Mekanisme
In Vitro Induksi Apoptosis dari RIP
(Ribosome-Inactivating Protein)
Daun Bunga Pukul Empat (Mirabilis jalapa L)
In V itro Mechanism of Apoptosis Induction of RIP
(Ribosome-InactivatingProtein) Isolated from Bunga Pukul Empat (Mirabilis jalapa
L) Leaves
Atina Hussaana1*, Chodidjah2, Sismindari3 dan Sudjadi3
ABSTRACT
Background: Ribosome-inactivating protein (RIP) isolated from the leave of Mirabilis jalapa L (MJ Protein) has shown to possess anticancer activity by triggering apoptosis in HeLa cells in vitro. This study aimed at finding out the trigger mechanisms that induces apoptosis of RIP.
Design and Method: This study was conducted by giving the treatment of MJ Protein to the Hela cell culture in vitro. Then the expression of and activation of caspase-3 were observed using Immunohistochemistry and colorimetry method.
Result: The data showed that the MJ protein treatment increased the caspase-3 expression and increased the activity of caspase-3 in Hela cel culture in vitro.
Conclusion: This result indicates the anticancer potential of MJ protein through its effect on signal tranduction process leading to apoptosis through caspase activation with caspase-3 as apoptosis executor (Sains Medika, 2(1): 23-31).
Key words: Mirabilis jalapa L , Protein MJ, apoptosis, caspase-3
ABSTRAK
Pendahuluan: Ribosome-inactivating protein (RIP) dari daun Mirabilis jalapa, L (Protein MJ) telah diketahui potensinya sebagai antikanker karena mampu memacu apoptosis secara in vitro pada kultur sel HeLa. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kemungkinan jalur mekanisme pemacuan apoptosis dari RIP tersebut, apakah melalui aktivasi caspase.
Metode Penelitian: Penelitian ini dilakukan dengan memberikan perlakuan Protein MJ secara in vitro pada kultur sel HeLa, kemudian dilihat ekspresi dan aktivitas caspase-3 melalui pengecatan imunositokimia dan dengan metode kolorimetri.
Hasil penelitian: Data penelitian menunjukkan bahwa pemberian Protein MJ mampu meningkatkan ekspresi caspase-3 dan meningkatkan aktivitas caspase-3 pada kultur sel HeLa secara in vitro.
Kesimpulan: Hasil penelitian tersebut mengimplikasikan potensi antikanker dari Protein MJ melalui pengaruhnya pada proses transduksi sinyal yang memacu apoptosis, melalui aktivasi caspase, dengan caspase-3 sebagai eksekutor terjadinya apoptosis (Sains Medika, 2 (1): 23-31).
Kata kunci : Mirabilis jalapa, L , Protein MJ, apoptosis, caspase-3
PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit yang menyebabkan kematian nomor dua setelah
penyakit jantung di Amerika, dan nomor enam di Indonesia (Anonim, 1998). Selama ini
pengobatan kanker dilakukan dengan pembedahan, kemoterapi dan radiasi. Antikanker
yang digunakan dalam kemoterapi, selama ini didasarkan pada kemampuan menghambat
proliferasi sel, sehingga sel normal pun akan terkena dampaknya. Strategi baru untuk
1 Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung (UNISSULA) * Email: [email protected]
mengembangkan antikanker dengan tujuan untuk mengurangi efek samping, salah satunya
adalah dengan mempengaruhi transduksi sinyal yang menuju apoptosis, sehingga
merupakan antikanker yang selektif dan spesifik (Carmichael, 1994).
Ribosome-Inactivating Protein (RIP) adalah protein tanaman yang terdistribusi
luas pada tanaman. Protein tersebut menghambat sintesis protein karena aktivitas RNA
N-glikosidasenya, dengan memotong ikatan glikosidik adenin tertentu pada 28S rRNA
(26S rRNA khamir). Pemotongan ini mencegah pengikatan faktor perpanjangan 2 (EF-2)
pada ribosom sehingga sintesis protein berhenti (Chaddock et al., 1996). Selain aktivitas
N-glikosidase, RIP juga mempunyai aktivitas memotong DNA plasmid superkoil dan
sirkuler secara in vitro (Roncuzzi & Gasperi-Campadin, 1996). Protein sejenis RIP dari
Mirabilis jalapa L telah dibuktikan mampu menginduksi apoptosis pada sel HeLa (Ikawati
et al., 2002). Protein sejenis RIP dari Mirabilis jalapa L tersebut kemudian diisolasi dan
dimurnikan sehingga diperoleh Protein MJ atau MJ-30, RIP dengan ukuran 30 kDa (Sudjadi
et al., 2003) yang bertanggung jawab terhadap induksi apoptosis. Adanya kemampuan
induksi apoptosis tersebut menjadikan Protein MJ berpotensi sebagai kandidat
antikanker. Akan tetapi, mekanisme aksi yang terlibat di dalam proses induksi apoptosis
tersebut sebagai penentu selektivitas dan spesifisitas antikanker, belum diketahui.
Apoptosis dapat terjadi dengan mekanisme yang beragam, diantaranya adalah:
(1) apoptosis yang dipicu oleh sinyal dari dalam sel, biasanya melalui aktivasi
9, (2) apoptosis yang dipicu oleh sinyal dari luar sel, biasanya melalui aktivasi
caspase-8, (3) apoptosis yang dipicu oleh Apoptosis-Inducing Factor (Anonim, 2003 a). Adapun
caspase (Cystein Aspartate Specific Proteases) merupakan enzim yang bertanggungjawab
terhadap perusakan (disasembly) sel secara sengaja menjadi bentuk apoptotik.
Caspase-8 mengawali proses perusakan sebagai respon terhadap ligan ekstraseluler yang
mengaktivasi death domains pada reseptor sitoplasma (Ashkenazi & Dixit, 1998 cit.
Anonim, 2003 b). Caspase-9 mengawali perusakan sebagai respon terhadap zat yang
memacu pelepasan sitokrom C dari mitokondria (Liu et al., 1996; Green & Reed, 1998 cit.
Anonim, 2003 b), sedangkan caspase-3 mengamplifikasi sinyal dari caspase-8 atau
caspase-9 menuju apoptosis (Li et al., 1997 cit. Anonim 2003 ). Adapun ricin, suatu RIP
dari tanaman Ricinus communis, ternyata mampu menginduksi apoptosis melalui aktivasi
timbul dugaan bahwa induksi apoptosis oleh MJ-30 kemungkinan juga melalui aktivasi
caspase. Untuk membuktikan hal tersebut, dilakukan penelitian ini.
METODE PENELITIAN
Isolasi dan pemurnian
Protein MJ diperoleh dengan mengisolasi protein dari daun Mirabilis jalapa L
menggunakan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M natrium klorid
pada suhu 4°C (Stirpe et al., 1983). Ekstrak protein yang diperoleh kemudian dimurnikan
dengan kromatografi kolom menggunakan fasa diam CM Sepharose CL-6B dan dielusi
dengan dapar natrium fosfat 5 mM pH 6,5. Setelah semua puncak keluar, protein yang
terikat pada fasa diam dielusi dengan dapar natrium fosfat 50 mM yang mengandung
natrium klorid secara bergradien. Protein MJ dihasilkan dari fraksi yang terelusi pada kadar
natrium klorid sekitar 0,25 - 0,3 M (Sudjadi et al., 2003). Fraksi tersebut mempunyai aktivitas
mampu memotong DNA superkoil dan mempunyai ukuran protein 30 kDa.
Uji ekspresi Caspase-3 dengan imunositokimia
Sel HeLa dengan konsentrasi sel 5 x 105 sebanyak 100 µl diinkubasi bersama MJ-30
dengan dosis 1,52 dan 4,55 µg/200 µl selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, sel dipanen dan
dicuci dengan PBS (Phosphate Bovine Saline). Sel kemudian diteteskan di atas gelas obyek
polilisin dan dilakukan pengecatan imunositokimia dengan antibodi terhadap caspase-3.
Hasil pengecatan diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali dan
dibandingkan dengan kontrol tanpa Protein MJ.
Uji Aktivitas Caspase-3 dengan metode pengukuran aktivitas secara kolorimetri
(Caspase-3 Colorimetric Assay kit, Promega)
Sel HeLa dengan konsentrasi 106 sel/ml sebanyak 1 ml diinkubasi bersama MJ-30
dengan dosis 0,056 µg/µl selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel dipanen dan dicuci dengan
PBS. Sel disentrifugasi dan diresuspensikan dalam buffer lisis. Setelah inkubasi selama 15
menit di atas es, debris sel disentrifugasi pada 12.000 g, 20 menit, 4°C. Supernatan diambil
dan diberi 2 µl substrat DEVD-pNA (Caspase-3 Colorimetric Assay kit). Substrat akan dipecah
HASIL PENELITIAN
Uji ekspresi Caspase-3
Pada penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa protein MJ hasil isolasi dari daun
M. jalapa L. mampu menginduksi apoptosis pada sel HeLa dengan menyebabkan
fragmentasi DNA (data tidak ditunjukkan). Hal tersebut mendorong dilakukannya penelitian
untuk mengetahui mekanisme induksi apoptosis atau jalur transduksi sinyal pada proses
induksi apoptosis tersebut. Untuk itu, pada penelitian ini dilakukan uji ekspresi caspase-3
untuk mengetahui jalur transduksi sinyal apakah melalui aktivasi caspase (
caspase-dependent apoptosis). Data pengecatan imunositokimia terhadap caspase-3 (Gambar 1.),
menunjukkan adanya peningkatan warna coklat pada sitoplasma sel yang mendapat
perlakuan dengan Protein MJ (dosis 7,6 ng/µl). Hal tersebut menandakan terjadinya
peningkatan caspase-3.
Gambar 1. Peningkatan ekspresi caspase-3 pada sel HeLa karena perlakuan Protein MJ selama 24 jam dengan metode imunositokimia (perbesaran 1000 kali): (a) Sel HeLa kontrol tanpa perlakuan Protein MJ, (b) Sel HeLa yang mendapat perlakuan dengan Protein MJ 7,6 ng/µl. Terlihat adanya peningkatan jumlah sel yang mempunyai sitoplasma berwarna coklat (tanda panah merah)
Uji aktivasi Caspase-3 dengan metode pengukuran aktivitas secara kolorimetri
(Caspase-3 Colorimetric Assay kit, Promega)
Proses transduksi sinyal menuju apoptosis pada umumnya tergantung pada aktivitas
caspase (Cysteine Aspartic Acid-specific Protease) atau caspase-dependent apoptosis. Untuk
mengetahui apakah proses apoptosis yang diinduksi oleh Protein MJ pada sel HeLa
merupakan caspase-dependent apoptosis, pada penelitian ini dilakukan pengukuran
aktivitas caspase-3. Prinsip pengukuran aktivitas caspase pada penelitian ini didasarkan
pada kemampuan caspase-3 untuk memotong substrat spesifik yang dilabel dengan
p-nitroanilin bebas berwarna kuning yang dapat ditetapkan kadarnya secara
spektrofotometri pada 405 nm. Jumlah p-nitroanilin yang terbentuk sebanding dengan
besar aktivitas caspase-3 (Thornberry, 1994). Induksi apoptosis oleh caspase-3 akan
dihambat oleh Z-VAD-FMK yang merupakan inhibitor caspase-3. Inhibitor tersebut akan
memblok sisi pemotongan substrat oleh caspase-3 secara ireversibel (Hartfield et al.,
1998).
Hasil uji aktivasi caspase menunjukkan bahwa MJ-30 menyebabkan peningkatan
aktivitas caspase-3. Sel HeLa yang mendapat perlakuan dengan MJ-30 dosis 0,056 µg/µl,
mengalami peningkatan aktivitas caspase-3 sebesar 9,5 % dibanding dengan sel HeLa
kontrol, sedangkan pada sel HeLa yang mendapat perlakuan dengan MJ-30 dan
Z-VAD-FMK, aktivitas caspase-3 nya sangat rendah yaitu 40,6% dibawah kontrol (Gambar 2).
Gambar 2. Aktivitas Caspase-3. Aktivitas caspase-3 ditunjukkan dengan besar serapan pada 405 nm (A405 nm). Aktivitas caspase-3 pada sel HeLa kontrol, sel HeLa yang mendapat perlakuan dengan MJ-30 0,056µg/µl dan yang mendapat perlakuan dengan MJ-30 + Z-VAD-FMK, berturut-turut adalah 0,106; 0,116 dan 0,063. Terjadi peningkatan aktivitas caspase-3 yang diakibatkan oleh MJ-30, sebesar 9,5% .
PEMBAHASAN
Protein MJ yang merupakan Ribosome inactivating protein hasil isolasi dari daun
M. jalapa, mampu menginduksi apoptosis melalui jalur aktivasi caspase (caspase-dependent
apoptosis). Secara lebih detil, jalur aktivasi caspase yang diinduksi oleh Protein MJ ternyata
dimulai dari peningkatan ekspresi protein p53 (Hussaana et al., 2010) yang menjadi
upstream dalam proses transduksi sinyal menuju apoptosis.
faktor transkripsi dari gen-gen yang menjadi target gen p53 (downstream gen). Target gen
p53 dan fungsi fisiologis dari masing-masing target gen tersebut sangat beragam. Diantara
target gen p53 tersebut adalah gen Bax yang akan meneruskan proses transduksi sinyal
menuju apoptosis. Peningkatan ekspresi protein p53 kemungkinan akan diikuti dengan
peningkatan transkripsi Bax. Protein Bax akan bertindak sebagai penghambat transkripsi
Bcl-2, suatu protein anti apoptosis. Peningkatan ekspresi Bax dan penurunan ekspresi
Bcl-2 akan memacu pelepasan sitokrom C dari mitokondria (Liu et al., 1996 ; Green &
Reed, 1998 cit. Anonim, 2003). Sitokrom C akan mengaktifkan jalur selanjutnya yang
merupakan rangkaian proses proteolitik yang dikatalisis oleh caspase.
Adapun caspase (Cystein Aspartate Specific Proteases) merupakan enzim yang
bertanggungjawab terhadap perusakan (disasembly) sel secara sengaja menjadi bentuk
apoptotik. Caspase adalah kelompok enzim protease yang berperan dalam apoptosis sel
mamalia (Nicholson et al., 1995). Aktivasi caspase terjadi sebagai akibat dihentikannya
growth factor, pemaparan radiasi atau zat kemoterapi, atau inisiasi proses kematian sel
yang diperantarai reseptor Fas/Apo-1.
Pada penelitian ini telah dibuktikan bahwa Protein MJ mampu meningkatkan
aktivitas caspase-3 pada sel HeLa. Caspase-3 mempunyai peran sentral dalam rangkaian
reaksi apoptosis, secara spesifik memotong ujung C dari residu aspartat dari urutan asam
amino DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) (Garcia et al., 1999). Walaupun peningkatan aktivitas
caspase-3 yang terjadi relatif kecil, tetapi hasil tersebut sejalan dengan hasil uji ekspresi
3 dengan imunositokimia yang menunjukkan adanya peningkatan ekspresi
caspase-3 pada sel HeLa yang mendapat perlakuan dengan Protein MJ.
Mekanisme induksi apoptosis oleh protein MJ pada sel HeLa melalui jalur aktivasi
caspase, didahului oleh peningkatan ekspresi protein p53 dan akhirnya akan terjadi aktivasi
caspase-3 sebagai eksekutor terjadinya apoptosis. Sebagai catatan, pada penelitian ini telah
ditunjukkan bahwa Z-VAD-FMK, suatu inhibitor caspase-3 mampu mencegah aktivasi
caspase-3 yang disebabkan oleh MJ-30, tetapi pada percobaan lebih lanjut ternyata
Z-VAD-FMK tidak menyebabkan penghambatan apoptosis yang diinduksi oleh Protein MJ (data
tidak ditunjukkan). Hal tersebut merupakan temuan yang menarik yang mengarah pada
dugaan bahwa induksi apoptosis oleh Protein MJ kemungkinan melibatkan dua
diluar aktivasi caspase (caspase-independent apoptosis). Walaupun masih memerlukan
penelitian lebih lanjut, dugaan terlibatnya dua mekanisme penginduksian apoptosis
tersebut menyebabkan Protein MJ menjadi kandidat antikanker yang lebih potensial.
Potensi lebih dari Protein MJ tersebut adalah terbukanya peluang Protein MJ untuk
dikembangkan menjadi anti kanker, baik untuk sel kanker yang tidak terdapat mutasi
pada gen p53 sehingga dapat diinduksi apoptosisnya melalui jalur aktivasi caspase,
maupun sel kanker yang terdapat mutasi pada gen p53 yang resisten terhadap induksi
apoptosis melalui jalur aktivasi caspase.
KESIMPULAN
Protein MJ hasil isolasi dari daun Mirabilis jalapa L mampu memacu apoptosis
dengan jalur aktivasi caspase. Jalur tersebut diawali dengan peningkatan ekspresi protein
p53 sebagai upstream regulator yang kemudian melalui rangkaian proses transduksi sinyal
sampai pada peningkatan ekspresi dan aktivitas caspase-3 sebagai eksekutor terjadinya
apoptosis.
SARAN
Pengembangan Protein MJ sebagai anti kanker, baik untuk sel kanker yang tidak
terdapat mutasi pada gen p53 sehingga dapat diinduksi apoptosisnya melalui jalur aktivasi
caspase, maupun sel kanker yang terdapat mutasi pada gen p53 yang resisten terhadap
induksi apoptosis melalui jalur aktivasi caspase.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih kepada Dirbinlitabmas Ditjen Dikti yang telah membiayai penelitian
ini melalui Proyek Hibah Pekerti Angkatan II dengan nomor kontrak: 347/P4T/DPPM/HPTP/
IV/2004.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1998, Apoptosis : Caspase Pathways, Cytokine Bulletin, www. rndsystems. com,
Dikutip tgl. 23.06.2007.
Anonim, 2003, Apoptosis, www. rndsystem. com; October 2003, Dikutip tgl. 30.05.2008.
Anonim, 2003, Apoptosis, http: // users.rcn.com/ jkimball.ma.ultranet/Biology Pages/A/ Apoptosis. Html, Dikutip tgl. 03.08.2009.
Brigotti, M, Alfieri, R, Sestili, P., Bonelli, M, Petronini, P.G., Guidarelli, A. , Barbieri, L. , Stirpe, F. , dan Sperti, S. , 2002, Damage to nuclear DNA induced by Shiga toxin 1 and ricin in human endothelial cells, The FASEB Journal, 16:365 – 372.
Carmichael, J. , 1944, Current Issues in Cancer : Cancer Chemotherapy : Identifying novel anti cancer drugs, BMJ 308: 1288 – 1290.
Chaddock, J. A., Mozingo, A. E., Robertus, J. D., Lord, J. M ., and Robert, L. M., 1996. Major structural differences between pokeweed antiviral protein and ricin A-chain do not account for their differing ribosome specificity, J. Biochem, 235: 159 – 166
Garcia, C.M., et al., 1999, Purification and catalytic properties of human caspase family members, Cell Death Diff., 6: 362-369.
Hartfield, P. J., Bilney, A. J., and Murray, A. W., 1998, Neurotrophic factors prevent ceramid-induced apoptosis downstream of c-Jun N-terminal kinase activation in PC12 cells,
J. Neurochem., 71:161-9.
Hussaana A., Chodidjah, Sismindari, Sudjadi, 2010, Jalur Induksi Apoptosis RIP Hasil Isolasi Daun Mirabilis jalapa, L pada Kultur Sel HeLa, Prosiding Seminar Nasional Farmasi, Imunomodulator dan Perkembangannya, Semarang 15 Mei 2010 (In press).
Ikawati, Z., Sudjadi, Sismindari, Sari, R. P., dan Maulani, N., 2002. Efek fraksi sejenis RIP (Ribosome inactivating protein) yang diisolasi dari akar Mirabilis Jalapa L terhadap proses kematian sel HeLa dan sel Raji, Biologi, 2: 769 – 783.
Kasagi, N., 1999, Ethanol induces apoptosis in human gastric carcinoma cells:The role of apoptosis related molecules, Yonago Acta Me, 42: 197 – 199.
Nelson, DL, Cox, MM., 2000, Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd ed.Worth Publ., New
York, p. 476 – 477.
Nicholson, D. W., 1995, Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis, Nature 376: 37-43.
Roncuzzi, L ., and Gasperi – Campani A ., 1996, DNA nuclease activity of the single chain ribosome inactivating proteins diathin 30, saporin 6 and gelonin, FEBS Let., 392: 16 –20.
Sambrook J, Fritsch E. F and Maniatis T., 1989, Molecular cloning, A laboratory manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Sharif-Askari, E. et al., 2001, Direct cleavage of the human DNA-fragmentation factor-45 by granzyme B induces caspase-activated DNase release and DNA fragmentation,
The EMBO Journal, 20( 12): 3101-3113.
Sismindari and Lord , J.M . 2000 . Ribosome-Inactivating Protein: RNA N-glycosidase activity of Miabilis Jalapa L. Morinda citrifolia L and Carica papaya L, Indon J. Biotech., 324-345.
Stirpe, F. and Barbieri, L., 1986, Ribosome- Inactivating Proteins up to date, FEBS Lett.,
Sudjadi, Ikawati. Z., Sismindari, Krisandika, F. A., 2002, Efek fraksi protein dan biji Mirabilis Jalapa , L pada proses kematian sel Hela, Biologi., 2: 743 – 754
Suprapti, E., 1997, Identifikasi RIPs dari daun, akar dan biji Kembang Pukul Empat( Mirabilis jalapa ) yang tumbuh di Jawa Indonesia, Skripsi, Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta.
Sudjadi, Sismindari, Herawati, T. dan Prasetyowati, A. T., 2003, Pemurnian Ribosome Inactivating Protein (RIP) dari daun Mirabilis Jalapa L. dengan kolom CT9 – Sepharose CL- 6B dan Sephacryl S- 300 HR, Majalah Farmasi Indonesia, 14 (2): 316-321.
