3 Lampiran 1
RINGKASAN PENGKAJIAN KEAMANAN PAKAN KEDELAI PRG EVENT A2704-12
I. PENDAHULUAN
Kedelai PRG event A2704-12 merupakan kedelai produk rekayasa genetik dari PT Bayer Indonesia. Kedelai PRG ini mengandung sisipan gen phosphinothricin acetyltransferase (pat) penyandi protein PAT yang memberikan sifat toleran terhadap herbisida amonium glufosinat (GA).
Sehubungan dengan adanya permohonan dari PT Bayer Indonesia untuk melakukan pengkajian keamanan pakan Kedelai PRG event A2704-12 sebelum diedarkan dengan surat No. 001/BCS-Seeds/GM/VI/2018 tanggal 6 Juni 2018 dan Surat Penugasan Pengkajian Keamanan Pakan Kedelai PRG event A2704-12 No. B-95/KKH PRG/09/2020 tanggal 14 September 2020 dari Ketua KKH PRG, TTKH PRG Bidang Keamanan Pakan telah melakukan pengkajian keamanan pakan terhadap Kedelai PRG event A2704-12. Pelaksanaan pengkajian dilakukan berdasarkan Peraturan Pemerintah Republik Indonesia No. 21 Tahun 2005 tentang Keamanan Pakan PRG, dan Peraturan Menteri Pertanian No. 36/Permentan/LB.070/8/2016 Tahun 2016 tentang Pengkajian Keamanan Pakan PRG, dan Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian No. 466.2/Kpts/OT.210/H/11/2016 Tahun 2016 tentang Pedoman Teknis Tata Cara dan Mekanisme Pengkajian Keamanan Pakan PRG.
Kedelai PRG event A2704-12 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 23 negara, yaitu Amerika Serikat (1998), Kanada (2000), Afrika Selatan (2001), Jepang dan Rusia (2002), Meksiko (2003), Australia dan Selandia Baru (2004), Taiwan (2007), Rusia dan Uni Eropa (2008), Filipina dan Korea Selatan (2009), Brazil dan Cina (2010), Argentina (2011), Malaysia (2012), Thailand (2013), India dan Singapura (2014), Vietnam (2015), Iran (2016), dan Indonesia (berdasarkan Surat Keputusan Kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan No. HK.02.02.1.51.04.20.141 Tahun 2020).
Kedelai PRG event A2704-12 telah memperoleh sertifikat aman pakan di 18 negara, yaitu Amerika Serikat (1998), Kanada (2000), Afrika Selatan (2001), Jepang (2003), Rusia (2007), Eropa (2008), Filipina dan Korea Selatan (2009), Brazil dan Cina (2010), Argentina dan Turki (2011), Kolombia dan Malaysia (2012), India dan Singapura (2014), Vietnam (2015), dan Nigeria (2018).
Kedelai PRG event A2704-12 juga telah memperoleh sertifikat aman lingkungan di enam negara, yaitu Amerika Serikat (1996), Kanada (1999), Jepang (2006), Brazil (2010), Argentina (2011), dan Uruguay (2012).
4
Berdasarkan Peraturan Menteri Pertanian No. 36/Permentan/LB.070/8/2016 Tahun 2016 tentang Pengkajian Keamanan Pakan PRG dan Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian No. 466.2/Kpts/OT.210/H/11/2016 Tahun 2016 tentang Pedoman Teknis Tata Cara dan Mekanisme Pengkajian Keamanan Pakan PRG, TTKH Pakan PRG telah melakukan pengkajian keamanan pakan Kedelai PRG event A2704-12 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pakan sebagaimana diuraikan berikut ini.
II. INFORMASI GENETIK II.1 Elemen Genetik
Kedelai PRG event A2704-12 mengandung kaset gen pat dengan promotor 35S dan terminator 35S. Gen pat mengode enzim PAT dan berfungsi memberikan toleransi terhadap herbisida GA (Freyssinet, 2002).
II.2 Sumber Gen Sisipan
Sumber gen sisipan Kedelai PRG event A2704-12, yaitu gen pat yang berasal dari Streptomyces viridochromogenes (Strauch et al., 1988; Strauch et al., 1993), bakteri yang diketahui tidak bersifat patogenik, toksik, atau alergen pada manusia dan hewan. Promotor dan terminator 35S berasal dari Cauliflower mosaic virus (Pietrzak et al., 1986).
II.3 Sistem Transformasi
Kedelai PRG event A2704-12 dirakit melalui teknologi penembakan partikel (Christou et al., 1988) menggunakan eksplan embrio somatik dengan plasmid pB2/35SAcK yang mengandung gen pat (Berghman dan De Beuckeleer, 2002). Embrio somatik yang telah tertransformasi kemudian dipindahkan ke media tanam hingga tanaman tumbuh sempurna untuk selanjutnya diseleksi dengan disemprotkan herbisida glufosinat. Plantlet yang berhasil tumbuh kemudian dipindahtanamkan dan ditumbuhkan di rumah kaca untuk kemudian diseleksi kembali toleransinya terhadap glufosinat (Wert, 1999).
Hasil analisis Southern Blot menunjukkan terdapat dua kopi sisipan gen pat (Wert, 1999). Analisis ini juga menunjukkan tidak adanya sekuen backbone pada plantlet yang diregenerasi.
II.4 Stabilitas Genetik
Analisis molekuler menggunakan Southern Blot dilakukan untuk melihat stabilitas gen sisipan dari generasi ke generasi. Kedelai PRG event A2704-12 mengandung gen pat. Hasil analisis menunjukkan bahwa gen sisipan tersebut stabil pada lima generasi (Mertens, 2015). Dari pola segregasi R2 diketahui
5
bahwa Kedelai PRG event A2704-12 mengikuti pola pewarisan hukum Mendel (Wert, 1999). Selain itu, analisis Southern Blot juga menunjukkan tidak terdeteksinya sekuen backbone dari plasmid pB2/35SAcK.
Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa:
a. Kedelai PRG event A2704-12 mengandung dua kopi gen sisipan pat yang stabil pada lima generasi dengan mengikuti pola pewarisan hukum Mendel. b. Kedelai PRG event A2704-12 tidak mengandung sekuen backbone dari
plasmid pB2/35SAcK.
III. INFORMASI KEAMANAN PAKAN III.1 Kesepadanan Substansial
Tujuan utama perakitan Kedelai PRG event A2704-12 ialah mendapatkan sifat toleransi terhadap herbisida dan tidak untuk mengubah komposisi atau kadar zat gizi utamanya.
Pengkajian kesepadanan substansial dilakukan terhadap kedelai non-PRG (varietas A2704), Kedelai PRG event 12, dan Kedelai PRG event A2704-12 yang disemprot dengan herbisida amonium glufosinat, berdasarkan report No. 03-B005 tentang Nutritional Assessment of Glufosinate Tolerant Soybean Transformant A2704-12 (Oberdorfer, 2008).
Sampel biji dan hijauan (segar dan kering) serta bungkil Kedelai PRG event A2704-12 diperoleh dari 9 lokasi tanam di Amerika Serikat dan Kanada yang pertanamannya dilakukan pada tahun 1999 di Illinois, Nebraska, Wisconsin, dan Ontario, sementara pada tahun 2000 dilaksanakan di Iowa, Indiana, Wisconsin, Minnesota, dan Ontario. Sampel biji diperoleh dari pertanaman di Illinois, Nebraska, Wisconsin, Ontario, Iowa, dan Indiana, sementara sampel hijauan (segar dan kering) diperoleh dari pertanaman di Illinois, Iowa, dan Nebraska (Oberdorfer, 2008).
Penilaian komposisi gizi dilakukan sesuai dengan dokumen konsensus OECD tentang senyawa untuk varietas kedelai baru (OECD, 2000; OECD, 2012). Analisis pada sampel hijauan (segar dan kering) meliputi proksimat (air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat) dan serat. Analisis pada sampel biji meliputi proksimat (air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat), serat, asam lemak (oleat, gadoleat, erukat, linoleat, linolenat, palmitat, margarat, palmitoleat, stearat, arakidat, behenat, dan lignoserat), asam amino (alanin, arginin, asam aspartat, asam glutamat, glisin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, sistin, fenilalanin, prolin, serin, tirosin, treonin, triptofan, dan valin), vitamin (B1, B2, asam folat, dan vitamin E), mineral (kalsium, fosfor, magnesium, besi, kalium, dan natrium), isoflavon (genistin, genistein, daidzin, daidzein, glisitin, dan glisitein), dan metabolit sekunder/antinutrisi (stakiose, rafinose, lektin, asam
6
fitat, dan penghambat tripsin). Analisis pada bungkil meliputi proksimat (air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat) dan serat.
Hasil analisis pada hijauan (segar dan kering) menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata pada komposisi proksimat dan serat antara kedelai non-PRG (varietas A2704), Kedelai non-PRG event A2704-12, dan Kedelai PRG event A2704-12 yang disemprot dengan herbisida amonium glufosinat (Oberdorfer, 2008), yaitu angka hasil analisis masih dalam kisaran yang dianjurkan oleh OECD (2000, 2012).
Hasil analisis pada biji kedelai menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata pada kadar proksimat dan serat antara kedelai non-PRG (varietas A2704), Kedelai PRG event A2704-12, dan Kedelai PRG event A2704-12 yang disemprot dengan herbisida amonium glufosinat (Oberdorfer, 2008). Semua nilai analisis berada dalam rentang normal menurut OECD (2000, 2012).
Hasil analisis asam lemak Kedelai PRG event A2704-12 menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang nyata dengan kedelai pembandingnya (Oberdorfer, 2008) dan masih dalam kisaran normal sesuai dengan anjuran OECD (2000). Hasil analisis menunjukkan bahwa biji Kedelai PRG event A2704-12 memiliki komposisi asam amino, vitamin, mineral, oligosakarida, isoflavon, dan metabolit sekunder/zat antinutrisi, dengan nilai rata-rata berada dalam interval toleransi (Oberdorfer, 2008) dan masih dalam kisaran yang dilaporkan OECD (2000). Analisis proksimat dan serat bungkil Kedelai PRG event A2704-12 dan kedelai non-PRG menunjukkan hasil yang tidak berbeda untuk kadar air, protein, total lemak, abu, karbohidrat, dan komponen serat (Oberdorfer, 2008) dan sesuai dengan kisaran yang dianjurkan oleh OECD (2000).
Berdasarkan pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa hijauan (segar dan kering), biji, dan bungkil Kedelai PRG event A2704-12 sepadan dengan kedelai non-PRG.
III.2 Toksisitas
Kajian toksisitas dilakukan terhadap protein PAT melalui studi bioinformatika, uji kecernaan protein secara in vitro, dan uji toksisitas oral akut. Protein PAT yang terdapat pada Kedelai PRG event A2704-12 ditemukan dalam jumlah yang sangat sedikit. Oleh karena itu, digunakan protein rekombinan PAT yang diproduksi oleh bakteri Escherichia coli pada uji toksisitas ini. Sebelumnya, telah dilakukan uji ekuivalensi yang menunjukkan bahwa protein PAT yang diproduksi dari E. coli setara dengan protein PAT pada tanaman Kedelai PRG event A2704-12 (Currier dan Hendrickx, 2006).
7 III.2.1 Studi bioinformatika protein PAT
Studi bioinformatika dilakukan dengan membandingkan homologi sekuen asam amino protein PAT dengan toksin-toksin yang telah diketahui secara umum. Pencarian kesamaan sekuen protein dilakukan terhadap sekuen protein yang terdapat dalam basis data NCBI non-redundant yang terdiri atas Genebank CDS, PDB, Uniprot_Swissprot, PIR Protein Sequence Database (PIR-PSD), dan PRF/SEQDB. Analisis dilakukan menggunakan program FASTA dengan nilai ambang batas E value sebesar 0,1. Selanjutnya, dilakukan pencarian kesamaan toksin terhadap 49.681 toksin berdasarkan basis data Bayer Toxin Database (BCS) tahun 2017 menggunakan program FASTA dengan ambang batas E value sebesar 10. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein PAT tidak mempunyai kesamaan sekuen asam amino dengan toksin yang telah diketahui (Capt, 2017).
III.2.2 Uji kecernaan in vitro protein PAT
Uji kecernaan protein secara in vitro yang terdiri atas Simulated Gastric Fluid (SGF) dan Simulated Intestinal Fluid (SIF). Uji SGF mencerminkan kecernaan protein oleh enzim pepsin yang hanya berlaku untuk ruminansia, sedangkan SIF mencerminkan kecernaan protein oleh enzim pankreatin yang berlaku untuk hewan monogastrik dan ruminansia.
Protein PAT (~21,5 kDa) dihasilkan oleh E. coli dengan kemurnian 87,5% (batch number: ADW040708), disuplai oleh BioAnalytics (Bayer Crop Science NV, Zwijnaarde, Belgia).
Uji kecernaan in vitro protein PAT dengan metode SGF dan SIF masing-masing dilakukan berdasarkan dokumen Study Report No. SA 09048 (Rouquie, 2015) dan No. SA 09049 (Rascle, 2009) yang dilaksanakan dengan mengikuti prinsip Good Laboratory Practice (GLP) bertempat di Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski BP153 06903, Sophian Antipolis Cedex, Prancis.
Uji kecernaan protein PAT dengan metode SGF dilakukan mengikuti protokol yang digunakan oleh Thomas et al. (2004). Pengujian dilakukan dengan inkubasi dalam larutan SGF yang mengandung pepsin pada pH 1,2 selama interval waktu tertentu (0; 0,5; 2; 5; 10; 20; 30; 60 menit) yang dilanjutkan dengan analisis SDS-PAGE dan Western Blot.
Uji kecernaan protein PAT dengan metode SIF dilaksanakan dengan inkubasi dalam larutan yang mengandung pankreatin babi mengikuti protokol yang dikeluarkan oleh International Life Science institute (ILSI) selama interval waktu spesifik (0; 0,5; 2; 5; 10; 20; 30; 60 menit) yang kemudian dilanjutkan dengan analisis SDS-PAGE dan Western Blot.
8
Hasil uji SGF menunjukkan protein PAT dihidrolisis dengan cepat, yaitu kurang dari 0,5 menit, ditandai dengan tidak terlihat adanya pita. Hal ini membuktikan bahwa uji SGF bekerja seperti yang diharapkan.
Hasil uji SIF yang diikuti dengan analisis SDS-PAGE dan Western Blot menunjukkan protein PAT telah terhidrolisis sempurna dalam waktu 5 menit, yaitu hanya 10% dari protein PAT yang tertinggal. Dalam waktu 10 menit protein PAT telah tercerna sempurna pada inkubasi dalam larutan SIF pada pH 7,5.
III.2.3 Uji toksisitas oral akut protein PAT
Kajian toksisitas oral akut untuk protein PAT pada Kedelai PRG event A2704-12 dilakukan berdasarkan dokumen Study Report No. SA 13205 (Blanck, 2014). Uji ini dilakukan menggunakan protein rekombinan PAT yang diproduksi oleh bakteri E. coli (batch number: 1339_PAT/pat) dengan kemurnian >99% yang telah dilarutkan dalam phosphate buffer saline (PBS) + Tween 20 0,05%, pH 7,3 dengan konsentrasi akhir sebesar 50 mg/ml.
Pengujian dilakukan sesuai dengan acuan The US EPA OCSPP Guideline Number 870.1100 dan The OECD Test Guideline 420 (OECD, 2001; US EPA, 2002). Lokasi pengujian di laboratorium Bayer SAS, Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski, CS 90153, Valbonne 06906, Sophia Antipolis Cedex, Perancis, yang menerapkan GLP. Pengujian dilakukan dengan mencit C57BL/6J yang berasal dari Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, Prancis. Mencit diaklimatisasi terlebih dahulu selama 8 hari. Bobot badan mencit jantan antara 17,4–19,3 g, sedangkan mencit betina antara 14,1–16,0 g.
Pada uji ini, sebanyak 40 ekor mencit berumur 8 minggu dibagi menjadi dua kelompok, tiap kelompok terdiri atas 10 ekor jantan dan 10 ekor betina. Mencit dipuasakan selama semalam pada awal studi (sebelum diberi perlakuan) dan pada akhir studi (sebelum dilakukan terminasi). Kelompok perlakuan diberi protein PAT dengan dosis 2.000 mg/kg bobot badan, secara oral melalui dua kali cekok dengan selang waktu 30 menit masing-masing 20 ml larutan protein PAT dengan dosis 1.000 mg/kg bobot badan. Sementara, kelompok kontrol hanya diberi larutan PBS (pH 7,3) dengan volume yang sama.
Pengamatan pada mencit dilakukan terhadap adanya gejala klinis, kematian, perubahan bobot badan, dan jumlah konsumsi pakan. Pada hari ke-15, semua mencit diterminasi dengan inhalasi isofluran, dilanjutkan dengan nekropsi untuk melihat adanya perubahan makroskopik pada organ dalam (Blanck, 2014). Hasil uji menunjukkan bahwa tidak ada kematian, perbedaan bobot badan, kelainan gejala klinis, dan perubahan patologis secara makroskopik pada organ mencit kelompok kontrol dan perlakuan. Oleh karena itu, dapat disimpulkan
9
bahwa pemberian protein PAT sampai dengan dosis 2.000 mg/kg bobot badan tidak menyebabkan toksisitas pada mencit.
Berdasarkan uji toksisitas protein PAT Kedelai PRG event A2704-12 yang dilakukan melalui studi bioinformatika, uji kecernaan in vitro, dan toksisitas oral akut, dapat disimpulkan:
a. tidak ada kemiripan antara protein PAT dan protein toksin atau toksin putatif (putative toxin).
b. protein PAT cepat tercerna, baik dalam SGF maupun SIF. c. protein PAT tidak bersifat toksik.
III.3 Studi Pakan
Kajian studi pakan dilakukan berdasarkan laporan Leeson (1997). Penelitian dilakukan pada 4–20 Februari 1997. Tujuan penelitian ialah mengevaluasi pengaruh dari 15 hari pemberian pakan (periode starter) yang mengandung Kedelai PRG event A2704-12 dan kedelai tetuanya (A2704). Digunakan ayam broiler Ross 208 umur 1 hari sebanyak 144 ekor yang dibagi untuk dua perlakuan, yaitu pemberian Kedelai PRG event A2704-12 dan kedelai A2704. Pada tiap-tiap perlakuan ayam dibagi berdasarkan jenis kelamin per kandang, yaitu 6 ekor jantan dan 6 ekor betina dengan 6 ulangan.
Ransum yang digunakan hanya untuk periode starter dan disiapkan dengan mencampur kedelai sebanyak 20% dalam ransum. Sebelum digunakan untuk ransum, kedelai diberi perlakuan panas basah (moist heat) agar inhibitor tripsin tidak aktif. Ransum dan air minum diberikan secara ad libitum selama penelitian. Pemeliharaan ayam broiler mengikuti petunjuk dari The Canadian Council on Animal Care. Kandang berada di luar gedung dengan rancangan khusus mengikuti Petersime Battery Brooder Cages. Penimbangan bobot badan dilakukan pada awal dan akhir penelitian. Data bobot badan dan konsumsi pakan dianalisis menggunakan t-test.
Hasil studi menunjukkan tidak ada perbedaan bobot badan, konsumsi pakan, dan konversi pakan antara kelompok ayam broiler yang diberi pakan mengandung Kedelai PRG event A2704-12 dan kedelai non-PRG A2704.
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. Kedelai PRG event A2704-12 mengandung dua kopi sisipan gen pat yang stabil pada lima generasi, diwariskan mengikuti hukum Mendel, dan tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid pB2/35SacK.
2. Kedelai PRG event A2704-12 sepadan secara substansial dengan kedelai non-PRG.
10
3. Kedelai PRG event A2704-12 tidak bersifat toksik.
4. TTKH PRG Bidang Keamanan Pakan menilai bahwa Kedelai PRG event A2704-12 yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pakan.
5. Apabila di kemudian hari ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pakan yang diperoleh hingga saat ini, status keamanan pakan Kedelai PRG event A2704-12 perlu dikaji ulang.
6. Apabila setelah ditetapkan aman pakan, kemudian Kedelai PRG event A2704-12 terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan ternak, pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik Kedelai PRG event A2704-12 dari peredaran.
Daftar Pustaka
Berghman, S. and De Beuckeleer, M. 2002. Determination of inserted transgenic sequences in Glycine max elite event A2704-12. Aventis Crop Science NV, Biotech Product Characterization Jozef Plateaustraat 22, B-9000 Gent Gent, Belgium. M-199535-02-1.
Blanck, M. 2014. PAT/pat protein – acute toxicity by oral gavage in mice. Company report. Study report number: SA 13205. Testing facilities: Bayer SAS, Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski CS 90153 Valbonne, 06906 Sophia Antipolis Cedex, France.
Capt, A. 2017. PAT/pat protein amino acid sequence homology search with known allergens and known toxins. Report number: TXSRS002. Bayer SAS, Crop Science Division, 355, rue Dostoïevski, CS 90153 Valbonne, 06906 Sophia Antipolis Cedex, France. M-266573-10-1.
Christou, P., McCabe, D.E., and Swain, W.F. 1988. Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold particles. Plant Physiology, 87:671– 674.
Currier, T. and Hendrickx, K. 2006. Structural and functional equivalence of PAT/pat protein produced in Escherichia coli and A2704-12 soybean, Glycine max. Company report. Study identification: BK06Q012. Testing facilities: Bayer CropScience, Molecular and Biochemical Analytical Services, 2 T.W. Alexander Drive, RTP, NC 27709, USA; Bayer CropScience, Molecular and Biochemical Analytical Services, Technologiepark 38, 9052 Gent, Belgium. M-229533-02-1.
Freyssinet, M. 2002. General description of the bacterial gene pat and its gene product PAT as used for producing plants with a genetically-based tolerance to Liberty herbicide. Aventis Crop Science SA, Lyon, France. 24 p., M-208497-01-1.
Leeson, S. 1997. The effect of the Libertylink® soybean (event 2704-12) on the growth performance and mortality of male and female broiler chickens. Report study C-2-97. Performing laboratory: Department of Animal & Poultry Science, University of Guelph, Guelph, Ontario N1G2W1, Canada.
11
Sponsor: Aventis Crop Science, 14-20 rue Pierre Baizet BP 9163, Lyon Cedex 09, France. Amended on February 07, 2001.
Mertens, K. 2015. Structural stability analysis of early and recent generations of Glycine max A2704-12. Study report number: 14-RSQXS001. Bayer CropScience N.V. -Innovation Center Seed & Trait Safety. Protein and Product Characterization. Technologiepark 38, 9052 Ghent, Belgium. M-534302-01-1
Oberdorfer, R. 2008. Nutritional assessment of glufosinate tolerant soybean transformant A2704-12. Bayer Crop Science AG, BioAnalytics, D-65926 Frankfurt, Germany.
OECD. 2000. Consensus document on the biology of Glycine max (L.) Merr. (soybean). Series on Harmonization of Regulatory Oversight in Biotechnology No. 15. OECD Environmental Health and Safety Publications. Environment Directorate Joint Meeting of the Chemicals Committee and Working Party on Chemicals, Pesticides and Biotechnology. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris, France. OECD. 2001. OECD Guideline for Testing of Chemicals, Test Guideline number
420: Acute Oral Toxicity – Fixed dose Procedure. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris, France.
OECD. 2012. Revised consensus document on compositional considerations for new varieties of soybean (Glycine max [L.] Merr.): key food and feed nutrients, antinutrients, toxicants and allergens. Environment Directorate Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, Pesticides and Biotechnology. Series on the Safety of Novel Foods and Feeds No. 25. OECD Environment, Health and Safety Publications, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris, France.
Pietrzak, M., Shillito, D.S., Hohn, T., and Potrykus, I. 1986. Expression in plants of two bacterial antibiotic resistance genes after protoplast transformation with a new plant expression vector. Nucleic Acids Research, 14:5857– 5868.
Rascle, J.B. 2009. PAT/pat-protein in–vitro digestibility study in human simulated intestinal fluid. Study report number: SA 09049. Bayer SAS, Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906, Sophia Antipolis Cedex, France.
Rouquie, D. 2015. PAT/pat protein in vitro digestibility study in human simulated gastric fluid. Study report number: SA 09048. Bayer SAS, Bayer Crop Science, 355 rue Dostoïevski CS 90153, Valbonne 06906, Sophia Antipolis Cedex, France.
Strauch, E., Arnold, W., Alijah, R., Wohlleben, W., Puhler, A., Eckes, P., Donn, G., Uhlmann, E., Hein, F., and Wengenmayer, F. 1993. Phosphinothricin-resistance gene active in plants, and its use. European patent number: 275957 B1.
Strauch, E., Wohlleben, W., and Piilher, A. 1988. Cloning of a phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochomogenes T0494 and
12
its expression in Streptomyces lividans and Escherichia coli. Gene, 63:64– 74.
Thomas, K., Aalbers, M., Bannon, G.A., Bartels, M , Dearman, R.J., Esdaile, D.J., Fu, T.J., Glatt, C.M., Hadfield, N., Hatzos, C., Hefle, S.L., Heylings, J.R., Goodman, R.E., Henry, B., Herouet, C., Holsapple, M., Ladics, G.S., Landry, T.D., Macintosh, S.C., Rice, E.A., Privalle, L.S., Steiner, H.Y., Teshima, R., Van Ree,R., Woolhiser, M., and Zawodny, J. 2004. A multi-laboratory evaluation of a common in vitro pepsin digestion assay protocol used in assessing the safety of novel proteins. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 39:87–98.
US EPA. 2002. Prevention, pesticides and toxic substances (7101). United States Environmental Protection Agency Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (US EPA OCSPP) Guideline Number 870.1100. Acute Oral Toxicology. EPA 712-C-02-190.
Wert, S.V. 1999. Transformation system and genetic characterization of glufosinate resistant soybean event A2704-12. Report number: B002181. Bayer CropScience. Last update on June 19, 2013.
