KULTIVASI
Organisme Waktu Penggandaan sel
Bakteri dan khamir Kapang dan Alga Rumput
Ayam Babi
Sapi muda
Manusia (muda)
20-120 menit 2-6 jam
Skema Umum Proses Kultivasi
Bioreaktor Pengembangan Inokulum
Kultur Stok
Labu
Kocok BioreaktorI nokulum
Sterilisasi Media
Formulasi Media
Bahan Baku Media
Cairan Fermentasi
Biomassa
Pemisahan Sel
Supernatan Bebas Sel
Ekstraksi Produk
Pemurnian Produk
Pengemasan produk
Metode kultivasi berdasarkan cara operasi bioreaktor :
-
nir sinambung/ curah
(batch)
-
sinambung
(continuous)
-
semi sinambung
(fed- batch)
METODE KULTIVASI
C
O
N
T
O
H
B
IO
R
E
A
K
T
O
Pelaksanaan kultivasi :
Bioreaktor steril diisi dengan media segar steril lalu
diinokulasi dengan inokulum Î KULTIVASI (merupakan
sistem tertutup)
Pada akhir kultivasi, isi bioreaktor dikeluarkan untuk dilakukan pemanenan produk (proses hilir)
Bioreaktor selanjutnya dibersihkan dan disterilisasi untuk digunakan pada kultivasi berikutnya
Kultur Curah
:1. Kultur curah merupakan cara yang paling sederhana, sehingga menjadi titik awal untuk studi kinetika kultivasi
2. Resiko kontaminasi rendah
3. Konsentrasi produk akhir lebih tinggi
4. Tidak perlu mikroba dengan kestabilan tinggi krn waktu kultivasinya pendek
5. Dapat untuk fase fermentasi yang berbeda pada bioreaktor yang sama (Contoh : pertumbuhan sel pd fase eksponensial &
pembentukan produk pd fase stasioner = metabolit sekunder 6. Pada industri farmasi, semua bahan-bahan yang digunakan
harus diketahui dengan tepat, sehingga lebih praktis dengan proses curah
7. Dari aspek rekayasa bioproses, kultur curah lebih fleksibel dalam perencanaan produksi, terutama untuk memproduksi beragam produk dengan pasar kecil
Kurva Pertumbuhan
Bila sel ditumbuhkan pada kultur curah, maka sel akan tumbuh dengan melalui : fase lag, fase eksponensial (fase log), fase stasioner dan akhirnya fase kematian
Lag Eksponensial Stasioner Kematian
Waktu
Log Jml
Sel/ml
Ln X (g/l)
‘Viable cell count’ dg lisis sel Lisis sel, diikuti
Fase Eksponensial :
Keterangan :
X = konsentrasi biomassa di dalam bioreaktor (g/l bobot kering)
µ = laju pertumbuhan spesifik (jam-1)
t = waktu (jam)
Plot antara ln[Sel] vs waktu
Î akan menghasilkan hubungan garis lurus pada fase eksponensial (ingat pembelahan biner)
Mengapa populasi sel meningkat dengan cara eksponensial ?
Perhatikan sel tunggal di dalam bioreaktorÎ Sel ini membelah diri tiap jam (pembelahan biner).
Populasi sel pada tiap waktu generasi dapat digambarkan sbb.
Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel Î 2 Î 4 Î 8 …. dst 1 Î 21 Î 22 Î 23 Î 24 ………….. Î2n = N (jumlah sel)
Laju pertumbuhan spesifik(µ) :
- Menggambarkan kecepatan reproduksi sel.
- Semakin tinggi nilainya, maka semakin cepat sel tumbuh. - Pada saat sel tidak tumbuh, maka laju spesifik pertumbuhan
= 0
Model Pertumb Eksponensial
¾ Hasil integrasi :
Persamaan di atas menggambarkan hubungan eksponensial
Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik :
Plot antara ln X vs t akan menghasilkan garus lurus
Hubungan antara Waktu Penggandaan (doubling time = tD) dengan laju spesifik pertumbuhan (μ)
td menggambarkan waktu yang diperlukan untuk menggandakan populasi sel Î menggambarkan laju pertumbuhan sel
Selama fase eksponensial tD relatif konstan
Hubungan antara tD dengan laju pertumbuhan spesifik
Î bila konsentrasi biomassa menjadi dua kali dari X0 menjadi X1 selama waktu penggandaan tD (= t 1- t0) :
td = 0,693
Aplikasi Kultur Curah
:• Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan metabolit sekunder
• Untuk produksi biomassa Î digunakan kondisi kultivasi yang mendukung pertumbuhan biomassa, sehingga mencapai
maksimal
• Untuk prodiksi metabolit primer Î kondisi kultivasi harus dapat memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan
sintesis produk
KULTUR SINAMBUNG
Media segar secara kontinyu ditambahkan ke dalam bioreaktor, dan pada saat yang bersamaan cairan kultivasi dikeluarkan (Sistem Terbuka)
Sel mikroba secara kontinyu berpropagasi menggunakan media segar yang masuk, dan pada saat yang bersamaan produk, produk samping metabolisme dan sel dikeluarkan dari bioreaktor Î volume tetap
Bioreaktor kultur sinambung membutuhkan lebih sedikit pembersihan dibandingkan sistem curah.
Dapat menggunakan Sel mikroba imobil untuk
memaksimumkan waktu tinggalnya (retensi), sehingga meningkatkan produktivitasnya.
Imobilisasi sel : penempatan mikroba pada ruang/daerah tertentu, sehingga dapat mempertahankan kestabilannya & dapat digunakan berulang-ulang (contoh :
Kultur Sinambung
Kelebihan :
1. Produktivitas lebih tinggi, penyebab :
- lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor per satuan produk yang dihasilkan
- laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol
Î dengan mengatur laju dilusi
- pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur Dengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya modal untuk fasilitas baru)
2. Dapat dijalankan pada waktu yang lama
3. Cocok untuk proses yang resiko kontaminasinya rendah (contohnya penanganan limbah cair) & produk yang
berasosiasi dengan pertumbuhan
Kultur Sinambung
Dengan mengontrol laju dilusi Î dimungkinkan untuk
mempertahankan laju pertumbuhan spesifik yang optimal untuk pembentukan produk
Kelemahan :
Aliran umpan yang lama Î resiko kontaminasi besar (operasi harus hati-hati & desain peralatan lebih baik)
Peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus bisa tetap bekerja baik untuk waktu yang lama
Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena akan digunakan pada waktu yang lama
Î Terjadinya degenerasi galur mikroba yang digunakan akibat mutasi spontan menyebabkan penurunan produk yang
dihasilkan
NERACA MASSA PADA KULTUR SINAMBUNG
Biomassa :
Akumulasi = Sel masuk – Sel keluar + Pertumbuhan – Sel mati
(
μ
D
)
X
Dalam keadaan setimbang (staedy state),
Dcrit ≈ μmax
D mendekati Dcrit ⇒ tidak stabil D > μmax ⇒ wash out
Substrat :
Akumulasi = nutrisi masuk – nutrisi keluar – konsumsi untuk tumbuh
– konsumsi untuk pemeliharaan – konsumsi untuk
sintesis produk
Kultur Sinambung :
Start-Up
Kultivasi sinambung diawali dengan kultivasi curah
Setelah kultur mencapai fase eksponensial, lalu umpan dimasukkan
Bila komposisi media saat start-up sama dengan umpan, perubahan dari curah ke sinambung menyebabkan
konsentrasi sel atau produk berosilasi (A) Î penyebab : kultur mikroba mengalami hambatan oleh substrat)
Î dicegah dengan komposisi media saat start-up 1/2 umpan
(B)
Penambahan umpan dilakukan kira-kira setelah kons sel ½ kons sel saat “steady-state” (biomassa, substrat & produk tidak berubah dan laju metabolisme sel kontan)
A B
Waktu Waktu
Kons Sel
Kons
Kultur Sinambung :
Model hubungan laju pertumbuhan sel dgn konsentrasi substrat pada kultivasi sinambung Î Model MONOD
µ = S µmaks KS + S
Keterangan :
µ = laju pertumbuhan spesifik (jam-1)
µmaks = laju pertumbuhan spesifik maksimum (jam-1)
S = konsentrasi substrat pembatas (g/l)
KS = kons substrat (g/l) pada saat ½ laju pertumbuhan spesifik maksimum Î menggambarkan efisiensi mikroba dalam
Model yang menghubungkan X, S dan D
Persamaan Saat Tidak Setimbang (Non-Steady State) Biomassa
D
Persamaan dalam Keadaan Setimbang (Steady State)
Substrat
D kritis
D kritis
⇒
D terendah saat mana wash out terjadi
Aplikasi Kultur Sinambung :
Digunakan untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba,
dikarenakan kondisinya mantap, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir dan laju pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat
pembatas Î dapat digunakan untuk penelitian pengaruh substrat
pembatas thd kinerja mikroba, untuk perbaikan sistem curah/ semi sinambung
Untuk isolasi dan seleksi mikroba penghasil enzim menggunakan
media diperkaya
Untuk produksi biomassa, contoh I CI (I mperial Chemical I ndustries,
kapasitas bioreaktor 3000 m3, substrat metanol)
Untuk produksi bir menggunakan bioreaktor menara (tower
KULTUR SEMI SINAMBUNG (FED-BATCH)
Media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran
isi bioreaktor.
Pada kultur fed batch, media segar ditambahkan ke dalam
bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor secara kontinyu.
Harus disediakan ruang dalam bioreaktor untuk penambahan
media
Pada saat isi bioreaktor penuh, bioreaktor dikosongkan, baik
sebagian atau seluruhnya dan proses dimulai kembali.
Dapat mengurangi efek represif sumber karbon akibat
penggunaan kons substrat yang tinggi dan mempertahankan kapasitas aerasi dalam bioreaktor
Aplikasi Kultur Semi Sinambung (Fed-Batch)
Untuk produksi antibiotika penisilin (metabolit sekunder)
Î - kultivasi 2 tahap : fase pertumbuhan sel cepat dan fase
produksi yang diatur dengan mengatur umpan substrat glukosa - Na-fenilasetat (prekursor) toksik thd Penicillium chrysogenum
Î pengumpanan harus diatur
Kultur Curah Semi Sinambung
Kultur Sinambung
Aliran masuk (Fin)
Aliran keluar (Fout)
Fin = Fout = 0 Fin> 0, Fout = 0 Fin = Fout > 0
Volume kultur Konstan Meningkat Konstan
Pengendalian kons substrat
Tdk mungkin (menurun)
Mungkin (konstan)
Mungkin (konstan)
Konsentrasi Sel Rendah (<5 g/l)
Kons. tertentu (> 100 g/l)
Kons. tertentu
Konsentrasi produk
Meningkat s.d tk rendah
Meningkat s.d tk tinggi
Konstan
Kemudahan bagi pengguna
Mudah Agak mudah Sulit
Bahaya
kontaminasi
Tidak serius Tidak serius Serius
Kinetika Curah (Batch)
Produksi Etanol oleh bakteri
Zymomonas mobilis
Waktu (jam)
Biomassa (g/l)
Glukosa (g/l)
Etanol (g/l)
ln biomassa
5 0,05 247 1,5 -2,99573
9 0,15 240 5 -1,89712
14 0,45 225 12 -0,79851
18 1,2 195 22 0,182322
22 2,8 130 47 1,029619
24 3,4 100 63 1,223775
26 3,8 75 74 1,335001
30 4,15 40 90 1,423108
Fase eksponensial = 5 – 22 jam
kurva pertumbuhan
-4 -3 -2 -1 0 1 2
5 9 14 18 22 24 26 30 35
Waktu (jam )
ln
X
(
g
/L
Laju Pertumb. Spesifik maks (
μ
maks) = 0,24 Jam
-1 Penent Laju Pertumb. Spesifiky = 0,2355x - 4,0992 R2 = 0,9984
-4 -3 -2 -1 0 1 2
0 5 10 15 20 25
Waktu (jam )
L
n
B
io
m
assa (
g
/l
Waktu
(jam) (X-Xo) (So-S) (P-Po)
5 0 0 0
9 0,1 7 3,5
14 0,4 22 10,5
18 1,15 52 20,5
22 2,75 117 45,5
24 3,25 147 61,5
26 3,75 172 72,5
30 4,1 207 88,5
Yp/s = 0,38 g etanol/g substrat
Yp/s
y = 0,3827x + 0,8447 R2 = 0,9983
0 10 20 30 40 50
0 50 100 150
(So-S) g/l
(P
-P
o
) g
Yx/s = 0,03 g etanol/g substrat
Yx/s
y = 0,0273x + 0,4472 R2 = 0,8583
0 1 2 3 4
0 50 100 150
(So-S) g/l
(X
-X
o)
g/
Yp/x = 12,047 g etanol/g biomassa
Yp/x
y = 12,047x - 2,4313 R2 = 0,8615
-20 0 20 40 60
0 1 2 3 4
(X-Xo) g/l
(P
-P
o)
g/