3 Lampiran 1
RINGKASAN PENGKAJIAN KEAMANAN PAKAN JAGUNG PRG EVENT 3272
I. PENDAHULUAN
Jagung merupakan salah satu komoditas pertanian yang dapat bermanfaat sebagai sumber pangan, pakan, dan energi terbarukan. Jagung PRG event 3272 adalah produk PT Syngenta Seed Indonesia yang diklaim dikembangkan untuk memberikan manfaat untuk peningkatan produksi etanol dari jagung. Jagung PRG event 3272 menghasilkan enzim thermostable alpha amylase (AMY797E) dan phosphomannose isomerase (PMI).
Menurut ISAAA (2020), Jagung PRG event 3272 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 16 (enam belas) negara, yaitu Amerika Serikat (2007), Australia, Filipina, Kanada, Meksiko, dan Selandia Baru (2008), Jepang, Rusia, dan Taiwan (2010), Indonesia dan Korea Selatan (2011), Cina (2013), Brasil, Kolombia, dan Malaysia (2016), serta Singapura (2018).
Jagung PRG event 3272 ini telah dinyatakan aman pakan di 9 (sembilan) negara, yaitu Amerika Serikat (2007), Filipina dan Kanada (2008), Jepang dan Rusia (2010), Korea Selatan (2011), Cina (2013), serta Brasil dan Malaysia (2016).
Jagung PRG event 3272 juga telah dinyatakan aman lingkungan di 3 (tiga) negara, yaitu Kanada (2008), Jepang (2010), dan Amerika Serikat (2011). Berdasarkan Peraturan Menteri Pertanian No. 36/Permentan/LB.070/8/2016 Tahun 2016 tentang Pengkajian Keamanan Pakan PRG dan Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian No. 466.2/Kpts/OT.210/H/11/2016 Tahun 2016 tentang Pedoman Teknis Tata Cara dan Mekanisme Pengkajian Keamanan Pakan PRG, TTKH Pakan PRG telah melakukan pengkajian keamanan pakan Jagung PRG event 3272 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pakan sebagaimana diuraikan berikut ini.
II. INFORMASI GENETIK II.1 Elemen Genetik
Jagung PRG event 3272 mengandung dua gen, yaitu gen amy797E dan gen pmi. Gen amy797E memproduksi protein AMY797E yang bertanggung jawab memodifikasi enzim amilase untuk produksi etanol (Lanahan et al., 2003). Gen
4
pmi bertanggung jawab sebagai marka seleksi selama proses regenerasi tanaman setelah ditransformasi (Negrotto et al., 2000).
Promotor gen amy797E adalah GZein (Das et al., 1991) dan terminatornya adalah 35S RNA (Franck et al., 1980).
Promotor gen pmi adalah ZmUbilInt (Christensen et al., 1992) dan terminatornya adalah nopaline synthase (NOS) (Depicker et al., 1982).
II.2 Sumber Gen Interes
Gen amy797E berasal dari tiga mikroorganisme hipertermofilik dari ordo Thermococcales (Lanahan et al., 2003), sedangkan gen pmi berasal dari Escherichia coli (Negrotto et al., 2000).
Promotor GZein berasal dari gen Zea mays 27-kDa storage protein (zein) (Das et al., 1992). Terminator 35S berasal dari genom Cauliflower mosaic virus/CMV (Franck et al., 1980).
Promotor ZmUbilInt berasal dari gen polyubiquitin Zea mays (Christensen et al., 1992) dengan terminator NOS yang berasal dari Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982).
II.3 Sistem Transformasi
Jagung PRG event 3272 dirakit melalui sistem transformasi dengan menggunakan eksplan embrio muda yang dimediasi oleh A. tumefaciens dengan vektor plasmid biner pNOV7013 (Negrotto et al., 2000) yang mengandung dua gen sisipan, yaitu gen amy797E dan pmi yang berfungsi sebagai marka penyeleksi. Plantlet yang beregenerasi diuji terhadap keberadaan gen amy797E dan pmi, serta tidak adanya gen tahan antibiotik spectinomycin (aadA), dengan analisis Taqman PCR. Tanaman yang menunjukkan positif gen amy797E dan pmi, dan negatif untuk aadA, dipindahkan ke rumah kaca dan digunakan untuk perbanyakan lebih lanjut. II.4 Stabilitas Genetik
Analisis molekuler dengan Southern blot telah dilakukan untuk melihat stabilitas gen sisipan dari generasi ke generasi. Hasilnya menunjukkan bahwa gen sisipan tersebut stabil sampai empat generasi silang balik (BC4) mengikuti hukum Mendel. Data karakterisasi molekuler yang diperoleh menunjukkan bahwa Jagung PRG event 3272 mempunyai satu kopi sisipan utuh gen amy797E dan pmi. Analisis Southern blot menunjukkan elemen genetik dari vektor backbone tidak dijumpai dalam Jagung PRG event 3272 (Hill, 2005).
5
Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik disimpulkan bahwa:
a. Jagung PRG event 3272 mengandung satu kopi gen amy797E dan satu kopi gen pmi yang diwariskan mengikuti hukum Mendel.
b. Jagung PRG event 3272 tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pNOV7013.
c. Dua gen interes (amy797E dan pmi) yang diintroduksikan ke dalam Jagung PRG event 3272 masih stabil sampai empat generasi silang balik (BC4). III. INFORMASI KEAMANAN PAKAN
III.1 Kesepadanan Substansial
Tujuan utama perakitan Jagung PRG event 3272 ialah memperoleh enzim amilase tahan panas dalam upaya produksi etanol, bukan untuk mengubah komposisi zat-zat gizinya. Sampel tanaman jagung berupa 2 jagung hibrida (A dan B) yang ditanam di 6 lokasi pada tahun 2003 dan 1 jagung hibrida (B) yang ditanam di 7 lokasi pada tahun 2004 selama 2 musim di Amerika Serikat. Kajian kesepadanan dilakukan pada bagian biji (grain) dan hijauan (forage) jagung. Analisis proksimat (kadar air, abu, protein, lemak, dan serat) biji jagung menunjukkan komposisi Jagung PRG event 3272 tidak berbeda nyata dengan jagung non-PRG dan masih berada dalam kisaran normal komposisi biji jagung (Watson, 1987; OECD, 2002; ILSI, 2004; USDA, 2004). Analisis lebih lanjut pada biji jagung menunjukkan Jagung PRG event 3272 yang mengekspresikan enzim AMY797E tidak berpengaruh terhadap kadar patinya. Analisis proksimat pada hijauan Jagung PRG event 3272 menunjukkan nilai yang masih berada dalam kisaran normal jagung (OECD, 2002; ILSI, 2004).
Analisis terhadap 18 asam amino (isoleusin, leusin, lisin, metionin, sistein, fenilalanin, tirosin, treonin, triptofan, valin, arginin, histidin, aspartat, serin, glutamat, prolin, glisin, dan alanin) telah dilakukan pada biji Jagung PRG event 3272 dibanding dengan jagung non-PRG. Hasilnya menunjukkan kadar asam amino yang diukur pada biji Jagung PRG event 3272 tidak berbeda dengan jagung non-PRG dan masih berada dalam kisaran normal jagung (Souci et al., 1994; OECD, 2002; ILSI, 2004; USDA, 2004).
Analisis mineral makro (kalsium, fosfor, magnesium, dan kalium) dan mineral mikro (mangan, besi, tembaga, dan seng) dilakukan pada biji dan hijauan jagung. Komposisi mineral biji Jagung PRG event 3272 tidak berbeda dengan jagung non-PRG dan masih berada dalam kisaran normal (Watson, 1987; Souci et al., 1994; OECD, 2002; ILSI, 2004; USDA, 2004). Analisis mineral pada hijauan juga menunjukkan nilai yang tidak berbeda antara Jagung PRG event 3272 dan non-PRG, serta masih berada dalam kisaran normal (OECD, 2002; ILSI, 2004).
6
Analisis vitamin larut lemak (vitamin A dan E) dan vitamin larut air (vitamin C, tiamin, riboflavin, niasin, B6, dan asam folat) menunjukkan biji Jagung PRG event 3272 tidak berbeda dengan jagung non-PRG. Demikian juga dengan kadar pigmen (beta-karoten dan kriptoksantin) masih berada dalam kisaran normal (Watson, 1987; Souci et al., 1994; OECD, 2002; ILSI, 2004; USDA, 2004).
Analisis asam lemak (asam palmitat, stearat, oleat, linoleat, dan linolenat) yang mewakili 90% total lemak dalam biji Jagung PRG event 3272 dibandingkan dengan jagung non-PRG. Hasil analisis menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan pada semua asam lemak yang dianalisis dan masih berada dalam kisaran normal jagung (Souci et al., 1994; OECD, 2002; USDA, 2004).
Beberapa zat antinutrisi (inositol, asam fitat, raffinosa, inhibitor tripsin, asam ferulat, dan p-koumarat) telah dianalisis pada biji Jagung PRG event 3272 dan jagung non-PRG. Hasil analisis menunjukkan tidak ada perbedaan nyata antara biji Jagung PRG event 3272 dan jagung non-PRG dan masih berada dalam kisaran normal (Souci et al., 1994; Naczk et al., 1997; OECD, 2002; EuropaBio, 2003; ILSI, 2004).
Disimpulkan bahwa Jagung PRG event 3272 sepadan secara substantial dengan jagung non-PRG.
III.2 Toksisitas
Pengujian toksisitas dilakukan melalui studi bioinformatika, uji kecernaan in vitro, dan toksisitas akut pada mencit.
III.2.1 Studi bioinformatika toksisitas protein AMY797E dan PMI
Sekuen asam amino AMY797E telah dibandingkan dengan protein toksin yang sudah diketahui dan terdaftar pada Entrez Protein Database NCBI (NCBI, 2014). Analisis dilakukan dengan menggunakan BLASTP (Altschul et al., 1997). Nilai ambang batas untuk menentukan signifikansi kesamaan sekuen didasarkan pada pencarian yang dilakukan secara acak pada susunan sekuen asam amino AMY797E. Terdapat 3.629 sekuen protein diidentifikasi memiliki kesamaan sekuen yang signifikan terhadap sekuen asam amino AMY797E. Dari sekuen yang teridentifikasi menunjukkan bahwa sekuen asam amino dari AMY797E tidak ada kesamaan yang signifikan dengan toksin yang sudah dikenal/diketahui atau toksin putatif (McClain, 2014).
Sekuen asam amino PMI telah dibandingkan dengan protein toksin yang sudah diketahui dan terdaftar pada Entrez Protein Database NCBI (NCBI, 2014). Analisis dilakukan dengan menggunakan BLASTP (Altschul et al., 1997). Nilai ambang batas untuk menentukan signifikansi kesamaan sekuen didasarkan pada pencarian yang dilakukan secara acak pada susunan sekuen asam amino
7
PMI. Terdapat 3.944 sekuen protein diidentifikasi memiliki kesamaan sekuen yang signifikan terhadap sekuen asam amino PMI. Dari sekuen yang teridentifikasi menunjukkan bahwa sekuen asam amino PMI tidak ada kesamaan dengan toksin yang sudah dikenal/diketahui atau toksin putatif (Bauman, 2014).
Berdasarkan studi bioinformatika disimpulkan bahwa protein AMY797E dan PMI Jagung PRG event 3272 tidak mempunyai kesamaan dengan protein toksin putatif.
III.2.2 Uji kecernaan in vitro protein AMY797E dan PMI
Uji kecernaan in vitro yang terdiri atas simulated gastric fluid (SGF) dan simulated intestinal fluid (SIF) dilakukan untuk menggambarkan pencernaan biji Jagung PRG event 3272 pada mamalia. Uji SIF mencerminkan pencernaan oleh enzim pankreatin yang berlaku untuk hewan monogastrik dan ruminansia, sedangkan SGF mencerminkan pencernaan pepsin yang hanya berlaku untuk ruminansia (de Fontes dan Kramer, 2005).
III.2.2.1 Uji kecernaan in vitro protein AMY797E pada kondisi SGF Protein AMY797E (AMY797E-0104) dengan berat molekul sekitar 50,2 kDa tidak terdeteksi pada analisis SDS-PAGE setelah 1 menit inkubasi dalam uji SGF, tetapi pada analisis Western blot terdeteksi dua fragmen immunoreactive (sekitar 28–30 kDa). Kedua fragmen tersebut menunjukkan hasil potongan AMY797E, yang kemudian tidak terdeteksi lagi setelah inkubasi dalam uji SGF selama 5 menit. Disimpulkan bahwa protein AMY797E yang diuji cepat dicerna dalam kondisi lambung mamalia (Privalle, 1999).
Berdasarkan uji kecernaan in vitro, protein AMY797E pada kondisi SGF cepat dicerna dalam kondisi lambung mamalia.
III.2.2.2 Uji kecernaan in vitro protein PMI-0198 pada kondisi SGF
dan SIF
Protein PMI-0198 cepat terdegradasi dalam uji SGF sehingga PMI tidak terdeteksi pada analisis SDS-PAGE segera setelah terpapar oleh SGF. PMI juga cepat terdegradasi dalam uji SIF, yaitu tidak terdeteksi setelah 2 menit inkubasi dalam uji SIF. Percobaan dengan mengurangi konsentrasi SGF 0,0001 dari standar konsentrasi menunjukkan bahwa PMI tidak terdeteksi pada analisis SDS-PAGE setelah 10 menit inkubasi. Hal ini menunjukkan bahwa PMI yang diproduksi pada Jagung PRG event 3272 akan mudah dicerna dalam kondisi lambung dan usus mamalia, sama halnya seperti protein dalam pakan konvensional (Privalle, 1999).
8
Berdasarkan uji kecernaan in vitro, protein PMI pada Jagung PRG event 3272 dalam kondisi SGF dan SIF dapat dicerna secara cepat dalam kondisi lambung dan usus mamalia, sama halnya seperti protein dalam pakan konvensional. III.2.3 Uji toksisitas oral akut protein AMY797E dan PMI
Uji toksisitas akut oral pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan mencit strain Alpk:ApfCD-1 untuk protein AMY797E dan Harlan Sprague Dawley untuk PMI. Penggunaan mencit dalam studi ini sudah memenuhi kaidah pemanfaatan hewan model dengan prinsip 3R (Replacement, Reduction, dan Refinement) (Bousfield dan Brown, 2010; Balls et al., 1995).
Studi toksisitas oral akut sampel AMY797E-0104 masing-masing menggunakan 5 ekor mencit jantan dan betina. Pemberian bahan uji dilakukan dengan cara dicekok menggunakan sonde lambung dengan dosis 3.600 mg/kg BB.
Material uji dengan kemurnian 42% AMY797E yang diberikan sebagai dosis tunggal. Kontrol dan perlakuan masing-masing 5 ekor jantan dan 5 ekor betina diberikan 0 (kontrol) atau 1.511 mg/kg BB, dan diamati selama 14 hari. Hasil pengujian menunjukkan tidak ada perbedaan konsumsi, berat badan, berat organ, kelainan makroskopis, tanda-tanda klinis yang menyimpang, dan kematian pada mencit jantan dan betina dibanding dengan kontrolnya (Barnes, 2007).
Studi toksisitas oral akut sampel PMI-0198 dilakukan dengan menggunakan 7 ekor mencit jantan dan 6 ekor mencit betina. Pemberian bahan uji dilakukan dengan cara dicekok menggunakan sonde lambung dengan dosis PMI-0198 sebesar 5.050 mg/kg BB.
Material uji mengandung 60% PMI yang diberikan sebanyak 2 kali dengan jarak sekitar 1 jam dari pemberian pertama, dengan konsentrasi 20% w/v pada larutan carboxymethyl cellulose (CMC) 0,5%. Kontrol (6 ekor jantan dan 5 ekor betina) diberikan CMC 0,5% sebanyak 25,25 ml/kg pada waktu bersamaan dan diamati selama 14 hari. Hasil pengujian menunjukkan tidak ada perbedaan berat badan, tanda-tanda klinis yang menyimpang, kelainan makroskopis setelah dilakukan nekropsi, dan kematian dibanding dengan kontrol. Perkiraan nilai LD50 oral akut PMI-0198 tersebut adalah lebih besar dari 5.050 mg/kg (Kuhn, 1999).
Berdasarkan uji toksisitas oral akut, protein AMY797E dan PMI Jagung PRG event 3272 tidak bersifat toksik.
III.3 Studi Pakan
Tujuan dilakukan studi pakan pada ayam broiler ialah untuk menunjukkan bahwa ransum yang mengandung biji Jagung PRG event 3272 tidak
9
memberikan efek negatif dibanding dengan ransum yang mengandung biji jagung non-PRG.
Studi pakan telah dilakukan pada ayam broiler untuk membandingkan ransum yang mengandung biji Jagung PRG event 3272, biji jagung non-PRG near isogenic, dan biji jagung non-PRG NC 2004 yang dikomersialkan di North Carolina, Amerika Serikat (Brake, 2005). Formula ransum disusun untuk ayam broiler dengan pengujian selama 49 hari pada 900 ekor ayam broiler (jantan dan betina), sebanyak 25 ekor/kandang/ulangan. Pengamatan dilakukan terhadap konsumsi, bobot badan, konversi pakan, daya hidup, berat karkas dan bagian-bagiannya.
Analisis ELISA menunjukkan bahwa ransum memiliki konsentrasi protein AMY797E dan PMI yang sangat rendah. Bobot badan akhir, konversi pakan, dan daya hidup serta berat karkas ayam broiler yang diberi ransum mengandung biji Jagung PRG event 3272 dan non-PRG tidak menunjukkan perbedaan yang nyata.
Dapat disimpulkan bahwa Jagung PRG event 3272 tidak mempunyai dampak negatif terhadap ayam broiler yang dipelihara selama 49 hari.
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. Jagung PRG event 3272 mengandung satu kopi gen amy797E dan satu kopi gen pmi yang diwariskan mengikuti hukum Mendel dan stabil sampai empat generasi silang balik (BC4).
2. Jagung PRG event 3272 sepadan secara substansial dengan jagung non-PRG, dan tidak bersifat toksik.
3. TTKH Bidang Keamanan Pakan PRG menilai bahwa Jagung PRG event 3272 yang diajukan adalah aman sebagai bahan pakan dan pakan.
4. Apabila di kemudian hari ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pakan yang diperoleh hingga saat ini, status keamanan pakan Jagung PRG event 3272 perlu dikaji ulang.
5. Apabila setelah ditetapkan aman pakan, kemudian Jagung PRG event 3272 terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan ternak, pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik Jagung PRG event 3272 dari peredaran.
6. Jagung PRG event 3272 tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkan aman lingkungan.
10 DAFTAR PUSTAKA
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, DJ. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, 25:3389–3402. Balls, M., et al. 1995. The three Rs: the way forward: the report and recommendation of ECVAM Workshop 11. Alternatives to Laboratory Animals, 23(6):838–866.
Barnes, E. 2007. AMY797E-0104: single dose oral toxicity study in the mouse. Study number: CTL/AM7506/REG/REPT REV 001. Syngenta Biotechnology, USA.
Bauman, P.A. 2014. PMI: assesmant of amino acid sequenve similirity to known or putative toxins. Final report. Report number: SSB-108-14. Sygenta Crop Protection, LLC., USA.
Bousfield, B. and Brown, R. 2010. Animal welfare. Veterinary Bulletin, 1(4):1– 12.
Brake, J.T. 2005. Evaluation of event 3272 transgenic maize (corn) in broiler chicken. Report. North Carolina State University, Chicken Education Unit, Lake Wheeler Road Field Laboratory, 4108 Lake Wheeler Road, Raleigh, North Carolina 27603, USA.
Christensen, A.H., Sharrock, R.A., and Quail, P.H. 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology, 18:675–689.
Das, O., Ward, K., Ray, S., and Messing, J. 1991. Sequence variation between alleles reveals two types of copy correction at the 27-kDa zein locus of maize. Genomics, 11:849–856.
de Fontes, J. and Kramer, C. 2005. In vitro digestibility of AMY797E α-Amylase (test substance AMY797E-0104) under simulated mammalian gastric conditions. Report number: SSB-034-04 A1. Syngenta Biotechnology, USA. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., and Goodman, H.M. 1982.
Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular Applied Genetics, 1(6):561–573.
EuropaBio. 2003. Safety assessment of GM crops, document 1.1, substantial equivalence–maize. Issue 2. The European Association for Bioindustries. http://www.europabio.org/pages/eu_ workgroups_ detail.asp?wo_id=14. Franck, A., Guilley, H., Jonard, G., Richards, K., and Hirth, L. 1980. Nucleotide
sequence of Cauliflower mosaic virus DNA. Cell, 21:285–294.
Hill, K. 2005. Stability of Amy797E-Amylase and Phosphomannose Isomerase (PMI) expression over multiple generation in maize (Corn) derived from event 3272. Report number: SSB-005-05. Syngenta Biotechnology, USA.
11
ILSI. 2004. International Life Sciences Institute crop composition database version 2.0. http://www.cropcomposition.org.
ISAAA. 2020. Summary of regulatory approvals: country, year and type of approval: event number 3272. [Online] Available from: https://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=1 11&Event=3272 (Accessed 14 Januari 2020).
Kuhn, J.O. 1999. Acute oral toxicity study in mice. Laboratory Study number: 4708-98. Novartis Seeds, USA.
Lanahan, M.B., Basu, S.S., Batie, C.J., Chen, W., Joyce, C., and Kinkema, M. 2003. Self-processing plants and plant parts. US Patent Application Publication number: US2003/0135885 A1.
McClain, S. 2014. AMY797E: assessment of amino acid sequence similarity to known or putative toxins. Report number: SSB-128-14. Syngenta Biotechnology, USA.
Naczk, M., Amarowicz, R., and Shahidi, F. 1997. α-Galactosides of sucrose in foods: composition, flatulence-causing effects, and removal. In: Shahidi, F. (ed.) Antinutrients and Phytochemicals in Foods. American Chemical Society, Washington D.C., USA.
NCBI. 2014. Entrez protein database. National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA. http//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Protein. (Accessed 22 January 2014).
Negrotto, D., Jolley, M., Beer, S., Wenck, A.R., and Hansen, G. 2000. The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation. Plant Cell Reports, 19(8):798–803.
OECD. 2002. Consensus document on compositional considerations for new varieties of maize (Zea mays): key food and feed nutrients, anti-nutrients and secondary plant metabolites. Publication number: 6, 2002. ENV/JM/MONO 25.
Privalle, L. 1999. In vitro digestibility of PMI protein under simulated mammalian gastric and intestinal conditions. Report number: NSB-002-99. Syngenta Biotechnology, USA.
Souci, S.W., Fachmann, W., and Kraut, H. 1994. Food composition and nutrition tables. 5th edition. CRC Press, Scientific Publishers, Stuttgart, Germany. USDA. 2004. National nutrient database for standard reference, release 16-1.
http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/cgi-bin/list_nut_edit.pl.
Watson, S.A. 1987. Structure and composition. In: Watson, S.A. and Ranstead, P.E. (eds.) Corn: Chemistry and Technology. American Association of Cereal Chemists, Minnesota, USA.
