BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Tumbuhan Paku (Pteridophyta)
Tumbuhan paku merupakan suatu divisi yang warganya telah jelas mempunyai kormus, artinya tubuhnya dengan nyata dapat dibedakan dalam tiga bagian pokoknya, yaitu akar, batang dan daun. Namun demikian, pada tumbuhan paku belum dihasilkan biji. Alat perkembang-biakan tumbuhan paku yang utama adalah spora (Tjitrosoepomo, 1994).
Tumbuhan paku dapat dibedakan menjadi dua bagian utama yaitu organ vegetatif yang terdiri dari akar, batang, rimpang, dan daun. Sedangkan organ generatif terdiri atas spora, sporangium, anteridium, dan arkegonium. Sporangium tumbuhan paku umumnya berada di bagian bawah daun serta membentuk gugusan berwarna hitam atau coklat. Gugusan sporangium ini dikenal sebagai sorus. Letak sorus terhadap tulang daun merupakan sifat yang sangat penting dalam klasifikasi tumbuhan paku. Menurut Tjitrosoepomo (1994) divisi Pteridophyta dapat dikelompokkan kedalam empat kelas yaitu Psilophytinae (paku purba), Lycopodiinae (paku kawat), Equisetinae (paku ekor kuda) dan Filiciane (paku sejati); dan menurut Steennis (1988), tumbuhan paku-pakuan dapat dibagi ke dalam 11 famili yaitu Salviniceae, Marsileaceae, Equicetaceae, Selagillaceae, Lycopodiaceae, Ophiglossaceae, Schizaeaceae, Gleicheniaceae, Cyatheaceae, Ceratopteridaceae dan Polypodiaceae.
Tumbuhan paku-pakuan yang tergolong dalam kelas Filiciane (paku sejati) mencakup jenis tumbuhan paku yang paling sering kita lihat. Tempat tumbuh
paku sejati sebagian besar di darat pada daerah tropis dan subtropis. Paku sejati diperkirakan berjumlah 12.000 jenis dari kelas Filicinae. Filicinae memiliki akar, batang, dan daun sejati. Batang dapat berupa batang dalam (rizom) atau batang di atas permukaan tanah. Daun Filicinae umumnya berukuran besar dan memiliki tulang daun bercabang. Daun mudanya memiliki ciri khas yaitu tumbuh menggulung (circinnatus) (Tjitrosoepomo, 1994).
2.2 Tumbuhan Kelakai 2.2.1 Morfologi tumbuhan
Tumbuhan kelakai merupakan jenis tumbuhan paku yang memiliki panjang 5 – 10 m. Akar rimpang yang memenjat tinggi, kuat, pipih persegi. Tangkai daun 10 – 20 cm, kuat. Daun menyirip tunggal 1,5 – 4 cm, mengkilap, daun mudanya berwarna merah muda, merah kerap kali keungu-unguan, bertekstur lembut dan tipis, semakin dewasa daunnya mengalami perubahan warna menjadi kecoklatan dan pada akhirnya menjadi hijau tua dan keras. Daun berbentuk lanset, ujungnya meruncing, tepinya bergerigi dan pangkalnya membulat (Steenis, 2003).
2.2.2 Daerah tumbuh
Tumbuhan kelakai tumbuh hingga pada ketinggian 900 meter dibawah permukaan laut dan merambat pada hutan-hutan bekas penebangan kayu terutama dekat air tawar, air payau, hutan bakau, di tanah pasir, khususnya disepanjang tepi sungai dan sumber air. Paku ini didapati di mana-mana seperti di dataran rendah, di tempat terbuka, hutan sekunder dan umum ditemukan di wilayah rawa-rawa termasuk rawa gambut (MacKinnon, 2000).
2.2.3 Sistematika tumbuhan
Sistematika tumbuhan kelakai hasil identifikasi Herbarium Medanense adalah sebagai berikut:
Kingdom : Plantae Divisi : Pteridophyta Kelas : Filicopsida Ordo : Filicales Suku : Blechnaceae Genus : Stenochlaena
Spesies : Stenochlaena palustris (Burm. f.) Bedd.
Sinonim : Polypodium palustris Burm. f., Onoclea scandens Sw., Lomaria scandens (Sw) Willd (Anonimb, 2012)
Nama asing : Miding, melat, akar pakis (Malaysia) (Anonima, 2013).
Nama daerah : Kelakai atau kalakai (Kalimantan Tengah/Kalimantan Selatan), Lemiding, miding (Pontianak), paku bang (Jawa), maja-majang, wewesu, bampesu (Sulawesi), lemidi (Sumatera) (Anonima, 2013).
2.2.4 Khasiat dan manfaat
Bagi masyarakat Dayak Kalimantan Tengah kelakai merupakan makanan favorit, kelakai dimasak dengan cara dioseng-oseng, sayur bening atau direbus untuk lalapan. Berdasarkan studi empiris daun dan batang kelakai muda dipergunakan oleh masyarakat suku Dayak sebagai suplemen penambah darah, obat awet muda, penambah ASI pada ibu yang sedang menyusui, obat tekanan darah tinggi, pereda demam dan mengobati sakit kulit (Maharani, dkk., 2005).
2.2.5 Kandungan kimia 2.2.5.1 Steroida/triterpenoida
Steroid merupakan senyawa kimia yang memiliki kerangka dasar siklopentanafenantren. Pada umumnya, gugus metil berada pada C10 dan C13.
Rantai samping alkil dapat juga berada pada C17. Sterol adalah steroid yang
memiliki gugus hidroksi pada C3.
Triterpenoid merupakan senyawa yang mempunyai kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isopren, dimana kerangka karbonnya dibangun oleh dua atau lebih satuan C5 tersebut. Senyawa terpenoid terdapat bebas dalam jaringan
tanaman, tetapi banyak diantaranya yang terdapat sebagai alkohol, aldehid (Harbone,1987), glikosida dan ester asam aromatik (Sastrohamidjojo, 1996). Pembagian triterpenoid berdasarkan jumlah cincin yang terdapat pada struktur molekulnya (Robinson, 1995), antara lain triterpenoid asiklik, triterpenoid trisiklik, triterpenoid tetrasiklik dan triterpenoid pentasiklik.
2.2.5.2 Alkaloid
Alkaloid merupakan golongan zat/senyawa tumbuhan sekunder yang terbesar. Umumnya alkaloid mencakup senyawa yang bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dalam sistem siklik. Alkaoid sering kali beracun bagi manusia dan banyak mempunyai kegiatan fisiologi yang menonjol, jadi digunakan luas dalam bidang pengobatan (Harbone, 1987).
2.2.5.3 Glikosida
Glikosida merupakan senyawa yang mengandung komponen gula dan bukan gula. Komponen gula dikenal dengan nama glikon dan komponen bukan
gula dikenal sebagai aglikon. Dari segi biologi, glikosida memiliki peranan penting di dalam kehidupan tumbuhan dan terlibat di dalam pertumbuhan dan perlindungan tumbuhan tersebut. Beberapa glikosida mengandung lebih dari satu jenis gula dalam bentuk disakarida atau trisakarida (Gunawan dan Mulyani, 2004).
Semua glikosida alam dapat terhidrolisis menjadi gula dan bukan gula dengan cara mendidihkannya bersama asam mineral. Biasanya, glikosida juga dapat terhidrolisis dengan mudah oleh enzim yang terdapat dalam jaringan tumbuhan yang sama. Pengelompokan glikosida berdasarkan struktur bukan gula terbagi atas : glikosida jantung, glikosida antrakinon, glikosida saponin, glikosida sianogenik, glikosida isotiosianat, glikosida flavonol, glikosida alkohol, glikosida alkohol, glikosida aldehida, glikosida lakton, glikosida fenol dan tanin (Tyler, 1988).
Menurut Farnsworth (1966), pembagian glikosida berdasarkan ikatan yang menghubungkan bagian gula dan bukan gula adalah:
a. C-glikosida yaitu senyawa glikosida yang ikatan antara glikon dan aglikonnya dihubungkan oleh atom C. Contoh: Barbaloin.
b. O-glikosida yaitu senyawa glikosida yang ikatan antara glikon dan aglikonnya dihubungkan oleh atom O. Contoh: Salisin.
c. N-glikosida yaitu senyawa glikosida yang ikatan antara glikon dan aglikonnya dihubungkan oleh atom N. Contoh: Krotonosid.
d. S-glikosida yaitu senyawa glikosida yang ikatan antar glikon dan aglikonnya dihubungkan oleh atom S. Contoh: Sinigrin.
2.2.5.4 Flavonoid
Flavonoid merupakan sekelompok besar senyawa polifenol tanaman yang tersebar luas dalam berbagai bahan makanan dan dalam berbagai konsentrasi. Flavonoid memiliki kerangka dasar karbon yang terdiri atas 15 atom karbon, dimana dua cincin benzen (C6) terikat pada suatu rantai propan (C3) sehingga
membentuk susunan C6-C3-C6 (Lenny, 2006).
Flavonoida berfungsi dalam menarik burung dan serangga yang berperan untuk proses penyerbukan bunga. Beberapa fungsi lainnya adalah untuk mengatur fotosintesis, kerja antimikroba dan antivirus serta memiliki kemampuan dalam mengusir serangga (Robinson, 1995).
Peranan beberapa senyawa fenol sudah diketahui misalnya antosianin sebagai pigmen bunga yang menghasilkan hampir semua warna merah jambu, merah marak, merah, merah senduduk, ungu dan biru. Antosianin hampir terdapat umum dalam tumbuhan berpembuluh seperti dalam beberapa lumut dan daun muda paku (Harbone, 1987).
2.2.5.5 Tanin
Tanin adalah senyawa fenol dengan berat molekul yang cukup tinggi, mengandung gugus hidroksil dan kelompok lain yang cocok (seperti karboksil) untuk membentuk kompleks yang efektif dengan protein dan makro molekul yang lain dibawah kondisi lingkungan tertentu yang telah dipelajari. Tanin merupakan bentuk komplek dari protein, pati, selulosa dan mineral (Horvath, 1981).
Tanin dibagi menjadi dua kelompok yaitu tanin yang terhidrolisis dan tanin yang terkondensasi. Tanin yang terhidrolisis merupakan polimer gallic atau ellagic acid berikatan dengan ester dan sebuah molekul gula, sedangkan tanin
terkondensasi merupakan polimer senyawa flavonoid dengan ikatan karbon-karbon (Westendarp, 2006).
Tanin terbagi dalam dua golongan, yaitu berasal dari turunan pyrogallol memiliki 3 gugus hidroksil pada inti aromatis dan berasal dari turunan pyrocatechol yang memiliki 2 gugus hidroksil pada inti aromatis. Pyrogallol dan catechol merupakan hasil peruraian glikosida tanin yangdapat digunakan sebagai anti bakteri dan anti fungi dengan adanya gugus –OH. Tanin merupakan senyawa yang tidak dapat dikristalkan (Tyler, 1988).
2.3 Simplisia dan Ekstrak 2.3.1 Simplisia
Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dikatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia dibedakan simplisia nabati, simplisia hewani dan simplisia pelikan (mineral). Simplisia nabati adalah simplisia yang
berupa tumbuhan utuh, bagian tumbuhan atau eksudat tumbuhan (Ditjen POM, 2000).
2.3.2 Ekstrak
Ekstrak yaitu sediaan kental atau cair yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan (Depkes RI, 1995).
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehinnga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan menggunakan pelarut cair.
Simplisia yang diekstraksi mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut (Ditjen POM, 2000).
Menurut Ditjen POM (2000), ada beberapa metode ekstraksi yang sering digunakan dalam berbagai penelitian antara lain yaitu:
a. Cara dingin 1. Maserasi
Maserasi adalah proses penyarian simplisia dengan cara perendaman menggunakan pelarut dengan sesekali pengadukan pada temperatur kamar. Maserai yang dilakukan dengan cara pengadukan dan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan terhadap maserat pertama dan seterusnya disebut remaserasi.
2. Perkolasi
Perkolasi adalah proses penyarian simplisia dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperature kamar.
b. Cara panas 1. Refluks
Refluks adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan alat pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
2. Digesti
Digesti adalah proses penyarian dengan pengadukan kontinu pada temperatur lebih tinggi daripada temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50°C.
3. Soxhletasi
Soxhletasi adalah proses penyarianatau ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang selalu baru, dilakukan dengan menggunakan alat soklet sehingga menjadi ekstraksi kontinu dengan pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
4. Infundasi
Infundasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada temperatur 90°C selama 15 menit.
5. Dekoktasi
Dekoktasi adalah proses penyarian dengan menggunakan pelarut air pada temperatur 90°C selama 30 menit.
2.4 Radikal Bebas
Radikal bebas adalah atom atau gugus atom yang memiliki satu atau lebih elektron tidak berpasangan, sehingga senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan (Fessenden dan Fessenden, 1986). Senyawa ini terbentuk di dalam tubuh dapat dipicu oleh berbagai faktor, misalnya ketika komponen makanan diubah menjadi bentuk energi melalui proses metabolisme. Dalam kondisi demikian mudah terbentuk radikal bebas, seperti anion superoksida, hidroksil dan lain-lain. Radikal bebas juga dapat terbentuk dari senyawa lain yang sebenarnya bukan radikal bebas, tetapi mudah berubah menjadi radikal bebas (Winarsi, 2007). Radikal bebas cenderung menangkap elektron dari molekul lain dan kemudian membuat senyawa baru yang tidak normal yang akan menyebabkan reaksi berantai (Kosasih, 2004). Reaksi ini akan berlangsung terus menerus dalam
tubuh dan bila tidak dihentikan akan menimbulkan berbagai penyakit seperti kanker, jantung koroner, katarak, serta penyakit degeneratif lainnya (Muchtadi, 2013).
Mekanisme reaksi radikal bebas terbentuk melalui 3 tahapan reaksi, yaitu: (1) permulaan (inisiasi, initiation) suatu radikal bebas, (2) perambatan (propagasi, propagation) reaksi radikal bebas; (3) pengakhiran (terminasi, termination) reaksi radikal bebas (Fessenden dan Fessenden, 1986).
Tahap inisiasi adalah tahap awal terbentuknya radikl bebas. tahap propagasi adalah tahap perpanjangan radikal berantai, dimana terjadi reaksi antara sutau radikal dengan senyawa lain dan menghasilkan radikal baru. Tahap terminasi adalah tahap akhir, terjadi pengikatan suatu radikal bebas dengan radikal bebas yang lain sehingga membentuk senyawa non radikal yang biasanya kurang reaktif dari radikal induknya (Kumalaningsih, 2006).
Sifat radikal bebas yang tidak stabil menyebabkan reaksi menerima atau memberikan elektron dengan molekul sekitarnya. Kebanyakan molekul ini bukan radikal bebas melainkan makromolekul biologi seperti lipid, protein, asam nukleat dan karbohidrat. Dengan reaksi ini timbulah reaksi radikal bebas beruntun yaitu terbentuknya radikal bebas baru yang bereaksi lagi dengan makromolekul lain (Kosasih, dkk., 2004).
2.5 Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa yang mempunyai struktur molekul yang dapat memberikan elektronnya kepada molekul radikal bebas dan dapat memutus reaksi berantai dari radikal bebas (Kumalaningsih, 2006). Antioksidan atau
reduktor berfungsi untuk mencegah terjadinya reaksi oksidasi atau menetralkan senyawa yang telah teroksidasi dengan cara menyumbangkan hidrogen dan atau elektron (Silalahi, 2006).
Menurut Kumalaningsih (2006), antioksidan tubuh dikelompokkan menjadi 3 yakni:
1. Antioksidan primer yang berfungsi untuk mencegah pembentuk senyawa radikal baru karena dapat merubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya, sebelum radikal bebas ini sempat bereaksi. Contohnya adalah enzim superoksida dismutase (SOD) yang berfungsi sebagai pelindung hancurnya sel-sel dalam tubuh karena radikal bebas.
2. Antioksidan sekunder merupakan senyawa yang berfungsi menangkap senyawa serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contohnya adalah vitamin E, vitamin C dan betakaroten yang dapat diperoleh dari buah-buahan.
3. Antioksidan tersier merupakan senyawa yang memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang disebabkan radikal bebas. Contohnya enzim metionin sulfoksidan reduktase untuk memperbaiki DNA pada inti sel.
Khasiat antioksidan untuk mencegah berbagai penyakit akibat pengaruh oksidatif akan lebih efektif jika kita mengkonsumsi sayur-sayuran dan buah-buahan yang kaya akan antioksidan dan berbagai jenis daripada menggunakan antioksidan tungggal. Hal ini mungkin dikarenakan oleh adanya komponen lain dan interaksinya dalam sayur-sayuran dan buah-buahan yang berperan secara positif (Silalahi, 2006).
Senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, kumarin, tokoferol, dan
asam-asam organik. Senyawa polifenolik dapat bereaksi sebagai pereduksi, penangkap radikal bebas. Antioksidan alami yaitu antioksidan yang dapat diperoleh dari tanaman atau hewan berupa tokoferol, vitamin C, betakaroten, flavonoid dan senyawa fenolik (Kumalaningsih, 2006).
2.5.1 Vitamin C
Vitamin C atau asam askorbat mempunyai berat molekul 176,13 dengan rumus bangun C6H8O6, dengan titik lebur 190 - 192°C. Asam askorbat
mengandung tidak kurang dari 99,0% C6H8O6. Pemerian: serbuk atau hablur
putih atau agak kuning, tidak berbau, rasa asam, oleh pengaruh cahaya lambat laun menjadi gelap, dalam larutan cepat teroksidasi. Penyimpanan dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya. Vitamin C mengandung khasiat sebagai antiskorbut (Ditjen POM, 1979).
Gambar 2.1. Rumus bangun vitamin C (Silalahi, 2006)
Vitamin C berperan dalam pencegahan penyakit jantung koroner, mencegah kanker, meningkatkan sistem kekebalan tubuh terhadap infeksi virus dan bakteri (Kosasih, dkk., 2004).
2.5.2 Karotenoid
Karotenoid adalah suatu kelompok pigmen yang berwarna kuning, jingga atau merah jingga, mempunyai sifat larut dalam lemak atau pelarut organik tetapi
tidak larut dalam air. Salah satu senyawa karotenoid adalah β-karoten, yaitu senyawa yang akan dikonversikan menjadi vitamin A oleh tubuh sehingga sering juga disebut sebagai pro-vitamin A (Kumalaningsih, 2006).
β-karoten mempunyai berat molekul 536,9 dengan rumus molekul C40H56.
Karakteristik β-karoten adalah hablur atau serbuk berwarna coklat-merah atau merah kecoklatan, praktis tidak larut dalam air, sedikit larut dalam sikloheksana, kurang larut dalam etanol. β-karoten peka terhadap udara, panas dan cahaya, terutama ketika dalam bentuk larutan. Rumus bangun β-karoten dapat dilihat pada gambar 2.2 berikut:
Gambar 2.2 Rumus bangun β-karoten
Sebagai antioksidan, β-karoten memperlambat fase inisiasi radikal bebas sehingga dapat melindungi tubuh terhadap berbagai penyakit, yaitu menghambat pertumbuhan sel kanker, mencegah serangan jantung, mencegah katarak, serta meningkatkan fungsi sistem kekebalan tubuh (Silalahi, 2006).
2.5.3 Flavonoid
Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C3
-C6. Kelompok terbesar flavonoid memiliki ciri adanya cincin piran yang
menghubungkan rantai tiga-karbon dengan salah satu dari cinci benzen. Senyawa ini merupakan pereduksi yang baik karena mampu menghambat reaksi oksidasi
(Robinson, 1995). Flavonoid pada tumbuhan berfungsi sebagai pelindung terhadap serangan jamur ataupun radiasi sinar UV yang dapat merusak tumbuhan, selain itu flavonoid juga terlibat dalam proses fotosintesis, transfer energi dan respirasi pada tumbuhan. Struktur umum untuk turunan flavonoid dapat dilihat pada gambar berikut:
Gambar 2.3 Rumus bangun flavonoid (Silalahi 2006)
Senyawa ini adalah senyawa pereduksi yang dapat menghambat reaksi oksidasi sehingga dapat dijadikan sebagai antioksidan (Robinson, 1995). Senyawa ini berperan sebagai penangkap radikal bebas karena mengandung gugus hidroksil (Silalahi, 2006).
2.5.4 Tokoferol
Tokoferol merupakan salah satu antioksidan yang terdapat dalam tumbuhan. Struktur α-tokoferol dapat dilihat pada gambar berikut:
Gambar 2.4 Rumus bangun α- tokoferol (Yoshida, dkk., 2007)
Beberapa tokoferol ada yang terdapat di alam, salah satunya α-tokoferol yang merupakan senyawa paling aktif secara biologis (Silalahi, 2006). Aktivitas antioksidan dari α-tokoferol dapat mencegah kerusakan sel akibat radikal bebas,
anti aging dan sedang dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efektivitasnya dalam pengobatan Alzheimer (Yoshida, dkk., 2007).
2.5.5 Polifenol
Polifenol adalah kelompok zat kimia yang ditemukan pada tumbuhan. Zat ini memiliki tanda khas yakni memiliki banyak gugus fenol dalam molekulnya. Polifenol memiliki spektrum luas dengan sifat kelarutan pada suatu pelarut yang berbeda-beda, hal ini disebabkan oleh gugus hidroksil pada senyawa tersebut yang dimiliki berbeda jumlah dan posisinya (Hattenschwiler, 2000).
Turunan polifenol sebagai antioksidan dapat menstabilkan radikal bebas dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas. Polifenol merupakan komponen yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antioksidan dalam buah dan sayur (Hattenschwiler, 2000).
2.6 Spektrofotometri UV-Visible
Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis adalah sinar/cahaya dilewatkan melewati sebuah wadah (kuvet) yang berisi larutan, dimana akan menghasilkan spektrum. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan didalam kuvet. Alat ini menggunakan hukum Lambert Beer sebagai acuan (Ewing, 1985).
Ahli kimia telah lama menggunakan warna sebagai bantuan dalam mengenali zat-zat kimia. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual, yaitu dengan menggunakan alat untuk mengukur absorpsi energi radiasi macam-macam zat kimia dan memungkinkan dilakukannya
pengukuran kualitatif dari suatu zat dengan ketelitian yang lebih besar (Day, 1994).
Spektrofotometer UV/Visibel pada dasarnya terdiri atas sumber sinar monokromator, tempat sel untuk zat yang diperiksa, detektor, penguat arus dan alat ukur atau pencatatt. Panjang gelombang untuk sinar ultraviolet antara 200 - 400 nm sedangkan panjang gelombang untuk sinar tampak/visible antara 400 - 750 nm (Rohman, 2007).
2.7 Penentuan Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH
Metode untuk menentukan aktivitas antioksidan ada beberapa cara, yaitu: (1). BCB Method (Carotene Bleaching Method) atau Metode Pemutihan β-karoten, (2). DPPH (1,1-difenil-2- picrylhydrazil) Radical Scavenging Method (Metode Pemerangkapan Radikal Bebas DPPH), (3). Thiobarbituric Acid-Reactive Substance (TBARS) Assay, (4). ORAC Assay (Oxygen-Radical Absorbance Capacity), (5). CUPRAC Assay (Cupric Reducing Antioxidant Capacity), (6). FRAP Assay (Ferric Reducing Antioxidant Power), (7). Determination of Conjugated Dienes, (8). Determination of Lipid Hydroperoxides (De la Rosa, 2010).
Pada tahun 1922, Goldschmidt dan Renn menemukan senyawa berwarna ungu radikal bebas stabil DPPH. DPPH berwarna sangat ungu seperti KMnO4 dan
tidak larut dalam air (Ionita, 2005).
Metode DPPH merupakan suatu metode yang cepat, sederhana dan murah yang dapat digunakan untuk menguji kemampuan antioksidan yang terkandung dalam makanan. Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel yang padat dan juga dalam bentuk larutan. Prinsipnya dimana elektron ganjil pada molekul DPPH memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 517 nm yang berwarna ungu. Warna ini akan berubah dari ungu menjadi kuning lemah apabila elektron ganjil tersebut berpasangan dengan atom hidrogen yang disumbangkan senyawa antioksidan. Perubahan warna ini berdasarkan reaksi kesetimbangan kimia (Prakash, 2001).
Parameter yang dipakai untuk menunjukan aktivitas antioksidan adalah harga konsentrasi efisien atau efficient concentration (EC50) atau Inhibition
Concentration (IC50) yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat
menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat antioksidan yang memberikan % penghambatan 50%. Zat yang mempunyai aktivitas antioksidan tinggi, akan mempunyai harga EC50 atau IC50 yang rendah
(Molyneux, 2004).
2.7.1 Pelarut
Pelarut yang digunakan dalam metode DPPH akan bekerja dengan baik bila menggunakan pelarut metanol atau etanol dan kedua pelarut ini tidak akan mempengaruhi dalam reaksi antara sampel uji sebagai antioksidan dengan DPPH sebagai radikal bebas (Molyneux, 2004).
2.7.2 Pengukuran absorbansi panjang gelombang
Panjang gelombang maksimum (λ maks) yang digunakan dalam pengukuran uji sampel uji sangat bervariasi. Menurut beberapa literatur panjang gelombang maksimum untuk DPPH antara lain 515-520 nm, bagaimanapun dalam praktiknya hasil pengukuran yang memberikan peak maksimum itulah panjang gelombangnya yaitu sekitar panjang gelombang yang disebutkan diatas. Nilai absorbansi yang mutlak tidaklah penting, karena panjang gelombang dapat diatur untuk memberikan absorbansi maksimum sesuai dengan alat yang digunakan (Molyneux, 2004).
2.7.3 Waktu pengukuran
Lamanya pengukuran menurut literatur bervariasi yakni 1 menit, 5 menit, 10 menit, 20 menit, 30 menit, 60 menit, 90 menit, 120 menit sampai 240 menit. Waktu pengukuran yang direkomendasikan adalah 20 menit dan 30 menit. Kecepatan reaksi dipengaruhi oleh sifat dari aktivitas antioksidan yang terdapat di dalam sampel (Marinova dan Batchvarov, 2011).
