7-Pertumbuhan Mikroba (Kultur Kontinyu Dan Perhitungan)

Mikrobiologi Laut

(Pertemuan Ketujuh)

PERTUMBUHAN MIKROBA

(Kultur Kontinyu dan Metode Pengukuran Pertumbuhan)

Dr.Ir. Arniati Massinai, M.Si

Jurusan Ilmu Kelautan

Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan

Unhas 2015

•

Kultur Kontinyu

• Metode Pengukuran

Pertumbuhan

• Kultivasi

mikroba

menggunakan

teknik

kultur

kontinyu/sinambung

, mikroba ditumbuhkan secara

terus menerus pada fase paling optimum untuk fase

pertumbuhan yaitu

fase eksponensial

dimana sel

membelah diri dengan

laju yang konstan

, massa

menjadi dua kali lipat mengikuti

kurva logaritmik.

• Hal ini dilakukan dengan memberi nutrisi secara terus

menerus sehingga mikroba tidak pernah kekurangan

nutrisi.

• Penambahan nutrisi/media segar ke dalam bioreaktor

dilakukan secara kontinyu, dimana dalam waktu

yang sama larutan yang berisi sel dan hasil produk

hasil metabolisme dikeluarkan dari media dengan

volume yang sama dengan substrat yang diberikan.

• Kondisi tersebut menghasilkan keadaan

yang

“STEDY

STATE”

dimana

pembentukan sel-sel baru sama dengan

sel-sel yang dikeluarkan dari fermentor.

• Pada kondisi steady state konsentrasi

nutrisi, konsentrasi sel, laju pertumbuhan

dan konsentrasi produk tidak berubah

walaupun waktu fermentasi makin lama

Kelebihan Kultur Kontinyu

• Produktivitas lebih tinggi, disebabkan lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor persatuan produk yang dihasilkan, laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol, pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur.

• Dengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya modal untuk fasilitas baru).

• Dapat dijalankan pada waktu yang lama.

• Cocok untuk proses yang kontaminasnya rendah dan produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan.

• Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana. • Tidak ada akumulasi produk yang menghambat.

Kelemahan Kultur Kontinyu

• Aliran umpan yang lama, resiko kontaminasi

besar

• Peralatan untuk operasi dan pengendalian

proses harus biasa tetap bekerja baik untuk

waktu yang lama.

• Memerlukan mikroba dengan kestabilan

genetik tinggi, karena akan digunkan pada

waktu yang lama (Irianto, 2007).

• Pertumbuhan bakteri dalam kultul kontinyu

(biak sinambung) tidak akan mengikuti kurva

pertumbuhan.

• Dalam pertumbuhan bakteri ini terdapat

prosedur yang menjadi dasar biak sinambung

yang dilakukan dalam

kemostat

dan

turbidostat

Pertumbuhan dalam kemostat

• Kemostat terdiri dari bejana biak yang dimasuki larutan biak dari bejana persediaan dengan kecepatan aliran tetap.

• Diusahakan dalam bejana biak terdapat pemasokan O2 secara optimum dan supaya selekas mungkin terjadi

distribusi merata dari nutrien yang dialirkan masuk sebagai larutan biak.

• Kecepatan pertambahan dinyatakan sebagai μx = dx/dt dan kerapatan bakteri meningkat dengan x = x0 e μ/t. • Biak dalam kemostat dikendalikan subtrat. Stabilitas

sistem ini berlandaskan keterbatasan kecepatan tumbuh oleh konsentrasi subtrat yang diperlukan pertumbuhan (donor H, sumber N, Sumber S, atau sumber P).

1. Bejana persediaan dengan filter keseimbangan (a) pipa pengisi (b)

2. Pompa peristaltik

3. Kemostat dengan penambah larutan biak (c),

pengaduk (d), filter udara masuk (e) dan pengambil cuplikan bahan (f)

4. Bejana penampung dengan filter udara keluar (g)

Gambar : Perinsip Biak sinambung dalam kemostat

a _b c d e f g 1 2 3 4

Kultur dalam Kemostat

Fig. The cell crop of a bacterial culture in chemostat

• Sistem ini didasarkan pada kerapatan bakteri tertentu atau kekeruhan tertentu yang dipertahankan konstan.

• Ada perbedaan mendasar antara biak statik klasik dengan biak sinambung dalam kemostat biak statik harus dilihat sebagai sistem tertutup (boleh disamakan dengan organisme sel, tahap stationer dan tahap kematian.

• Kalau pada biak sinambung merupakan sistem terbuka yang mengupayakan keseimbangan aliran untuk organisme selalu terdapat kondisi lingkungan yang sama.

• Dalam pertumbuhan sinkron akan terjadi sinkronisasi pembelahan sel.

• Sinkronisasi populasi sel dapat dicapai dengan berbagai tindakan buatan antara lain dengan merubah suhu rangsangan cahaya, pembatasan nutrien atau menyaring untuk memperoleh sel-sel yang sama ukurannya.

• Sinkronisasi pertumbuhan ini juga dimaksudkan untuk menyediakan stater dengan usia yang sama.

Kultur dalam turbidostat

Keterangan

1. penampungan medium steril

2. katub pengontrol aliran media

3. pengeluaran medium 4. Foto sel

5. Sumber cahaya 6. Turbistat

Bakeri berkembang biak dengan pembelahan

biner melintang.

1

2

2

2

₂

3

₂

4

₂

5

₂

n

Laju Pertumbuhan

N = No ² n

N = populasi akhir No = Populasi awal

Waktu Generasi

• Kecepatan pembelahan sel ditentukan dengan waktu generasi (generation time) atau waktu berganda (doubling time)

• Waktu Generasi (G) dapat dihitung dgn rumus: t G = ---n Lon N - Log No n = ---Log 2 Dimana : G = waktu generasi

t = waktu yg dibutuhkan dari jumlah No menjadi N

No = populasi awal

Contoh soal :

Jika 100 sel ditumbuhkan selama 5 jam

menghasilkan 1.720.320 sel berapa waktu

Figure 6.13

Kelompok Mikroba Waktu generasi (jam) Bakteri Heterotrofik Bacillus megaterium Escherichia coli Rhisobium meliloti Troponema allidum 0,58 0,28 1,80 34,0 Bakteri Fotosintetik Cholopseudomonas ethylicum Rhodpseudomonas spheroides Rhodospirillum rubrum 7,0 2,4 5,0 Khamir Saccharomyce cerevisiae 2,0 Protozoa Paramecium caudatum Stentor coureleus Tetrabyma geleti 10,5 32,0 3,0

Metode pengukuran pertumbuhan

• Perhitungan Jumlah Sel

– Hitungan Cawan

– Hitungan Mikroskopik

– MPN (Most Probable Number)

• Perhitungan Massa Sel secara Langsung

– Volumetrik – Gravimetrik – Turbidimetrik

• Perhitungan Massa Sel secara Tidak Langsung

– Analisa komponen sel (protein, AND, ATP, dsb)

– Analisis produk katabolisme (metabolit primer, metabolit skunder, panas)

– Analisis komsumsi nutrien (karbon, nitrogen, oksigen, asam amino, mineral, dsb)

PERHITUNGAN JUMLAH SEL : HITUNGAN CAWAN

Standard Plate Counts (SPC)

Total Plate Count (TPC)

Syarat-syarat Perhitungan

• Catat pengenceran yang digunakan

• Hitung jumlah koloni (yang hanya memenuhi syarat

untuk dihitung), spreader tidak dihitung

• kalikan jumlah koloni (atau rerata jumlah jika

digunakan ulangan dalam pengenceran yang sama)

dengan kebalikan pengencerannya.

• Untuk mencegah kesalahan ketelitian dan akurasi,

catat hanya dua digit pertama saja. Digit kedua

dapat ditingkatkan jika digit ketiga di atas 5;

gunakan nol untuk digit setelah digit kedua.

• Laporkan jumlah (atau dugaan jumlah) sebagai CFU

per g atau ml.

Perhitungan mikrobia berdasar jumlah

koloni

• Jumlah koloni: Dilakukan dengan pengenceran sampel

Spreader TNTC

Kisaran Hitung untuk Plate Count

• PDA BAM Ch.3 (2001) : kisaran 25-250 koloni percawan untuk pour plate

• AOAC (AOAC OM 996.23) : kisaran 30-300 koloni per cawan pour plate dan spread plate

• ISO 7218 (2007:38) : kisaran 10-200 koloni per cawan untuk

spread plate; 10-300 coloni/cawan untuk pour plate; untuk

koloni tipikal pada medium selektif 10-150 koloni per cawan

• APHA AWWA WEF 9125 (2004:2) : kisaran 30-300 koloni per cawan untuk pour plate dan spread plate

Perhitungan mikroorganisme dalam satuan CFU/ml atau Gram

1. APHA AWWA WEF 9125 (2004:2) :

CFU/ml or gram = jumlah koloni / (jumlah sampel yang dinokulasi x tingkat pengenceran)

Contoh :

Hasil hitungan cawan : 50 koloni dari tingkat pengenceran 1/100 Jumlah sampel yang diinokulasi : 0,1 ml

CFU/ml = 50 CFU/ (0,1 x 1/100) = 50 CFU / 0,001

Jumlah mikroorganisme jika lebih dari satu pengenceran

N (CFU/ml or g) = (∑ C) / {(1 x n1) + 0,1 x n2) x d}

Keterangan :

N : Jumlah mikroorganisme CFU/ml or g

∑ C : Jumlah semua koloni pada semua cawan

n1 : Jumlah cawan yang terhitung pada pengenceran pertama

n2 : jumlah cawan yang terisi pada pengenceran ke dua /berikutnya

d : Pengenceran dimana hitungan pertama (dari pengenceran pertama) diperoleh

Contoh Perhitungan 1/10 1/100 1/1000 TNTC (>300) 232 (30-300) 33 (30-300) TNTC (>300) 244 (30-300) 23 (<30) n1 : 2 cawan

n2 : 1 cawan (23 tdk masuk kisaran) d : 1/100 N = {(232+244+33)/(1 x 2) + (0,1 x 1) + (0,1 x 1) x (1/100)} = (509/0,021) CFU/ml = 24. 238,09 CFU/ml = 24.000 CFU/ml dibulatkan

Jumlah Mikroorganisme Yang Tidak Terdapat

Pertumbuhan Koloni Pada Cawan

PDA BAM Ch.3 (2001) : kurang dari satu kali pengenceran terendah (10° ) Perhitungan : N = < 1 x 10

N = <10 CFU/ml (EAPC : Estimated Aerobic Plate Count)

1/10 1/100 1/1000

0 0 0

0 0 0

• Pernyataan kurang dari satu (<1) menggambarkan ketidak pastian jumlah sel yang berada pada total sampel

• Walaupun volume sampelk inokulum menghasilkan non koloni, pelaporan sebai 0 mutlak dihindari karena belum tentu produk steril sekalipun belum tentu terbebas dari mikroorganisme

Jumlah Mikroorganisme jika semua

pengenceran dibawah kisaran perhitungan

1/10 1/100 1/1000 23 (<30) 4 (<30) 0 (<30) 20 (<30) 2 (<30) 0 (<30) Perhitungan : N = < 30 x 10 N = <30 x 10 CFU/ml

N = 300 CFU/ml (EAPC : Estimated Aerobic Plate Count)

PDA BAM Ch.3 (2001) : kurang dari satu kali pengenceran terendah (10° )

Jumlah Mikroorganisme jika

Upper Limit

1/10 1/100 1/1000 TNTC (>300) TNTC (>300) 425 (>300) TNTC (>300) TNTC (>300) 450 (>300)

• Jika semua pengenceran jumlah koloni diatas 300 upper limit dan kurang dari 100 CFU/cm² (luas cawan) : > 100 x luas area cawan x pengenceran

tertinggi ATAU n1 : 2 cawan d : 1/1000 N = {(425+450)/(1 x 2) + (0,1 x 1) x (1/1000)} = (875/0,002) CFU/ml = 43.750 CFU/ml = 44.000 CFU/ml (EAPC)

Spreader

Ada tiga tipe spreader.

• Tipe pertama

adalah rantaian koloni, tidak dapat

dipisahkan

secara

tepat,

disebabkan

oleh

disintegrasi gumpalan bakteri ketika inokulum

ditebarkan dalam medium plating.

• Tipe kedua

adalah perkembangan koloni yang

meluas dalam film air antara agar dan dasar Petri.

• Tipe ketiga

bentuk dalam film air pada tipe

Spreader

• Kedua tipe ini berkembang karena akumulasi

kelembapan pada tiap sebaran asli, dan

• spreader ini dapat mewakili pertumbuhan

koloni individu, jika pengenceran terdistribusi

secara merata dalam medium.

Contoh :

- Jumlah suspensi sel dengan pengenceran 10¯⁴ dalam kotak sedang, masing masing sebanyak 9,12,8,9, dan 10 sel

Jadi jumlah sel/ml dalam kotak sedang :

Sel/ml : rata-rata jumlah sel / volume kotak sedang X faktor pengenceran

Rata-rata jumlah sel = (9 + 12+ 8 + 9 + 10)/5 = 9,6 Volume kotak sedang : 4 x 10¯⁶

Faktor Pengenceran : 10¯⁴ Sel/ml = 9,6 / ( (4 x 10¯⁶ ) x (10¯⁴)) = 9,6/ (0,000004) x (0,0001) = 9,6/ 0,0000000004 = 24.000.000.000 = 2,4 x 10¹°

Most probable number (MPN)

• Merupakan satu metode uji pengenceran bertingkat (serial dilution) untuk mengukur konsentrasi mikroorganisme

• Mengunakan medium cair pada tabung reaksi, dengan pemasangan tabung Durhan terbalik.

• Perhitungannya berdasarkan tabung reaksi yang positif (timbul kekeruhan atau gas pada tabung Durham)

• Untuk setiap pengenceran pada umumnya mengguakan 3 atau 5 seri tabung (SNI 01-2332.1 (2007:7)

• Pengencerannya harus lebih tinggi sedapat mungkin di dalam tabung hanya ada satu mikrooganisme

Kmbinasi yang positif Index MPN tiap 100 ml 0 - 0 – 0 0 – 1 – 0 0 – 0 – 0 0 – 2 – 0 3 3 3 -1 – 0 – 0 1 – 0 – 1 1 - 1 – 0 1 – 1 – 1 1 – 2 – 0 4 7 7 11 11 2 – 0 – 0 2 – 0 – 1 2 – 1 – 0 2 – 1 – 1 2 – 2 – 0 2 – 2 – 1 2 – 3 – 0 9 14 15 20 21 28 -3 – 0 - 0 3 - 0 - 1 3 – 0 - 2 3 – 1 - 0 3 – 1 – 1 3 – 1 - 2 23 39 64 73 75 120 3 – 2 - 0 3 – 2 - 1 3 - 2 – 2 3 – 3 - 0 3 – 3 – 2 3 – 3 – 3 93 150 210 240 1000 2400