kadar ghrelin serum, dan kadar IGF-1 serum. Deskripsi variabel peneltian yang bersifat kuantitatif tersebut dibatasi dengan mempresentasikan nilai rerata dan standar deviasi setiap variabel.
2. Proses Analisis Penelitian
Penelitian ini merupakan studi yang bertujuan untuk menganalisis apakah laserpunktur pada titik GV20 dan ST36 mempunyai efek terhadap pertumbuhan tulang panjang yang dibuktikan dengan adanya perubahan pada panjang tungkai bawah yang dinilai dengan menghitung selisish perubahan panjang tungkai, jumlah kondrosit di cakram epifise yang dinilai dengan menghitung sel dan volume dengan teknik stereologi, kadar ghrelin dan kadar IGF-1 serum yang dinilai dengan melihat molekul protein melalui pemeriksaan Elisa. Lama pemberian laser diberikan dengan waktu yang berbeda dengan maksud untuk mengetahui apakah lama pemberian mempunyai pengaruh yang berbeda terhadap variabel yang diperiksa.
Data yang sudah didapatkan selanjutnya ditabulasi dan dipresentasikan dalam bentuk deskriptif menampilkam rerata dan standar deviasi. Kemudian dilakukan uji normalitas data dengan menggunakan uji Saphiro Wilks untuk mengetahui distribusi datanya apakah termasuk parametrik atau non parametrik yang selanjutnya berguna untuk menentukan analisis statistik berikutnya.
Analisis penelitian diharapkan bisa mengidentifikasi terjadinya variasi atau perbedaan rerata masing-masing variabel yaitu panjang tungkai bawah, jumlah kondrosit cakram epifise, kadar ghrelin serum dan kadar IGF-1 serum dari semua subgrup. Dengan demikian penelitian ini menggunakan analisis uji beda rerata untuk sampel yang independen.
Apabila hasil uji normalitas data variabel yang didapatkan adalah terdistribusi normal, maka uji variasi atau perbedaan rerata menggunakan alat uji statistik Analysis of Variance (ANOVA) atau disebut juga Uji F.
Apabila terdapat hasil yang bermakna, analisis akan diteruskan dengan mencari perbedaan dua rerata setiap subgrup menggunakan uji lanjutan ANOVA yaitu Post Hoc Test dengan Bonferroni test. Namun, apabila hasil uji normalitas data variabel menunjukkan bahwa distribusi data untuk masing-masing variabel adalah berdistribusi tidak normal maka uji variasi atau beda beberapa rerata menggunakan uji statistik non parametrik Kruskal Wallis atau disebut juga Uji K. Penelusuran lebih lanjut untuk menguji beda rerata masing-masing sampel subgrup dapat menggunakan analisis statistik non parametrik Mann-Whitney. Kemudian untuk melihat perbedaan antara lama pemberian antara antara 2 grup menggunakan uji-t bila distribusi data normal atau Mann Whitney bila data tidak normal.
3. Deskripsi data dan hasil uji normalitas a. Deskripsi Data Panjang Tungkai Bawah
Pengukuran panjang tungkai bawah dilakukan pada hari ke-8 saat tikus berumur 3 minggu dan hari ke 23 saat tikus berumur 5 minggu. Pada studi ini, pertambahan panjang tungkai dihitung dari selisih antara minggu ke-3 dengan minggu ke-5. Deskripsi data panjang tungkai bawah ditampilkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Deskripsi Rerata dan Standar Deviasi Panjang Tungkai (PT) minggu ke- 3, 5 dan selisih setiap subgroup
Subgroup N PT mg ke-3(cm) PT mg ke-5(cm) Selisih PT(cm)
A1 5 2,42±0,08 2,77±0,06 0,35±0,02
A2 5 2,37±0,04 2,75±0,02 0,38±0,02
A3 5 2,43±0,08 2,91±0,03 0,48±0,05
A4 5 2,40±0,03 2,81±0,04 0,41±0,01
B1 5 2,34±0,04 2,67±0,03 0,33±0,01
B2 5 2,40±0,05 2,82±0,01 0,42±0,04
B3 5 2,41±0,04 2,93±0,01 0,52±0,03
B4 5 2,43±0,03 2,83±0,04 0,40±0,01
Sumber: Data primer, 2017
b. Deskripsi Data Jumlah Kondrosit dan Volume Cakram Epifise
Deskripsi kondrosit di cakram epifise yang meliputi jumlah sel kondrosit dan volume cakram epifise ditampilkan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Rerata ± Standard Deviasi Jumlah Sel Kondrosit dan Volume Cakram Epifise setiap Subgrup
Kontrol GV20 ST36 GV20+ST36
Sel
10 hari 515641±22710 652764±254 94
670985±8995 625632±10849
15 hari 510986±37637 602357±167 53
643055±19822 621376±16108
Volume
10 hari 6,35E+09±1,39 E+09
7,21E+09±1, 52E+09
8,75E+09±1,82E +09
7,42E+09
±2,35E+09 15 hari 5,19E+09±1,29
E+09
5,93E+09±1, 57
7,99E+09±2,76E +09
6,45E+09±1,04E +09 Sumber: Data Primer 2017
c. Deskripsi Data Konsentrasi Ghrelin dan IGF-1
Data yang diperoleh dari pemeriksaan molekuler menggunakan Elisa ditampilkan dalam satu tabel, dan hasilnya bisa dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Rerata dan Standard Deviasi Kadar IGF-1 (ng/ml) dan Ghrelin (pg/ml) setiap Subgrup
Kontrol GV20 ST36 GV20+ST36
IGF-1
10 hari 615,30 ±95,37 494,62±53,83 831,37±81,43 778,10±97,16 15 hari 536,05±128,39 460,96±56,00 778,67±65,88 770,49±34,34 Ghrelin
10 hari 287,17±118,82 245,77±41,48 296,02±122,90 327,13±24,26 15 hari 209,15±61,00 201,26±74,27 312,54±159,85 395,10±140,68 Sumber: Data Primer 2017
d. Hasil Uji Normalitas semua Variabel Penelitian
Uji normalitas data mengajukan hipotesis nihil bahwa distribusi data variabel itu normal dan hipotesis alternatif bahwa distribusi data variabel itu tidak normal. Hasil pengujian normalitas terhadap variabel selisih panjang tungkai bawah, jumlah kondrosit, volume cakram epifise dan ghrelin pada sebagian subgrup sampelnya menunjukkan bahwa nilai p< 0,05, yang berarti distribusi data adalah tidak normal.
Sebaliknya, hasil pengujian normalitas terhadap variabel IGF-1 pada setiap subgrup sampel menunjukkan nilai p>0,05 yang berarti distribusi data variabel adalah normal.
Hasil uji normalitas data pada semua subgrup dirangkum dalam satu tabel dan disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil Uji Normalitas (p atau signifikansi) Saphiro Wilks pada setiap variabel pada grup
Grup N Selisih
PT (p)
Jumlah kondrosit (p)
Volume C.Epifis e (p)
IGF- 1(p)
Ghrelin (p) A1
A2 A3 A4 B1 B2 B3
5 5 5 5 5 5 5
0,119 0,006 0,086 0,005 0,754 0,006 0,492
0,998 0,812 0,149 0,875 0,555 0,003 0,462
0,650 0,414 0,026 0,027 0,045 0,285 0,321
0,868 0,553 0,452 0,100 0,337 0,292 0,885
0,376 0,110 0,037 0,670 0,784 0,804 0,875
B4 5 0,144 0,214 0,299 0,573 0,652
Sumber; Data primer, 2017
4. Hasil Analisis Statistik Perlakuan Laserpunktur Terhadap Variabel Penelitian
Pertumbuhan memanjang tulang pada penelitian ini bisa dilihat dari perubahan marker variabel seperti adanya peningkatan panjang tungkai bawah, jumlah kondrosit cakram epifise, kadar ghrelin serum, dan kadar IGF-1 serum.
a. Analisis Statistik Efek Laserpunktur Terhadap Panjang Tungkai Bawah
Untuk mengetahui efek laserpunktur terhadap panjang tungkai bawah dilakukan analisis statistik dengan menggunakan uji beda rerata antar subgrup. Karena data terdistribusi tidak normal, digunakan uji Kruskal-Wallis, dan hasilnya menunjukkan adanya perbedaan yang tidak signifikan pada grup A (p=0,06), sedangkan pada grup B terdapat perbedaan yang signifikan (p=0,007). Uji Post hoc dengan menggunakan Mann-Whitney diperoleh hasil yaitu terdapat perbedaan yang signifikan antara subgrup B1 dengan B3 (p=0,005).
Gambar 16. Rerata pertambahan panjang tungkai tikus putih setiap subgrup.
Nilai pertambahan panjang diambil dari selisih pengukuran PT antara minggu ke-5 dengan minggu ke-3. Tanda * mengandung arti bahwa ada peningkatan yang bermakna secara signifikan antara subgrup ST36 15 hari dengan C 15 hari.
b. Hasil Analisis Statitik Efek Laserpunktur Terhadap Jumlah Kondrosit Cakram Epifise
Setelah data didapatkan dan dihimpun dilakukan analisis statistik. Untuk mengetahui efek laserpunktur terhadap jumlah kondrosit cakram epifise dilakukan uji beda terhadap rerata subgrup dengan menggunakan Kruskal Wallis karena data terdistribusi tidak normal. Hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan dengan nilai p=0,00. Uji Mann Whitney menunjukkan adanya perbedaan antara A1 dengan A2 (p=0,00), A1
Pemberian laserpunktur LA 0,3 J/cm2 setiap hari sekali selama 10x (A2,3,4) dan 15 x (B2,3,4), mulai hari ke-8 sampai hari ke-18 dan 23. Hari ke-8 ukur panjang tungkai ke-
1, hari ke23 ukur panjang tungkai ke-2
dan A3 (p=0,00), dan A1 dengan A4 (p=0,00). Pada grup B juga menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antara subgrup B1 dengan B2 (p=0,00), B1 dengan B3 (p=0,00) dan B1 dengan B4 (p=0,00). Tidak ada perbedaan yang signifikan antara grup A dengan B (p=1,00).
Gambar 17. Rerata jumlah kondrosit pada cakram epifise di setiap subgrup.
C=A1 dan B1; GV20= A2 dan B2; ST36= A3 dan B3; dan GV20+ST36=
A4 dan B4. Tanda * menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antara kedua subgrup.
Pada penghitungan sel kondrosit dibedakan 2 tipe sel, yaitu kondrosit proliferasi dan kondrosit hipertrofi. Kondrosit proliferasi ditandai dengan bentuk sel yang pipih dan terkadang terlihat sedang mengalami pembelahan mitosis dimana sel ini terletak membentuk suatu kolom yang sejajar dengan aksis longitudinal tulang, sedangkan sel hipertrofi ditandai dengan bentuk sel yang membulat dan sel tertanam dalam lacuna. Sel hipertrofi dihitung sampai satu sel di atas invasi pembuluh darah.
Kemudian dilihat proporsi jumlah kondrosit proliferasi dan hipertrofi seperti yang terlihat pada gambar (Gambar 17). Dari gambar tersebut dapat dilihat bahwa proporsi sel proliferasi dan hipertrofi antara 61% sampai 68% untuk sel proliferasi dan 29% sampai 34%
untuk hipertrofi. Tidak ada perbedaan yang bermakna antara
kelompok kontrol dan perlakuan. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara proporsi semua subgrup (p=1,00).
Gambar 18. Perbandingan Gambaran Sel Kondrosit Cakram Epifise pada Grup Perlakuan. A1= K; A2= GV20; A3=ST36; dan A4= GV20+ST36 Gambaran sel kondrosit pada cakram epifise. Pada kelompok A1 terlihat
gambaran sel proliferasi dan hipertrofi yang kurang padat dibandingkan dengan kelompok lainnya, yang merupakan kelompok perlakuan.
c. Hasil Analisis Statistik Efek Laserpunktur Terhadap Volume Cakram Epifise
Gambar 19. Grafik yang menggambarkan rerata volume cakram epifise di setiap subgrup.
Pemeriksaan volume cakram epifise menggunakan teknik nukleator dan prinsip Cavalieri. Penilaian dengan uji statistik Kruskal Wallis menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara subgrup, baik pada grup A maupun grup B. Grafik di atas memperlihatkan adanya kecenderungan peningkatan pada subgrup perlakuan dengan peningkatan tertinggi pada subgrup yang mendapatkan laserpunktur pada titik ST36, tetapi secara statitik tidak bermakna.
d. Hasil Analisis Statistik Efek Laserpunktur Terhadap Kadar IGF-1 Dalam Serum
Grafik memperlihatkan perubahan konsentrasi IGF-1 pada setiap subgrup. Pada subgrup tikus yang mendapatkan stimulasi laser pada titik GV20 terjadi penurunan rerata kadar IGF-1 dari 615,3 ng/ml (A) dan 636,05 ng/ml (B) turun menjadi 494,52 ng/ml (A, turun sekitar 19,63%) dan 460,96 ng/ml (B, turun sekitar 14,01%).
Sementara itu, stimulasi laser pada titik ST36 dan kombinasi titik GV20 dan ST36 di kedua grup A dan B menyebabkan peningkatan rerata kadar IGF-1. Rerata kadar IGF-1 pada subgrup A adalah 831,37
ng/ml dan 778,09 ng/ml (naik sekitar 35,12% dan 26,45%), dan pada subgrup B adalah 778,72 ng/ml dan 770,49 ng/ml (naik sekitar 45,21% dan 43,73%). Peningkatan tertinggi terlihat pada subgrup yang mendapatkan laser pada titik ST36. Kelompok 15 hari menunjukkan peningkatan yang lebih besar dibandingkan 10 hari.
Hasil uji ANOVA satu arah memperlihatkan adanya perbedaan yang signifikan baik pada grup A dan B (p=0,00; p=0,00), maka dilanjutkan dengan uji Post hoc. Uji Bonferroni menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang tidak signifikan antara subgrup kontrol (A1) dengan grup perlakuan (A2, A3 dan A4), dan perbedaan yang signifikan antara subgrup A2 dengan A3 (p=0,00) dan A2 dengan A4 (p=0.00). Pada grup laser 15 hari (B), terdapat perbedaan yang signifikan antara subgrup B1 dengan B3 (p=0,001), B1 dengan B4 (p=0,002), B2 dengan B3 (p=0,00), dan B2 dengan B4 (p=0,00).
Perbedaan juga didapatkan pada subgrup A2 dengan B3 dan B4 (p=0,00). Hasil statistik secara lngkap bisa dilihat pada lampiran.
Gambar 20. Grafik yang menunjukkan rerata konsentrasi IGF-1 setiap subgrup. C=A1 dan B1; GV20= A2 dan B2; ST36=A3 dan B3; dan GV20+ST36= A4 dan B4. Tanda * menandakan adanya perbedaan yang
signifikan antara kedua subgrup.
e. Hasil Analisis Statistik Efek Laserpunktur Terhadap Kadar Ghrelin Serum
Analisis statistik dilakukan untuk melihat perbedaan rerata kadar ghrelin antara subgrup dengan menggunakan uji Kruskal Wallis karena data terdistribusi tidak normal. Hasil Uji Kruskal Wallis memperlihatkan adanya perbedaan yang tidak signifikan antara setiap subgrup baik grup A dan grup B (p=0,06).
Gambar 20 memperlihatkan adanya perubahan dengan tren yang berbeda pada tikus yang distimulasi dengan laserpunktur. Pada subgrup tikus yang mendapatkan stimulasi laser pada titik GV20 terjadi penurunan rerata kadar ghrelin dari 287,169 pg/ml (A) dan 209,154 pg/ml (B) turun menjadi 245,768 ng/ml (A, turun sekitar 14,42%) dan 201,257 pg/ml (B, turun sekitar 3,77%). Sementara itu, stimulasi laser pada titik ST36 dan kombinasi titik GV20 dan ST36 di kedua grup A dan B menyebabkan peningkatan rerata kadar ghrelin.
Rerata kadar ghrelin pada subgrup A adalah 296,024 pg/ml dan 327,134 pg/ml (naik sekitar 3,09% dan 13,92%), dan pada subgrup B adalah 312,536 pg/ml dan 395,098 pg/ml (naik sekitar 21,63% dan 88,90%). Peningkatan tertinggi terlihat pada subgrup yang mendapatkan laser pada titik kombinasi GV20+ST36.
Gambar 21. Grafik yang menunjukkan rerata konsentrasi Ghrelin setiap subgrup. C=A1 dan B1; GV20= A2 dan B2; ST36=A3 dan B3; dan
GV20+ST36= A4 dan B4.
5. Hubungan Antar Variabel
Untuk melihat adanya hubungan antar variabel di kelompok A dan di kelompok B, dilakukan uji korelasi. Pada kelompok A, hasilnya memperlihatkan adanya hubungan yang positif dan signifikan antara IGF-1 dengan panjang tungkai (r=0,6; p=0,009), dan antara jumlah sel dengan panjang tungkai (r=0,6; p=0,01). Sementara itu pada kelompok B menunjukkan adanya korelasi yang positif dan signifikan, berturut-turut antara kadar IGF-1 dengan panjang tungkai (r=0,4; p=0,05), IGF-1 dengan jumlah sel (r=0,6; p=0,004), kadar IGF-1 dengan volume cakram epifise (r=0,7; p=0,001). Terlihat pula ada korelasi yang positif dan signifikan antara jumlah sel dengan panjang tungkai (r=0,5; p=0,006) dan jumlah sel dengan volume cakram epifise (r=0,7; p=0,00). Korelasi antara ghrelin dengan panjang tungkai dan jumlah kondrosit memperlihatkan adanya hubungan yang postif tetapi tidak sekuat bila dibandingkan dengan IGF-1.
B. Pembahasan.
Penggunaan laser sebagai salah satu teknik pengobatan dalam menggantikan jarum akupunktur mulai dilakukan secara luas dan tersebar di hampir seluruh dunia karena tidak menimbulkan rasa nyeri, tidak menimbulkan rasa takut dan lebih terukur dosisnya. Keberadaan laser yang dirangsangkan ke tubuh akan mengoptimalisasi proses anabolisme yang sedang terjadi. Bagaimana pengaruh laserpunktur terhadap pertumbuhan khususnya pertumbuhan tinggi badan yang dipresentasikan dalam pertumbuhan tulang bisa dideteksi dari beberapa pemeriksaan berikut ini:
a. Makroanatomi, dilakukan pemeriksaan panjang tungkai bawah tikus adolesen dengan cara mengukur secara langsung dengan menggunakan jangka sorong merek Mitutoyo.
b. Stereologi, dilakukan pemeriksaan terhadap gambaran histologi cakram epifise dengan menghitung jumlah sel kondrosit proliferasi dan kondrosit hipertropi di dalam cakram epifise serta volume cakram epifise.
c. Molekuler, dilakukan pemeriksaan terhadap faktor pertumbuhan IGF-1 dalam serum dan hormon lapar yang dikenal sebagai sekretagog
hormon pertumbuhan, yaitu Ghrelin dalam serum yang dinilai dengan Elisa. Kedua protein di atas dikenal sebagai regulator sistemik yang berpengaruh pada pertumbuhan.
1. Panjang Tungkai Bawah
Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan panjang tungkai bawah tikus pada minggu ke-3 yang pada saat tersebut mulai dilakukan pemberian laser sampai pada minggu ke-5 saat laser diakhiri. Usia 5 minggu merupakan usia pubertas dimana terjadi pertumbuhan fisik yang cepat. Selisih panjang tungkai antara minggu ke-5 dengan minggu ke-3 dianggap sebagai pertambahan panjang tungkai. Hasil pemeriksaan pada penelitian ini menunjukkan adanya perbedaan pertambahan panjang tungkai pada tikus yang distimulasi laser. Pada grup yang distimulasi laser selama 15 hari mempunyai pertambahan panjang yang lebih besar dibandingkan grup 10 hari. Sementara itu, untuk pemilihan titiknya, subgrup yang distimulasi di titik ST36 mempunyai pertambahan yang paling besar diikuti dengan subgrup kombinasi GV20 dan ST36 dan subgrup GV20 apabila dibandingkan dengan subgrup kontrol.
Sesuai dengan teori, laser akan mempengaruhi area lokal titik akupunktur dengan meningkatkan ATP dan ROS yang diterima sebagai rangsang aferen untuk diteruskan ke segmen dan sentral sehingga mempengaruhi sistem tubuh. Pada penelitian ini menunjukkan bahwa laser meningkatkan panjang tungkai bawah secara signifikan hanya pada B3.
Subgrup ini adalah tikus yang mendapatkan laser pada titik ST36 selama pemberian 15 hari. Kemungkinan hal ini terjadi karena ST36 terletak di proksimal tibia sehingga secara langsung mempengaruhi kondisi lokal di sekitar tibia. Kemungkinan yang ke-dua, secara tradisional titik ST36 dikenal sebagai titik pertumbuhan sehingga mampu merangsang pertumbuhan tulang tibia tikus namun mekanisme bagaimana terjadinya pertumbuhan akibat perangsanagan di titik ini belum sepenuhnya diketahui.
Penelitian Yeom et al (2013), menunjukkan bahwa laser pada titik ST36 dan SP6 meningkatkan panjang tibia tikus secara bermakna. Pada
penelitiannya, Yeom et al menyuntikkan tetrasiklin secara intraperitoneal pada hari yang berbeda kemudian dilihat jarak pita tetrasiklin yang mengendap di cakram epifise proksimal tulang tibia yang diperiksa secara mikroskopis. Pada penelitian ini, panjang tibia tidak diperiksa secara tersendiri tetapi dinilai dari hasil pengukuran keseluruhan tungkai dan persendian lutut yang berisi kedua cakram epifise proksimal dan distal.
Meskipun berbeda, penelitian ini memperlihatkan hasil yang sama yaitu peningkatan panjang tulang.
2. Jumlah kondrosit di cakram epifise
Kondrosit di cakram epifise selalu mengalami perubahan dari deferensiasi kondrosit di zona resting, kemudian proliferasi dan hipertrofi.
Juga, kondrosit yang sedang berubah tersebut memproduksi matriks ekstraseluler dan beberapa hormon yang bersifat parakrin atau otokrin.
Keseluruhan kompleksitas dari deferensiasi, proliferasi, hipertrofi dan produksi matriks ekstraseluler mempengaruhi pertumbuhan memanjang tulang sampai akhirnya pertumbuhan berhenti.
Penelitian ini menunjukkan bahwa laserpunktur meningkatkan jumlah kondrosit proliferasi dan hipertrofi. Pemberian laser baik yang diberikan selama 10 hari dan 15 hari dengan densitas energi 0,3J/cm2 per harinya meningkatkan jumlah kondrosit secara signifikan. Peningkatan terjadi baik pada kondrosit proliferasi dan hipertrofi. Proporsi kondrosit proliferasi/hipertrofi tidak ada perbedaan yang bermakna antara grup kontrol dengan grup perlakuan. Yeoum, 2013 pada penelitiannya menunjukkan bahwa jumlah sel hipertropi meningkat. Penelitian lain mengatakan bahwa yang mempengaruhi panjang tulang adalah volume kondrosit hipertrofi, tetapi pada penelitian ini tidak dilakukan.
Berdasarkan teori, laser yang diarahkan ke titik akupunktur akan menstimulasi jaringan dengan adanya ikatan biophotoreceptor di dalam mitokondria yang selanjutnya akan mengaktivasi serangkaian kejadian.
Pada awalnya, sitokrom C oksidase dalam mitokondria yang diketahui sebagai photoreceptor menyerap cahaya infra merah pendek dengan panjang gelombang antara 600 sampai 1000 nm dan berdaya 5 sampai 500
mW dan mengaktivasi kaskade biokimia sehingga dimungkinkan memiliki efek fotobiostimulasi (Hu et al., 2013). Efek fotobiostimulasi kemudian memodulasi aktivitas sel-sel tubuh, seperti peningkatan produksi ATP, modulasi ROS (Reactive Oxygen Species), dan induksi faktor transkripsi sehingga meningkatkan proliferasi dan migrasi sel, memodulasi kadar sitokin, faktor pertumbuhan, dan mediator inflamasi, serta meningkatkan oksigenasi jaringan (Hamblin, 2016; Khalid, 2016).
Apabila fotobiostimulasi ini terdapat pada titik akupunktur ST36 dan GV20, akan menstimulasi area lokal di bawah lutut, kemudian stimuli ini akan dibawa serabut sarat menuju segmen lumbal yang akan mempengaruhi sistem syaraf otonom di organ viscera abdomen. Sementara itu, sebagian stimuli diteruskan menuju ke otak yang akan mempengaruhi hipothalamus hipofise.
Mekanisme bagaimana laserpunktur bisa meningkatkan jumlah kondrosit belum bisa diterangkan secara jelas. Kemungkinan adalah dengan melalui mekanisme hormonal lewat jalur GH-IGF-1 axis.
Beberapa penelitian menyebutkan bahwa akupunktur meningkatkan hormon pertumbuhan dan faktor pertumbuhan (Yi Feng et al., 2008; O YI et al., 2012; Victorian et al., 2000). Hormon pertumbuhan GH merangsang produksi IGF-1 oleh hepar seterusnya IGF-1 akan mempengaruhi proses osifikasi endokondral dengan meningkatkan proliferasi kondrosit di cakram epifise (Robson et al., 2002).
Agak berbeda dengan penelitian yang sudah ada, penilaian jumlah kondrosit pada studi ini dilakukan dengan metode fraksionator fisik, Khalid,2016
sehingga sel proliferasi dan hipertrofi di seluruh bagian cakram epifise bisa dihitung. Metode Stereologi menawarkan suatu bentuk pendekatan yang praktis dan secara ilmiah valid untuk mendapatkan perkiraan kuantitatif suatu struktur jaringan. Berbeda dengan metode tradisional 2-D, metode design-based stereology bergantung pada prinsip sampling statistik dan teori geometris stokastik untuk memperkirakan parameter kuantitatif objek geometris 3-Dimensi seperti struktur jaringan yang kompleks. Prinsip statistik dan matematis yang digunakan dalam stereologi menjamin bahwa tidak ada asumsi atau bias dalam analisis. Metode stereologis telah berevolusi menjadi praktis dan efisien karena kemajuan gabungan dalam teori stereologis, teknik pengambilan sampel, perangkat lunak, dan perangkat pencitraan. Kekuatan ilmiah design-based stereology adalah bahwa, jika dilakukan dengan benar akan menjamin perkiraan struktur kuasi yang akurat (tidak bias) dan tepat (Boyce, et al., 2010).
3. Kadar IGF-1 serum
Hormon pertumbuhan IGF-1 diproduksi oleh hepar karena stimulasi dari GH. Berbeda dengan GH yang dihasilkan secara fluktuatif oleh hipofise anterior, IGF-1 diproduksi setiap saat oleh hepar sehingga keberadaannya di dalam peredaran darah bisa mencerminkan kadar yang sebenarnya.
Akupunktur dan elektroakupunktur (EA) di titik ST36 dan KI3 meningkatkan kadar IGF-1 serum dan IGF-1 jaringan ginjal pada tikus model gagal ginjal, dimana EA meningkatkan lebih tinggi dibandingkan dengan akupunktur (Oh YI et al., 2012). EA juga meningkatkan kadar IGF-1 secara signifikan pada tikus model osteoporosis dengan ovarectomy (Yi Feng et al., 2008), sedangkan laserpunktur pada titik ST36 dan SP6 meningkatkan kadar IGF-1 pada tikus adolesen (Yeom et al., 2013).
Pada penelitian ini didapatkan bahwa kadar IGF-1 mengalami penurunan dan peningkatan sesuai dengan titik yang distimulasi. Stimulasi laser di titik GV20 pada lama pemberian 10 hari dan 15 hari keduanya menurunkan kadar IGF-1, tetapi secara statistik tidak bermakna, sedangkan stimulasi pada titik ST36 dan kombinasi GV2-+ST36
meningkatkan kadar IGF-1 serum. Peningkatan terjadi secara signifikan pada grup yang diberi perlakuan 15 hari. Peningkatan kadar IGF-1 paling tinggi terdapat pada subgrup yang diberikan laser di titik ST36 disusul dengan subgrup kombinasi GV20+ST36. Pemberian laser selama 10 hari meningkatkan produksi IGF-1 serum tetapi tidak signifikan.
Beberapa penelitian menyebutkan bahwa rangsang yang disebabkan akupunktur bisa mengaktivasi pusat otonom dan hipotalamo-pituitary- adrenal (HPA) axis, oleh karena itu akan memelihara keseimbangan dan meningkatkan efisiensi beberapa sistem tubuh organisme (Villas Boas et al., 2015; Eshkevari et al., 2007)). Akupunktur juga mampu mempengaruhi jalur Hipothalamus-Pituitary-Ovarium (HPO axis) pada pasien anovulatori (Eshkevari et al., 2007; Victorian et al., 2007; Cochrane et al., 2014). Dengan demikian, apabila akupunktur mengaktivasi jalur HPA axis, dan mempengaruhi HPO axis, kemungkinan akan juga bisa mempengaruhi jalur Hipothalamus-Pituitary-Somatomedin axis.
Namun demikian, pada penelitian ini tidak semua subgrup mengalami peningkatan kadar IGF-1. Tikus yang mendapatkan stimulasi laser di titik GV20 mempunyai kadar IGF-1yang lebih rendah dibandingkan kontrol. Titik akupunktur GV20 terletak pada puncak kepala. Laser yang distimulasikan ke titik ini akan menembus tulang kranium sebelum akhirnya diteruskan secara langsung menuju otak.
4. Kadar ghrelin serum
Ghrelin yang dikenal sebagai hormon lapar, merupakan suatu hormon peptida yang dihasilkan terutama oleh gaster dan dikenal sebagai secretagogue GH. Protein ini berperan dalam meningkatkan sekresi GH, masukan makanan dan penambah berat badan ketika diberikan di perifer maupun sentral. Terjadinya peningkatan nafsu makan yang disebabkan karena ghrelin, baik pada tikus dan manusia adalah melalui mekanisme perangsangan pusat makan di hipothalamus. Ghrelin yang berasal dari gaster mencapai hipothalamus melalui sirkulasi darah dan mencapai bagian ventral nukleus arcuatus, tetapi jalur utamanya melalui serabut aferen n.vagus yang memberi innervasi mukosa gaster. Peran ghrelin yang
lain yaitu memelihara keseimbangan energi dengan cara mengirim signal neuroendokrin dari gaster menuju otak (Garcia-Garcia et al., 2014; Kojima et al., 2005).
Pengaruh akupunktur terhadap konsentrasi ghrelin telah dilaporkan oleh beberapa sumber. Gucel et al (2012) meneliti efek ghrelin pada obesitas, dimana terjadi peningkatan ghrelin dan penurunan berat badan pada wanita obes. Studi yang lain (Liu et al., 2015) meneliti efek akupunktur titik ST36, ST21, dan SP6 terhadap motilitas gaster dan kadar ghrelin di anthrum pilori, dimana penelitian tersebut menunjukkan adanya peningkatan kadar ghrelin.
Pada penelitian ini didapatkan adanya penurunan dan peningkatan produksi ghrelin pada subgrup perlakuan dibandingkan dengan kontrol.
Pada subgrup yang distimulasi laser pada titik GV20 mengalami sedikit penurunan dibandingkan dengan kontrol, sedangkan pada subgrup yang mendapatkan stimulasi di titik ST36 dan kombinasi titik GV20 dan ST36 mengalami peningkatan. Peningkatan tertinggi terjadi pada subgrup yang mendapatkan rangsang laser di titik kombinasi GV20+ST36. Namun demikian, secara statistik perubahan kadar ghrelin yang terlihat pada studi ini adalah tidak signifikan.
Mekanisme bagaimana laserpunktur mempengaruhi kadar ghrelin dalam serum belum diketahui secara jelas. Beberapa teori menyebutkan bahwa rangsangan lokal adalah stimulan yang diterima reseptor dan diteruskan oleh sistem saraf menuju organ viscera sebagai efek segmental dan menuju ke otak sebagai efek sentral (Villas-Boas et al., 2015). Organ viscera, yaitu gaster dan intestinal melalui sistem otonom akan meningkat motilitasnya. Sementara itu, Nukleus Tractus Solitarius (NTS) yang terletak di batang otak berperan sebagai estafet utama untuk informasi visceral dari kardiovaskular, pernafasan dan sistem gastrointestinal. Studi terbaru menunjukkan bahwa NTS juga menerima rangsang aferen somatik.
Stimulasi somatik yang disebabkan oleh akupunktur disampaikan kepada NTS. NTS berdekatan dengan nukleus dorsalis motor vagi (DMV) dan keduanya menyusun vagal dorsal complex (DVC). DVC mengintegrasikan
refleks vago-vagal yang memainkan peran utama dalam pengaturan fungsi motorik gastrointestinal (Yoshimoto, 2012). Juga disebutkan bahwa akupunktur pada titik ST36 merangsang motilitas gaster melalui vagal eferen, sementara itu ST25 menghambat motilitas gaster melalui simpathis eferent (Iwa et al., 2007). Pada penelitian ini, pemberian laser di titik GV20 menurunkan kadar ghrelin walaupun secara statistik tidak signifikan.
Apakah ghrelin mempunyai pengaruh terhadap pertambahan panjang tungkai dan jumlah kondrosit cakram epifise? Secara teori, ghrelin merupakan secretagogue GH yang mempunyai Secretegogue GH-reseptor (SGH-R) di hypothalamus. Interaksi antara ghrelin-SGH-R menyebabkan suatu mekanisme berturutan sehingga terjadi pelepasan GH oleh hipofise anterior. Berikutnya, melalui GH-IGF-1 axis mempengaruhi proliferasi sel kondrosit di cakram epifise dan berefek pada peningkatan panjang tungkai.
Penelitian ini menunjukkan bahwa subgrup yang mendapatkan stimulasi laser di titik GV20 mengalami penurunan kadar ghrelin tetapi panjang tungkai dan jumlah kondrosit cakram epifise mengalami peningkatan, sedangkan subgrup perlakuan lain mengalami peningkatan baik ghelin maupun panjang tungkai dan jumlah kondrositnya.
Kemungkinannya adalah adanya faktor selain IGF-1 yang mempengaruhi jumlah kondrosit dan cakram epifise. Oleh karenanya diperkirakan laserpunktur juga mempengaruhi hipothalamus-hipofise-gonadotropin axis pada usia adolesen, dengan meningkatkan produksi testosteron yang selanjutnya mempengaruhi cakram epifise.
5. Hubungan IGF-1, Ghrelin, Panjang Tungkai Bawah dan Jumlah Kondrosit Cakram Epifise
Sering dilakukan penelitian secara bersamaan bagaimana pengaruh kadar ghrelin dan IGF-1 terhadap panjang tulang karena kedua protein tersebut mempengaruhi produksi GH. Pada penelitian ini juga dilakukan analisis antara hubungan ghrelin dan IGF-1 terhadap panjang tungkai dan jumlah kondrosit.
Dalam penelitian ini panjang tungkai bawah pada subkelompok perlakuan meningkat dibandingkan dengan kontrol dengan peningkatan tertinggi pada subkelompok ST36 dengan stimulasi laser 15 hari. Ini berbeda dengan konsentrasi ghrelin dan IGF-1, di mana LA memberikan pengaruh berupa penurunan atau peningkatan kadarnya sesuai dengan titik akupunktur yang distimulasikan. Dalam subkelompok GV20, terjadi penurunan konsentrasi Ghrelin dan IGF-1, sedangkan di subkelompok lainnya terlihat adanya peningkatan. Peningkatan tertinggi konsentrasi IGF-1 terjadi di subkelompok ST36 sedangkan peningkatan tertinggi konsentrasi ghrelin terjadi pada subkelompok kombinasi GV20+ST36.
Data di atas memperlihatkan bahwa kadar ghrelin yang tinggi di subkelompok kombinasi tidak terlalu berpengaruh terhadap panjang tungkai dibandingkan dengan kadar IGF-1, yang ditunjukkan oleh peningkatan kadar ghrelin yang sangat tinggi tetapi panjang tungkai bawahnya tidak terlalu meningkat. Ini hampir identik dengan Carmudan et al, yang menunjukkan bahwa ada korelasi negatif antara konsentrasi ghrelin dan IGF-1 pada remaja bertubuh pendek, di mana IGF-1 mempengaruhi massa tulang sementara ghrelin tidak mempengaruhinya.
Kami memperkirakan bahwa pertumbuhan memanjang tulang lebih dipengaruhi oleh kadar IGF-1 dibandingkan dengan kadar ghrelin.
6. Titik Akupunktur dan Lama Stimulasi
Pada penelitian ini, stimulasi pada titik akupunktur yang berbeda menghasilkan efek yang berbeda pula walaupun secara statistik tidak bermakna. GV20 adalah titik akupunktur yang terletak di puncak kepala sedangkan ST36 adalah titik yang terletak di tibia proksimal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa stimulasi laser pada titik akupunktur GV20 mempunyai efek yang lebih rendah dibandingkan dengan stimulasi pada titik ST36.
Tidak diketahui dengan jelas bagaimana laser pada GV20 menurunkan kadar ghrelin dan IGF-1. Begitu pula pengaruhnya terhadap panjang tungkai dan jumlah kondrosit, laser pada titik GV 20 lebih rendah dibandingkan laser pada titik ST36. Disebutkan dalam Hamblins (2016)
bahwa penetrasi laser dengan panjang gelombang 600 – 900 nm di area frontal mencapai 21% (pada tikus) dan mengenai otak secara langsung untuk selanjutnya terjadi serangkaian proses yang bisa bermanfaat bagi berbagai keadaan ganguan otak (gambar).
Gambar 22. Mekanisme molekuler dan intraseluler dari laser level redah melalui transcranial. AP1= ativator protein 1; Ca2+= calcium ions; cAMP=cyclic adenosin monophospat; NF-KB=nuclear factor Kappa B; NO= nitric oxide; ROS= reactive oxigen
species; TRPF= transiet receptor potential vaniloid (Hamblin, 2016)
Gambar 23. Proses yang terjadi pada jaringan setelah stimulasi LLLT dan beberapa manfaatnya terhadap gangguan otak. BDNF= brain derived neurotropic factor; LLLT=
low level laser therapy; NGF=nerve growth factors; NT-3= neurotrophin-3; PBM=
photobiomudulation; SOD= superoxide dimustase (Hamblin, 2016).
Dari gambar di atas terlihat bahwa gelombang elektromagnetik dari laser menembus cranium, yang merupakan tulang padat sehingga transmisi terpusat dan absorbsinya lebih besar. Hal ini berbeda dengan tungkai bawah yang berisi jaringan lunak sehingga gelombang yang diterima menyebar dengan absorbsi yang lebih rendah.
Dalam kaitannya dengan besarnya dosis laser yang diberikan, bahwa ada Arndt-Schultz Law (Khalid, 2016) yang menyebutkan small dose stimulate, medium dose inhibit and large dose terminate. Kenapa pemberian laser di titik GV20 menurunkan kadar IGF-1 (dan kadar ghrelin), kemungkinannya adalah karena dosis yang diberikan lebih besar sehingga memberikan efek menghambat. Pemilihan dan kombinasi titik juga mempengaruhi hasil pemeriksaan. Sangat menarik bahwa stimulasi pada titik GV20 menurunkan kadar IGF-1 sedangkan kombinasi GV20+ST36 meningkatkan kadarnya dengan peningkatan tertinggi pada subgrup ST36. Sedangkan terhadap kadar ghrelin, peningkatan tertinggi pada kombinasi GV20+ST36 dengan peningkatan paling timggi pada grup 15 hari. Peneliti belum menemukan kenapa dan bagaimana mekanismenya.
7. Pendekatan Prinsip Aksiologi
Saat ini praktek akupunktur sudah dan masih digunakan serta dirasakan manfaatnya oleh masyarakat, baik sebagai upaya pencegahan, pengobatan maupun pemulihan kembali dari suatu penyakit. Akupunktur juga sudah dipraktekkan sebagai terapi komplementer untuk peningkatan tinggi badan pada anak remaja, namun masih perlu banyak bukti ilmiah bagaimana mekanisme kerja, efektivitas dan keamanan dari metode ini sehingga metode ini dapat diterima.
Berdasarkan prinsip aksiologi, keseluruhan manfaat hasil penelitian ini adalah:
a. Pembuktian secara ilmiah bahwa laserpunktur mempunyai efek yang positif terhadap pertumbuhan tulang panjang melalui mekanisme jalur GH-IGF-1 axis.
b. Pembuktian secara ilmiah bahwa mekanisme kerja akupunktur dapat melalui banyak jalur.
c. Pembuktian secara ilmiah bahwa pada kondisi normal, pemberian laserpunktur merangsang dan bisa pula menghambat sesuai dengan titik yang dipilih tetapi penghambatan tidak sampai pada nilai yang ekstrim, yang ditunjukkan dengan uji statistik. Pemakaian
laserpunktur sebagai terapi fisik dapat dimanfaatkan sebagai promosi dan optimalisasi fungsi tubuh,
d. Kemanfaatan bagi peneliti lain tentang molekuler dan stereologi.
Diharapkan hasil penelitian ini dapat mendorong adanya penelitian selanjutnya dengan menilai marker yang berbeda guna penyempurnaan dengan kajian dan jalur yang lain.
8. Nilai Kebaruan
Nilai kebaruan suatu penelitian mencakup berbagai aspek, yang disajikan pada gambar .
Gambar 24. Aspek-aspek nilai kebaruan (Judajana dalam Purwanto, 2011)
Beberapa nilai kebaruan dalam penelitian ini adalah:
a Strategi baru. Penelitian ini memberikan informasi penggunaan laserpunktur untuk pertumbuhan dengan melihat jumlah sel kondrosit di cakram epifise. Metode penghitungan jumlah sel dalam penelitian menggunakan metode fraksionator fisik. Suatu penghitungan akurat dengan metode matematik yang masih langka dipakai.
b Perspektif baru. Walaupun perlakuan pada manusia sudah dilakukan, penggunaan hewan coba tetap dilakukan dan bertujuan untuk lebih mengeksplorasi penemuan yang mendukung mekanisme kerja.
Penelitian ini menggunakan hewan coba yang sedang mengalami Populasi 60
ekor tikus Wistar jantan
puncak pertumbuhan normal. Secara fisiologis, keseluruhan sistem dalam kondisi normal terjaga dalam keseimbangan yang baik. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian laserpunktur pada titik tertentu mempengaruhi sistem tubuh bila dilihat dari perubahan marker yang ada, namun perubahan di atas tidak sampai pada nilai yang ekstrim. Ini bisa dilihat dari hasil uji statistiknya. Penelitian lanjutan bisa dilakukan dengan menggunakan kondisi patologis untuk melihat efek teraputik laserpunktur.
c Solusi Baru.
Pada penelitian ini laser digunakan untuk menstimulasi suatu kondisi yang normal. Dengan adanya rangsang laser menjadikan kondisi normal menjadi lebih optimal tergantung dari dosis laser dan titik akupunktur yang dipilih.
9. Keterbatasan Penelitian
a. Keterbatasan pemeriksaan biomolekuler. Banyak faktor pertumbuhan dan hormon yang berperan dalam proses osifikasi endokondral di cakram epifise melalui berbagai jalur. Pada penelitian ini parameter molekuler yang diperiksa adalah kadar ghrelin dan IGF-1 serum.
Peneliti membatasi hanya dengan 2 hormon tersebut karena keduanya merupakan refleksi dari kadar GH. Apabila menggunakan penilaian kadar GH dapat menghasilkan nilai yang lebih nyata namun pemeriksaan GH lebih sulit dilakukan karena hormon ini diproduksi oleh hipofise anterior secara fluktuatif, sehingga memerlukan cara khusus.
b. Keterbatasan pemeriksaan stereologi. Pada penelitian ini, parameter stereologi yang digunakan adalah jumlah sel dan volume cakram epifise, perlu dilakukan penghitungan yang lain seperti volume sel hipertrofi. Volume cakram epifise sangat rentan terhadap penyusutan jaringan selama pemrosesan histologis sehingga harus dilakukan konversi penyusutannya. Namun hal ini sulit dilakukan
