TESIS
KADAR SERUM 8-HIDROKSI-2’-DEOKSIGUANOSIN
LEBIH TINGGI PADA ABORTUS INKOMPLIT
DIBANDINGKAN DENGAN KEHAMILAN NORMAL
TRIMESTER I
NI MADE SUCIANIPROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2014
TESIS
KADAR SERUM 8-HIDROKSI-2’-DEOKSIGUANOSIN
LEBIH TINGGI PADA ABORTUS INKOMPLIT
DIBANDINGKAN DENGAN KEHAMILAN NORMAL
TRIMESTER I
NI MADE SUCIANI NIM : 0914038112
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
KADAR SERUM 8-HIDROKSI-2’-DEOKSIGUANOSIN
LEBIH TINGGI PADA ABORTUS INKOMPLIT
DIBANDINGKAN DENGAN KEHAMILAN NORMAL
TRIMESTER I
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister Pada
Program Pendidikan Magister, Program Studi Ilmu Biomedik
Program Pascasarjana Universitas Udayana
NI MADE SUCIANI NIM : 0914038112
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
Lembar Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL : 28 NOPEMBER 2014
Pembimbing I Pembimbing II
Prof. Dr. dr. I Gede Putu Surya, SpOG(K) Prof. Dr. dr. Ketut Suwiyoga, SpOG(K) NIP. 194310151970081001 NIP. 195307151980031009
Mengetahui,
Ketua Program Studi Ilmu Biomedik Direktur
Program Pascasarjana Program Pascasarjana
Universitas Udayana Universitas Udayana
Prof. Dr. dr. Wimpie I. Pangkahila, SpAnd,FAACS Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K) NIP. 194612131971071001 NIP. 195902151985102001
Tesis Ini Telah Diuji dan Dinilai Oleh Panitia Penguji pada
Program Pascasarjana Universitas Udayana Pada Tanggal 28 Nopember 2014
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana Nomor : 3732/UN14.4/HK/2014, Tanggal : 07 Oktober 2014
Ketua : Prof. Dr. dr. I Gede Putu Surya, Sp.OG(K)
Anggota : 1. Prof. Dr. dr. Ketut Suwiyoga, Sp.OG(K)
2. Prof. Dr. dr. Wimpie I. Pangkahila, Sp.And., FAACS 3. Prof. dr. N. Agus Bagiada, Sp.BIOK
4. Prof. Dr. dr. N. Adiputra, MOH
UCAPAN TERIMAKASIH
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa karena atas asung wara kertha nugraha-Nya sehingga tesis ini dapat diselesaikan.
Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada : Prof. Dr. dr. I Gede Putu Surya, SpOG(K), selaku pembimbing I dan Prof. Dr. dr. Ketut Suwiyoga, SpOG(K) selaku pembimbing II, Drs. Ketut Tunas, Msi, selaku pembimbing statistik yang telah memberikan dorongan semangat, bimbingan dan saran selama penulis mengikuti Program Pendidikan Dokter Spesialis I (PPDS I) dan Program Magister Program Studi Ilmu Biomedik kekhususan Kedokteran Klinik (Combined Degree).
Ucapan yang sama ditujukan kepada mantan Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana dan saat ini sebagai Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, SpPD-KEMD dan Prof. Dr. dr. Made Bakta, SpPD-KHOM, mantan Rektor Universitas Udayana yang telah menerima kami menjalani Program Pendidikan Dokter Spesialis I di Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Mantan Pembantu Dekan I Fakultas Kedokteran Universitas Udayana saat ini sebagai Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Prof. Dr. dr. I Putu Astawa, MKes SpOT(K). Mantan Direktur Utama Rumah Sakit Sanglah Denpasar, dr. I Wayan Sutarga, MPHM, serta Mantan Kepala Bagian/SMF Obstetri dan Ginekologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana/Rumah Sakit Sanglah Denpasar, Prof. Dr. dr. Ketut Suwiyoga, SpOG(K) yang saat ini menjabat sebagai Ketua Program Studi Obstetri dan Ginekologi atas bimbingan dan dorongan serta kesempatan dan fasilitas yang diberikan untuk mengikuti dan menyelesaikan PPDS I dan Program Magister Program Studi Ilmu Biomedik kekhususan Kedokteran Klinik (Combined Degree) di Universitas Udayana. Terima kasih penulis ucapkan juga kepada Mantan Ketua Program Studi Obstetri dan Ginekologi Fakultas kedokteran Universitas Udayana/Rumah Sakit Sanglah Denpasar, dr. A.A.N. Anantasika, SpOG(K) dan seluruh Dosen/Staf Bagian
Obstetri Fakultas Kedokteran Universitas Udayana/RSUP Sanglah atas segala bimbingan dan dorongan yang diberikan selama penulis mengikuti pendidikan spesialis. Ucapan terima kasih yang tulus dan penghargaan kepada seluruh guru yang telah mendidik dari Sekolah Dasar sampai Perguruan Tinggi. Pasien-pasien yang telah menjadi guru yang banyak memberikan pengetahuan dan pengalaman, rekan-rekan residen Obstetri dan Ginekologi, serta rekan-rekan paramedis RSUP Sanglah.
Tidak lupa penulis haturkan ucapan terima kasih yang dalam kepada orang tua Ketut Terning dan mendiang Ayah Ketut Nita yang telah mengasuh dan membesarkan penulis. Kepada suami dan anak tercinta Komang Kariana dan Ni Putu Chandra Maharani yang dengan penuh pengorbanan telah memberikan kepada penulis dukungan moril dan kesempatan untuk lebih berkonsentrasi menyelesaikan tesis ini.
Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan asung wara kertha nugraha-Nya pada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian.
Denpasar, 2014 Penulis, Ni Made Suciani
ABSTRAK
KADAR SERUM 8-HIDROKSI-2’-DEOKSIGUANOSIN LEBIH TINGGI PADA ABORTUS INKOMPLIT
DIBANDINGKAN DENGAN KEHAMILAN NORMAL TRIMESTER I
Abortus adalah berakhirnya kehamilan sebelum janin mampu bertahan hidup atau beratnya kurang dari 500 gram. Diperkirakan 30-50% hasil konsepsi akan mengalami abortus dan 10-12% bisa diketahui secara klinis. Abortus yang paling sering dijumpai di rumah sakit adalah abortus inkomplit, dengan gejala perdarahan dari vagina akibat terlepasnya sebagian atau seluruh bagian plasenta dari uterus serta kanalis servikalis terbuka. Ada beberapa penyebab dan faktor risiko abortus; salah satunya adalah kelainan kromosom. Faktor kelainan kromosom menyumbang sekitar 75% dari penyebab abortus trimester I. Mekanisme penyebab pasti yang menyebabkan abortus tidak jelas, tetapi pada bulan-bulan awal kehamilan, abortus spontan hampir selalu didahului oleh kematian janin itu sendiri. Salah satu faktor yang berperan terhadap kelainan kromosom adalah reactive oxygen species (ROS) yang mampu menyebabkan kerusakan seluler, seperti merusak DNA/RNA, protein dan lipid. Radikal hidroksil adalah salah satu ROS yang dapat merusak DNA. Senyawa 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin (8-OHdG) yang merupakan salah satu ekspresi utama kerusakan DNA dapat diperiksa di dalam serum dengan metode ELISA. Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan bahwa kadar serum 8-OHdG pada abortus inkomplit lebih tinggi dibandingkan dengan kehamilan normal trimester I.
Desain pada penelitian ini adalah studi cross-sectional yang melibatkan 68 orang wanita yang dikelompokkan menjadi 34 orang dengan Abortus Inkomplit dan 34 orang wanita Hamil Normal usia kehamilan < 14 minggu yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi yang datang ke Rumah Sakit Umum Sanglah Denpasar. Dilakukan pemeriksaan kadar 8-OHdG serum pada kedua kelompok dengan metode ELISA.
Berdasarkan uji t-independent terdapat perbedaan yang signifikan antara kadar 8-OHdG serum antara Kelompok Abortus Inkomplit (5,00±1,54 ng/ml) dengan Kelompok Hamil Normal (3,03±0,78 ng/ml). Dalam hal umur ibu, umur kehamilan dan paritas tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara kedua kelompok (p>0,005).
Berdasarkan kurva ROC diperoleh nilai cut of point 3,73 ng/ml. Dengan uji Chi-Square rasio prevalensi adalah 8,5 (RP=8,66; IK95%=2,93-25,62;p=0,001), yang artinya bahwa pada kadar 8-OHdG yang tinggi kejadian abortus inkomplit 8,5 kali lebih banyak dibandingkan hamil normal.
ABSTRACT
EIGHT-HYDROXY-2’-DEOXYGUANOSINE SERUM LEVEL IN INCOMPLETE ABORTION IS HIGHER THAN FIRST TRIMESTER
NORMAL PREGNANCY
Miscarriage or spontaneous abortion is defined as the end of pregnancy before the fetus is able survive or the weight less than 500 grams. Estimated 30-50 percent of the conception will become abortion and 10-12 percent can be known clinically. The most often encountered in the hospital is incomplete abortion which is characterized by vaginal bleeding due to the separation of part or the entire portion of the placenta from the uterus as well as the cervical canal is open. There are several causes and risk factors, one is chromosome abnormalities. Chromosomal abnormalities accounted for around 75 percent of the cause of first trimester abortion. The exact mechanism of the abortion is not clear, but in the early months of pregnancy, spontaneous abortion is almost always preceded by the fetus death. One of the factors that contributed to the chromosome abnormalities are reactive oxygen spesies (ROS) which is capable of causing cell damage such as DNA/RNA, protein and lipids. The hidroxyl radical is one of ROS that can damage DNA. The compound 8-OHdG which is one of the main expressions of DNA damage can be dealt with in the serum by ELISA method. The purpose of this research was to prove that the 8-OHdG serum level in incomplete abortion was higher than first trimester normal pregnancy.
The design of this research was cross-sectional study involving 68 women, grouped into 34 women with Incomplete Abortion and 34 women with Normal Pregnancy less or equal than 14 weeks which meet the criteria of inclusion and exclusion that came to the Sanglah Hospital Denpasar. Blood serum examination was conducted to know the 8-OHdG levels on both groups by the method of ELISA.
Based on t-independent test, there were significant differences (p<0.05) between 8-OHdG serum level in Incomplete Abortion (5,00±1,54 ng/ml) and Normal Pregnancy (3,03±0,78 ng/mL). In terms of mother’s age, pregnancy’s age and the parity, there were no significant differences between groups (p>0.05). Based on ROC curve, cut of point of 8-OHdG serum level was 3,73 ng/ml. From Chi-Square test, prevalence ratio was 8,5 (RP=8,66;CI95%=2,93-25,62; p=0,001), means that in high 8-OHdG serum level the incidence of incomplete abortion was 8,5 times larger compared to normal pregnancy.
DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM ... i
PRASYARAT GELAR ... ii
LEMBAR PENGESAHAN ... iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI ... iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ... v
UCAPAN TERIMAKASIH ... vi
ABSTRAK ... viii
ABSTRACT ... ix
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xiii
DAFTAR GAMBAR ... xiv
DAFTAR SINGKATAN ... xv
DAFTAR LAMPIRAN ... xvi
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang Masalah ... 1
1.2 Rumusan Masalah ... 2 1.3 Tujuan Penelitian ... 2 1.3.1 Tujuan Umum ... 2 1.3.2 Tujuan Khusus ... 3 1.4 Manfaat Penelitian... 3 1.4.1 Manfaat Keilmuan ... 3 1.4.2 Manfaat Praktis ... 3
BAB II KAJIAN PUSTAKA ... 4
2.1 Kehamilan Normal ... 4
2.2 Definisi Abortus ... 4
2.2.1 Abortus inkomplit ... 5
2.2.2 Etiologi dan Faktor Risiko Abortus Spontan ... 6
2.4 Delapan Hidroksi-2’-Deoksiguanosin ... 12
BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS ... 20
3.1 Kerangka Berpikir ... 20
3.2 Konsep Penelitian ... 21
3.3 Hipotesis Penelitian ... 21
BAB IV METODE PENELITIAN ... 22
4.1 Rancangan Penelitian ... 22
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian ... 22
4.2.1 Tempat Penelitian ... 22
4.2.2 Waktu Penelitian ... 22
4.3 Populasi, Pemilihan dan Besar Sampel ... 22
4.3.1 Populasi Penelitian ... 22
4.3.2 Populasi Terjangkau ... 22
4.3.3 Sampel Penelitian ... 23
4.3.4 Pemilihan Sampel ... 23
4.3.5 Penghitungan Besar Sampel ... 23
4.4 Variabel Penelitian ... 24
4.5 Definisi Operasional Variabel... 24
4.6 Alat Pengumpul Data ... 25
4.7 Alur Penelitian ... 25
4.8 Analisis Data ... 26
BAB V HASIL PENELITIAN ... 28
5.1 Karakteristik Sampel Penelitian ... 28
5.2 Perbedaan Kadar 8-OHdG antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan Kelompok Hamil Normal ... 29
5.3 Kadar 8-OHdG pada Kelompok Abortus Inkomplit Lebih Tinggi dibandingkan Kelompok Hamil Normal ... 29
BAB VI PEMBAHASAN ... 31
6.1 Karakteristik Sampel Penelitian ... 31
6.2 Perbedaan Kadar 8-OHdG antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan Kelompok Hamil Normal Trimester I ... 31
6.3 Analisis Rasio Prevalensi antara Kelompok Abortus Inkomplit
dengan Kelompok Hamil Normal ... 33
BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ... 38
7.1 Simpulan ... 38
7.2 Saran ... 38
DAFTAR PUSTAKA ... 39 LAMPIRAN
DAFTAR TABEL
Halaman 2.1 Metabolit Radikal Dan Non Radikal Bebas ... 9 5.1 Karakteristik Subjek Penelitian Antara Kelompok Abortus Inkomplit
Dengan Kelompok Hamil Normal ... 28 5.2 Perbedaan Kadar 8-OHdG Antara Kelompok Abortus Inkomplit Dengan
Kelompok Hamil Normal ... 29 5.3 Kadar 8-OHdG Pada Kelompok Abortus Inkomplit Lebih Tinggi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
2.1 Hubungan Metabolit ROS ... 11
2.2 Pembentukan 8-OHdG Oleh Radikal Hidroksil ... 13
3.1 Konsep Penelitian ... 21
DAFTAR SINGKATAN
8-OHdG : 8-hidroxy-2’-deoxyguanosin COCs : Cumulus Oophorus Cells DNA : Deoxyribonucleic Acid
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay G:C : Guanine:Cytocine
HIV : Human Immunodeficiency Virus HPHT : Hari Pertama Menstruasi Terakhir ICSI : Intracytoplasmic Sperm Injection IUD : Intra Uterine Device
IVF-ET : In Vitro Fertilization-Embryo Transfer ROS : Reactive Oxygen Species
RNA : Ribonucleic Acid T:A : Tymin:Adenine USG : Ultrasonografi UV : Ultra Violet
LAMPIRAN
Lampiran 1. Keterangan Kelaikan Etik Lampiran 2. Informed Consent Penelitian Lampiran 3. Kuisioner Penelitian
Lampiran 4. Surat Ijin Penelitian Lampiran 5. Hasil Penelitian Lampiran 6. Uji Statistik
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Abortus adalah berakhirnya kehamilan baik secara spontan maupun disengaja sebelum janin viabel. Abortus merupakan komplikasi kehamilan trimester I yang paling sering, namun sering tanpa disadari karena dikira suatu keterlambatan atau terjadi bersamaan dengan haid berikutnya. Diperkirakan 30-50% hasil konsepsi akan mengalami abortus tetapi hanya sekitar 10-12% yang teridentifikasi secara klinis. Keluarnya hasil konsepsi dapat sebagai abortus iminens jika baru akan membakat, abortus komplit jika semua hasil konsepsi telah keluar atau sebagai abortus inkomplit jika masih ada hasil konsepsi yang tertinggal. Sekitar 80% abortus terjadi pada trimester I yaitu hingga umur kehamilan 14 minggu (Cunningham, dkk., 2010).
Abortus yang paling sering dijumpai di rumah sakit adalah abortus inkomplit. Upaya menanggulangi abortus saat ini sebagian besar hanya menangani perdarahan tanpa disertai usaha mencari atau mengeksplorasi lebih lanjut kausa abortusnya sendiri. Ada beberapa penyebab dan faktor risiko abortus; salah satunya adalah kelainan kromosom. Faktor kromosom menyumbang sekitar 75% dari penyebab abortus (Cunningham, dkk., 2010). Mekanisme penyebab pasti yang menyebabkan abortus tidak selalu jelas, tetapi pada bulan-bulan awal kehamilan, abortus spontan hampir selalu didahului oleh kematian mudigah atau janin itu sendiri (Griebel, dkk., 2005; Cunningham, dkk., 2006).
Salah satu faktor yang berperan terhadap kelainan kromosom adalah reactive oxygen species (ROS) dengan menyebabkan kerusakan seluler, seperti merusak DNA/RNA, protein dan lipid. Radikal hidroksil adalah salah satu ROS yang dapat merusak DNA, tetapi tidak bisa dinilai secara langsung karena sangat reaktif (Seino, dkk., 2002). Senyawa 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin (8-OHdG) yang merupakan salah satu ekspresi utama kerusakan DNA dapat diperiksa di dalam serum dengan metode ELISA. Kadar 8-OHdG yang tinggi berhubungan dengan tingginya agresi radikal hidroksil dan atau rendahnya kecukupan antioksidan (Ledo, dkk., 2009).
Abortus merupakan salah satu penyumbang kematian ibu akibat perdarahan yang ditimbulkan, serta komplikasi lain yang bisa muncul adalah infeksi, infertilitas dan abortus berulang. Sampai saat ini belum pernah ditemukan adanya penelitian tentang 8-OHdG pada abortus inkomplit di Indonesia. Dengan mengetahui kadar 8-OHdG ini dapat diperkirakan agresi dari radikal bebas yaitu radikal hidroksil pada pasien yang mengalami abortus inkomplit, sehingga nantinya kita dapat melakukan pencegahan abortus lebih dini.
1.2 Rumusan Masalah
Apakah kadar serum 8-hidroksi 2’-deoksiguanosin lebih tinggi pada Abortus Inkomplit dibandingkan dengan Kehamilan Normal Trimester I?
1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan umum
Untuk membuktikan bahwa kadar serum 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin pada Abortus Inkomplit lebih tinggi dibandingkan dengan Kehamilan Normal Trimester I.
1.3.2 Tujuan khusus
1. Untuk mengetahui perbedaan rerata kadar 8-OHdG pada Abortus Inkomplit dan Kehamilan Tormal trimester I.
2. Untuk mengetahui rasio prevalens kadar 8-OHdG yang tinggi terhadap Kejadian Abortus Inkomplit.
1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Manfaat keilmuan
1. Menambah pengetahuan dan pemahaman ROS terhadap kejadian abortus.
2. Sebagai data awal untuk melakukan penelitian selanjutnya. 1.4.2 Manfaat praktis
Bila rerata kadar serum 8-OHdG lebih tinggi pada pasien yang mengalami abortus inkomplit dibandingkan dengan pasien hamil normal trimester I maka sangat besar kemungkinannya menjadi salah satu faktor risiko terjadinya abortus inkomplit sehingga bisa dilakukan upaya pencegahan dan pengobatan dengan antioksidan guna mencegah kejadian abortus berulang.
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
2.1 Kehamilan Normal
Proses kehamilan merupakan bagian yang kompleks karena memerlukan pemahaman tentang oogenesis, spermatogenesis, konsepsi, transportasi, proses nidasi dan selanjutnya diikuti dengan gambaran tentang pembentukan plasenta. Bagian ini merupakan bagian yang penuh dengan kerahasian sehingga masih diperlukan penelitian yang lebih dalam. Kesulitan tersebut disebabkan oleh begitu banyak faktor yang ikut serta dalam proses ini dan akan terus berkembang sesuai dengan hasil penelitian. Antioksidan ensimatik dan non ensimatik telah ditemukan dalam jumlah yang cukup pada spermatozoa, cairan seminal dan cairan folikel ovarium, menunjukkan bahwa molekul ini memiliki peran sejak masa konsepsi. Telah diketahui bahwa kapasitas keseluruhan antioksidan pada organ dan darah janin lebih rendah daripada jaringan orang dewasa, tetapi masih sedikit yang diketahui mengenai transport molekul dengan aktivitas antioksidan pada plasenta trimester pertama (Eric, dkk., 2004).
2.2 Definisi Abortus
Abortus didefinisikan sebagai berakhirnya kehamilan melalui cara apapun sebelum janin mampu bertahan hidup. Definisi lain yang sering dipakai adalah keluarnya janin-neonatus yang beratnya kurang dari 500 gram. Pengertian abortus ini dibatasi pada beberapa sentra pendidikan dan negara dengan berakhirnya kehamilan sebelum 20 minggu (Cunningham, dkk., 2006). Sedangkan abortus
spontan apabila abortus terjadi tanpa tindakan mekanis atau medis untuk mengosongkan uterus. Abortus biasanya disertai oleh perdarahan ke dalam desidua basalis dan nekrosis di jaringan dekat tempat perdarahan. Mudigah menjadi terlepas dan hal ini memicu kontraksi uterus yang menyebabkan ekspulsi. Apabila kantung dibuka biasanya dijumpai janin kecil yang mengalami maserasi dan dikelilingi oleh cairan atau bisa juga janin tidak tampak di dalam kantong dan disebut blighted ovum. Abortus spontan adalah salah satu komplikasi dalam kehamilan yang paling sering, dan diperkirakan 12-15% bisa diketahui secara klinis. Sekitar 17-22% dari seluruh kehamilan berakhir dengan abortus spontan (Gracia, dkk., 2005). Sekitar 80% abortus terjadi pada trimester pertama yaitu hingga umur kehamilan 14 minggu (Cunningham, dkk., 2010). Untuk beberapa alasan abortus spontan sering dibagi menjadi abortus imminens, abortus insipien, abortus inkomplit. Disamping itu abortus juga dapat menjadi missed abortion, abortus septik dan abortus spontan berulang (Griebel, dkk., 2005; Cunningham, dkk., 2006).
Beberapa peneliti melaporkan insiden abortus antara 17-22% (Gracia, dkk., 2005), 10% (Griebel dkk., 2005), 10-12,5% (Cunningham, dkk., 2006).
2.2.1 Abortus inkomplit
Abortus inkomplit adalah abortus yang ditandai dengan terlepasnya sebagian atau seluruh bagian plasenta dari uterus serta kanalis servikalis terbuka (Cunningham, dkk., 2006).
2.2.2 Etiologi dan Faktor Risiko Abortus Spontan
Beberapa peneliti menyatakan bahwa kelainan kromosom adalah penyebab langsung abortus spontan. Sebuah studi meta-analisis menemukan bahwa kelainan kromosom terjadi 49% dari abortus spontan. Autosomal trisomy adalah yang tersering sekitar 52% diikuti oleh polyploidy 21% dan monosomy X 13% (Gracia, dkk., 2005; Griebel, dkk., 2005). Kelainan kromosom yang terjadi pada abortus spontan umumnya secara acak seperti kesalahan gametogenesis maternal-paternal, dispermia dan nondisjunction. Kelainan struktur kromosom individu seperti translokasi dan inversi didapatkan sekitar 6% dari wanita yang mengalami abortus spontan dan sekitar setengah dari kelainan-kelainan ini diturunkan. Sekitar 4-6% kelainan kromosom ini sering dihubungkan dengan kejadian abortus berulang, walaupun kejadiannya jarang (Griebel, dkk., 2005).
Beberapa faktor risiko abortus (Griebel, dkk., 2005) : 1. Umur ibu
2. Kelainan kromosom fetal, perkembangan zigot abnormal
3. Infeksi ibu: vaginosis baktrial, mikoplasmosis, virus herpes simpleks, toksoplasmosis, listeriosis, klamidia, HIV, sifilis, parvovirus B19, malaria, gonorrhea, rubella, cytomegalovirus
4. Penyakit kronis ibu : diabetes yang kurang terkontrol, penyakit autoimun (terutama sindrom antiphospholipid antibodi)
5. Kelainan hormon/endokrin : hipotiroidisme, diabetes mellitus, defesiensi progesteron
6. Pemakaian obat dan lingkungan : konsumsi alkohol, kokain, perokok, gas anestesi (nitrous oxide)
7. Konsepsi setelah 3 sampai 6 bulan setelah melahirkan
8. Obat-obatan : misoprostol, retinoid, methotrexat, obat-obat antiinflamsi nonsteroid
9. Riwayat abortus sebelumnya
10. Toksin : arsenic, polyurethane, carbon disulfide, lead,ethylene glycol, heavy metals, organic solvents
11. Kelainan uterus : kelainan kongenital, adesi, leiomioma
Beberapa penelitian terhadap kromosom embrio, mudigah, janin dan bahkan bayi yang telah lahir, didapatkan bahwa frekuensi kelainan kromosom pada abortus dan bayi lahir mati untuk trimester pertama selalu lebih tinggi dibandingkan dengan frekuensi kelainan kromosom pada bayi lahir hidup.
Lebih dari 60% abortus spontan yang terjadi pada trimester pertama menunjukkan beberapa tipe abnormalitas kromosom/genetik. Abnormalitas genetik yang paling sering terjadi adalah aneuploidi (abnormalitas komposisi, jumlah kromosom). Kelainan kromosom baik pada jumlah ataupun struktur adalah penyebab penting defek pada bayi dan abortus spontan. Diperkirakan sekitar 50% hasil konsepsi akan berakhir menjadi abortus spontan kemudian setengah dari abortus ini memiliki kelainan kromosom. Sekitar 25% hasil konsepsi memiliki defek kromosom mayor.
Jumlah yang sebenarnya dari zigot yang abnormal tidak diketahui karena biasanya zigot ini akan hilang 2 sampai 3 minggu setelah fertilisasi sebelum wanita sadar kalau dirinya sedang hamil sehingga tidak terdeteksi. (Sadler dan Langman, 2003).
Fetus dengan kromosom normal cenderung untuk mengalami abortus pada umur kehamilan yang lebih tua. Begitu banyak pula penelitian yang membahas masalah insidens, prevalensi untuk mencari penyebab, mencari faktor-faktor risiko, serta penanganan terhadap kejadian abortus spontan. Tetapi penelitian
tentang bagaimana cara pencegahan abortus spontan itu sendiri tidak sebanyak penelitian abortus spontan yang lainnya.
2.3 Radikal Hidroksil sebagai ROS
ROS merupakan produk normal yang dihasilkan pada metabolisme seluler. Organisme aerobik memerlukan energi sebagai bahan bakar fungsi biologi. ROS mampu menyebabkan kerusakan seluler, seperti merusak DNA/RNA, protein dan lipid.
Dalam sel aerobik ROS seperti superoxide (O2•
-), hidrogen peroksida (H2O2),
singlet O2, radikal hidroksil (OH•), nitrit oxid (NO•). Sumber ROS dapat dibagi
dua ; sumber endogen misalnya dari sel (netrofil), direct-producing ROS enzymes (NO synthase), indirect- producing ROS enzymes (xanthin oxidase), metabolisme (mitokondria), serta penyakit (kelainan metal, proses iskemia). Sumber eksogen misalnya iradiasi gamma, iradiasi UV, ultrasound, makanan, obat-obatan, polutan, xenobiotik dan toksin (Kohen dan Nyska, 2002). Satu sampai lima persen dari oksigen yang diperlukan sel dapat membentuk ROS. Radikal bebas dapat diklasifikasikan menjadi reaktif oksigen spesies dan reaktif nitrogen spesies. Reaktif oksigen spesies bentuk utamanya seperti radikal superoksid, hydrogen peroksida (H2O2), singlet oksigen (O-), dan radikal hidroksil (OH-). Reaktif
nitrogen spesies bentuk utamanya seperti peroksinitrit dan nitrit oksid yang dihasikan selama hipoksia dan menyebabkan cedera reperfusi sel. Berlanjutnya paparan ROS baik dari dalam maupun dari luar mengakibatkan kumpulan dan berlanjutnya kerusakan oksidatif terhadap komponen sel dan mengubah beberapa fungsi sel.
Tabel 2.1
Metabolit radikal dan non radikal oksigen (Kohen dan Nyska, 2002)
Nama Simbol RADIKAL OKSIGEN Oksigen (Bi-radikal) O2•• Ion Superoksida O 2• -Hidroksil .OH Peroksil ROO• Alkoksil RO• Nitrit Oksida NO• NONRADIKAL OKSIGEN Hidrogen Peroksida H2O2
Peroksida organik ROOH
Asam Hipoklorit HOCL
Ozon O3
Aldehid HCOR
Singlet Oksigen 1O2
Peroksinitrit ONOOH
Di antara target biologi yang paling peka adalah protein-protein enzim, membran lipid dan DNA (Kohen dan Nyska, 2002). ROS merupakan promoter penting dalam proses ovulasi. Perkembangan proses meiosis I diinduksi oleh peningkatan ROS dan dihambat oleh antioksidan (Takami, dkk., 2000; Kodaman dan Behrman. 2001). Sel granulosa dan luteal berperan negatif terhadap ROS dan adanya ROS akan menghambat perkembangan meiosis II, menyebabkan berkurangnya aktifitas gonadotropin dan steroidogenik, kerusakan DNA dan hambatan produksi ATP (Behrman, dkk., 2001). Disebutkan bahwa paparan stress oksidatif sebelum fertilisasi dapat mengganggu meiotic spindle dan meningkatkan terbentuknya zigot yang abnormal (Zuelke, dkk., 1997). Aktifitas ROS yang dihasilkan selama fusi gamet dihambat oleh peningkatan produksi antioksidan.
Radikal hidroksil merupakan salah satu ROS yang sangat agresif. Diproduksi di mitokondria dan bertanggung jawab terhadap kerusakan yang terjadi pada mitokondria bukan terhadap nukleus. Mitokondria DNA merupakan target utama radikal oksigen oleh karena lokasinya yang dekat dengan mitokondria membran inti tempat oksidan terbentuk dan aktifitas perbaikan DNA berkurang (Tamura, dkk., 2008).
Radikal hidroksil sangatlah reaktif, mempunyai jangka waktu hidup sangat pendek sehingga tidak bisa dinilai secara langsung, tetapi oksidasi produk DNA atau turunannya dapat dideteksi di urin, serum, saliva, cairan serebrospinal dan jaringan.
Radikal hidroksil bisa diturunkan/diperoleh dari reaksi superoksid yang dikatalisis oleh Fe2+ atau oleh transisi metal sebaik efek yang ditimbulkan oleh radiasi ion dioksigen.
Walaupun DNA stabil, suatu molekul yang terlindungi sangat baik, ROS dapat berinteraksi dan sebabkan beberapa macam kerusakan modifikasi basa DNA, putusnya salah satu atau kedua utas DNA, hilangnya purin (apurinic sites), kerusakan pada gula deoksiribose, ikatan silang antara DNA dengan protein, dan kerusakan pada sistem perbaikan DNA. Kerusakan oksidatif pada dasar DNA dianggap sumber signifikan terjadinya mutasi dan berbagai penyakit degeneratif seperti penuaan dan kanker. Kerusakan DNA secara terus menerus akan diperbaiki dan dasar kerusakan akan diekskresi melalui urin. Tidak semua ROS menyebabkan kerusakan ini. Radikal hidroksil adalah salah satu ROS yang berperan menyebabkan kerusakan ini.
Sketsa di bawah ini mengilustrasikan hubungan antara masing-masing metabolit ROS serta peranannya terhadap kerusakan seluler.
Gambar 2.1 Hubungan Metabolit ROS (Kohen dan Nyska, 2002)
Kelompok radikal yang sering dikenal dengan radikal bebas mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbit atomik atau molekulernya. Elektron yang tidak berpasangan ini menunjukkan tingkat reaktivitas tertentu pada radikal bebas. Kelompok nonradikal terdiri dari berbagai bahan yang beberapa diantaranya sangat reaktif. Molekul oksigen memiliki konfigurasi elektron yang unik dan molekul ini sendiri merupakan bi-radikal karena memiliki dua elektron tidak berpasangan pada dua orbit yang berbeda. (Kohen dan Nyska, 2002). Penambahan satu elektron pada dioksigen akan membentuk radikal superoksid (O2•¯ ). Peningkatan anion superoksida terjadi melalui proses metabolik atau
molekul lain untuk membentuk ROS sekunder baik secara langsung maupun melalui proses enzimatik atau katalisis metal (Valko, dkk., 2007).
2.4 Delapan Hidroksi-2’-Deoksiguanosin
Seperti yang telah disebutkan sebelumnya bahwa peningkatan stress oksidatif dapat menyebabkan radikal bebas menyerang molekul-molekul yang secara fisiologis sangat penting seperti lipid, protein termasuk enzim dan DNA.
Sebagai akibat lanjutan dari kerusakan terhadap purin dan pirimidin akan terjadi modifikasi DNA yang teroksidasi. Guanin dapat diserang oleh OH• pada posisi C-8 menghasilkan 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin (8-OHdG) sebagai produk oksidasinya.
Posisi lain juga dapat diserang dan produk-produk lainnya mungkin saja terbentuk. Di antara basa-basa yang teroksidasi itu 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin yang terbanyak jumlahnya (Zhang, dkk., 2000; Wiktor, dkk., 2004).
Gambar 2.2 mengilustrasikan reaksi dari 2’-deoksiguanosin dengan radikal hidroksil yang diikuti oleh reduksi menjadi 7-hidro-8-hidroksi-2’-deoksiguanosin dan oksidasi menjadi hidroksi-2’-deoksiguanosin (OHdG) dan tautomernya 8-oxo-7-hidro-2’-deoksiguanosin (8-oxodG).
Produk lesi dari oksidasi oleh radikal hidroksil adalah 8-hidroksiguanin, bersama dengan ekivalennya 8-OHdG sangat mutagenik.
Gambar 2.2 Pembentukans 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin oleh Radikal Hidroksil (Valavanidis, dkk., 2009)
Komponen ini menyebabkan mutasi purin ke pirimidin atau pirimidin ke purin (Kohen dan Nyska, 2002). Radikal hidroksil juga dapat menyerang basa yang lain seperti adenin untuk membentuk 8 (atau 4-,5-) hidroksiadenin. Produk-produk lain hasil interaksi antara pirimidin dengan radikal hidroksil yaitu tiamin perokside, tiamin glikol, 5 (hidroksimetil) urasil dan produk-produk lainnya. Interaksi langsung lain antara ROS yang kurang reaktif seperti O2•¯ dan H2O2
tidak menimbulkan kerusakan pada jumlah fisiologi, tapi bagaimanapun produk ini adalah sumber–sumber intermediat reaktif yang mudah diserang dan menyebabkan kerusakan. Seperti contoh H2O2 dan superoksid dapat menghasilkan
ONOO- dan mudah menyebabkan kerusakan DNA sama seperti kerusakan yang melibatkan radikal hidroksil. Transisi metal seperti besi yang menguasai high-binding affinity terhadap lokasi DNA dapat mengkatalisis produksi OH• dan memastikan serangan berulang atas DNA selain oleh karena radikal hidroksil sendiri.
Delapan-hidroksi-2’-deoksiguanosin yang dibentuk oleh ROS pertama kali dilaporkan Kasai dan Nishimura tahun 1984. Senyawa ini dapat terbentuk dari beberapa agen yang menghasilkan ROS.
Delapan-hidroksi-2’-deoksiguanosin (8-OHdG) adalah indikator kerusakan DNA yang sensitif sebagai akibat stres oksidatif. Disebutkan bahwa komponen yang dihasilkan melalui DNA yang rusak diakibatkan oleh radiasi, radikal hidroksil, superoksid atau peroksinitrit. Delapan-hidroksi-2’deoksiguanosin itu sendiri mempunyai peran biologi yang mampu menginduksi konversi G:C ke T:A selama replikasi DNA. Juga digunakan sebagai biomarker renal carsinogenesis, diabetes melitus, kanker dan ageing (Seino, dkk., 2002). Adanya assay yang sensitif untuk 8-hidroksi-2’deoksiguanosin menyebabkan 8-hidroksi-2’deoksiguanosin ini dipakai di banyak laboratorium sebagai biomarker kerusakan oksidasi DNA. Faktor-faktor lain yang mendukung adalah (Halliwell, 2000) :
1. Formasinya di DNA oleh beberapa spesies reaktif seperti singlet oksigen dan radikal hidroksil.
2. Kemampuan mutagenisitinya dalam menginduksi transversi GCTA. 3. Mekanisme multipel yang terlibat dalam pemindahan 8-OHdG dari DNA
asumsi bahwa sel “menganggap” 8-OHdG adalah sebuah ancaman yang segera harus dimusnahkan.
4. Karena prevalensi dan kemudahan dalam mendeteksi senyawa ini pada sampel-sampel biologik (Zhang, dkk., 2000).
Assay Designs’ DNA Damage ELISA adalah immunoassay kompetitif yang cepat dan sensitif untuk deteksi dan kuantifikasi 8-OHdG dalam sampel urin, serum dan saliva. Assay Designs’ DNA Damage ELISA menggunakan antibodi monoklonal 8-OHdG untuk mengikat. Anti 8-OHdG yang mengikat 8-OHdG sampel atau standar akan terbuang, sementara yang ditangkap oleh 8-OHdG tak bergerak akan terdeteksi oleh antibodi sekunder yaitu HRP yang terkonjugasi. Sensitifitas kit DNA Damage ELISA ditentukan yaitu 0,59 ng/mL. Kurva standar memiliki interval antara 0,94-60 ng/mL (Anonim, 2008).
Pada sistem reproduksi wanita ROS dan antioksidan mempunyai peran fisiologi selama folikulogenesis, maturasi oosit, regresi luteal dan fertilisasi (Agarwal, dkk., 2006). Sebagai contohnya adalah peningkatan marker kerusakan oksidatif DNA, 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin pada sel granulosa dan cumulus oophorus cells (Seino, dkk., 2002), berhubungan dengan rendahnya kemampuan fertilisasi oosit, kualitas embrio yang rendah dan mengurangi kesuksesan implantasi.
Disebutkan juga bahwa 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin ini tidak hanya sebagai marker stress oksidatif dalam sel granulosa selama proses ovulasi sehingga mempengaruhi fertilisasi tetapi juga mempengaruhi pertumbuhan embrio (Seino, dkk., 2002).
Beberapa penelitian telah menguji pengaruh stress oksidatif terhadap kualitas oosit in vitro. Persentase oosit matur (tahap meiosis II oosit dengan polar body pertama) secara signifikans menurun dengan pemberian radikal H2O2 dosis
tertentu tetapi dengan menginkubasi oosit dengan antioksidan (melatonin) dosis tertentu maka pengaruh radikal terhadap pematangan oosit dihambat (Tamura, dkk., 2008).
Mungkin sangat besar juga pengaruhnya terhadap kejadian ovum patologis/besarnya oosit berkualitas rendah yang dipicu kronisnya paparan oleh radikal hidroksil.
Kelainan kromosom sangat menonjol dalam penilaian dampak penyakit genetik yaitu sekitar 50% kematian mudigah, 5-7% kematian janin, 6-11 % lahir mati dan kematian neonatus dan 0,9% dari bayi lahir hidup. Gamet-gamet abnormal kecil kemungkinannya menghasilkan konsepsi dibandingkan dengan gamet normal. Apabila tetap terjadi pembuahan maka seleksi menyebabkan sebagian besar hasil konsepsi aneuploidi (kelainan kromosom) akan lenyap sebelum implantasi (Cunningham, dkk., 2006).
Dari beberapa penelitian tentang kualitas oosit, didapatkan kosentrasi 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin pada cairan intrafolikel wanita yang menjalani IVF-ET dengan tingkat degenerasi oosit yang tinggi (Tamura, dkk., 2008).
Dibandingkan dengan siklus IVF pada wanita yang gagal hamil saat IVF-transfer embrio sebelumnya, pemberian salah satu dari tiga pengobatan (melatonin 3 mg/hari, α-tokoferol 600 mg/hari, atau kombinasi keduanya) berhubungan secara
signifikans (P<0,05) dengan berkurangnya konsentrasi 8-OHdG intrafolikel (Ruder, dkk., 2009).
Oksigenasi intrafolikel yang rendah berhubungan dengan penurunan potensi berkembangnya oosit seperti yang direfleksikan dengan meningkatkan frekuensi kerusakan sitoplasma oosit, menyebabkan lemahnya pembelahan dan kelainan segregasi kromosom oosit yang berasal dari folikel yang miskin vaskularisasi. ROS bertanggung jawab terhadap terjadinya fragmentasi embrio sebagai akibat peningkatan apoptosis. Sehingga dengan meningkatnya level ROS tidak memungkinkan pertumbuhan dan perkembangan embrio. Penelitian terkini lebih memfokuskan diri kepada kemampuan growth factors dalam mencegah apoptosis karena pengaruh ROS terhadap embrio in vitro. Plasentasi yang abnormal mengarah kepada stress oksidatif plasenta yang merugikan sinsitiotrofoblast dan terlibat dalam mekanisme etiopatogenesis abortus. Puncak ekspresi dari marker stres oksidatif pada trofoblast terdeteksi pada kehamilan normal dan jika berlebihan akan menyebabkan abortus dini (Agarwal, dkk., 2005).
Perkembangan embrio awal pada mamalia terjadi melalui diferensiasi sistem organ dasar dalam lingkungan rendah oksigen. Kosentrasi oksigen yang rendah pada lingkungan in vitro embrio menurunkan level H2O2 selanjutnya mengurangi fragmentasi DNA dengan demikian memperbaiki kemampuan berkembang. Kosentrasi oksigen yang tinggi (sampai 20%) berhubungan dengan turunnya kompetensi berkembang sebaliknya perkembangan yang cepat terjadi saat kosentrasi oksigen di bawah 5%.
ROS bisa didapatkan endogenous atau eksogenous tetapi keduanya dapat mempengaruhi oosit dan embrio. Kultur media IVF bisa merupakan sumber ROS eksogenous yang mempengaruhi oosit dan embrio preimplantasi. Pada hari pertama level ROS yang tinggi pada media kultur berhubungan dengan perkembangan embrio yang terlambat, fragmentasi yang tinggi, dan berkembangnya morfologi blastokista yang abnormal setelah kultur yang lama. Korelasi yang signifikans telah dilaporkan antara peningkatan level ROS pada hari pertama media kultur dengan tingkat fertilisasi yang rendah pada pasien yang menjalani intracytoplasmic sperm injection (ICSI).
Fertilisasi dan perkembangan embrio in vivo terjadi dalam lingkungan rendah tekanan oksigen. Selama kultur, tekanan oksigen yang rendah lebih efektif memperbaiki implantasi dan tingkat kehamilan dibandingkan dengan yang tinggi tekanan oksigen. Vaskularisasi folikel menentukan kandungan oksigen intrafolikuler serta kemampuan berkembangnya oosit. Hipoksia intrafolikuler menyebabkan kelainan segregasi kromosom dan gangguan mosaik embrio. Hal tersebut menjelaskan kembali bagaimana ROS dapat merusak oosit (Agarwal, dkk., 2005).
Pada kehamilan sendiri metabolisme akan meningkat sehingga memerlukan energi/O2 lebih banyak, maka semakin meningkat pula radikal bebas yang ditimbulkan. Stres oksidatif yang terjadi dapat mengganggu kehamilan jika antioksidan tidak dapat mengimbanginya.
Secara umum sudah diterima bahwa kelainan kromosom fetus merupakan penyebab pada paling sedikit separuh dari abortus dini (Hasegawa, dkk., 1996; Griebel, dkk., 2005; Cunningham, dkk., 2006).
Mekanisme pasti yang menyebabkan abortus tidak jelas, tetapi pada bulan-bulan awal kehamilan, ekspulsi secara spontan hampir selalu didahului oleh kematian mudigah atau janin, dan kelainan kromosom pada mudigah dan janin awal ini menyebabkan banyak atau sebagian besar abortus pada awal kehamilan.
Dengan mengetahui kadar 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin ini, secara tidak langsung dapat diketahui agresi dari radikal bebas atau antioksidan yang bekerja melawan radikal bebas itu dalam hal ini pasien yang mengalami abortus spontan. Sehingga jika memang kadarnya signifikan berbeda dengan pasien normal kita dapat melakukan pencegahan abortus dan bahkan abortus berulang salah satunya dengan pemberian antioksidan secara dini.
BAB III
KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Berpikir
Terjadinya abortus inkomplit diakibatkan multifaktorial. Di antaranya adalah ovum patologik atau hasil konsepsi yang patologik. Radikal hidroksil dapat menyebabkan kelainan kromosom/buruknya kwalitas oosit. Sistem hormonal yang mendukung terjadinya fertilisasi seperti insufisiensi fase luteal, kondisi endometrium dan faktor hormonal yang mengatur peristaltik tuba dan kontraksi uterus, maturasi endometrium dan pembentukan desidua, reaksi dan umpan balik proses nidasi blastokis, serta hubungan seluler trofoblas dengan endometrium sangat menentukan kwalitas dan kelangsungan hidup embrio. Dengan demikian semua faktor yang diperlukan untuk kelangsungan hidup embrio harus berada pada kondisi yang optimal. Begitu juga dengan infeksi dan beberapa penyakit sistemik pada ibu telah diketahui sebagai penyebab abortus spontan. Seseorang yang terpapar radikal hidroksil, jika antioksidan tidak adekuat akan menyebabkan stres oksidatif sampai kemudian mampu merusak DNA.
Radikal hidroksil dapat dinilai secara tidak langsung dengan pemeriksaan 8-OHdG. Jumlah 8-OHdG yang tinggi sangat mungkin memberikan peran besar terjadinya abortus, demikian juga faktor-faktor lainnya seperti umur ibu yang meningkat, anomali uterus, anomali plasenta, penyakit maternal, ketidakseimbangan hormon dan pengaruh lingkungan. Terjadinya abortus inkomplit diperberat dengan adanya faktor-faktor risiko yang mempengaruhi kejadian abortus bila ditemukan bersama-sama.
3.2 Konsep Penelitian
Gambar 3.1 Konsep Penelitian
3.3 Hipotesis Penelitian
Kadar serum 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin lebih tinggi pada Abortus Inkomplit dibandingkan dengan Kehamilan Normal Trimester I.
RADIKAL HIDROKSIL ANTIOKSIDAN
KERUSAKAN DNA (8-hidroksi-2’-deoksiguanosin ↑↑)
KELAINAN KROMOSOM ADEKUAT
HAMIL +STRES OKSIDATIF TIDAK ADEKUAT HAMIL NORMAL HAMIL TRIMESTER I ABORTUS INKOMPLIT Umur ibu Umur kehamilan Paritas Anomali uterus Anomali plasenta Penyakit maternal Ketidakseimbangan- hormon Pengaruh lingkungan KWALITAS OOSIT
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan cross-sectional analytic.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian 4.2.1 Tempat penelitian
Penelitian dilaksanakan di poliklinik dan IRD Obstetri dan Ginekologi RSUP Sanglah Denpasar. Pemeriksaan darah dikerjakan di Laboratorium Patologi Klinik RSUP Sanglah Denpasar.
4.2.2 Waktu penelitian
Penelitian akan dilaksanakan mulai bulan Nopember 2012 sampai dengan Mei 2013.
4.3 Populasi, Pemilihan dan Besar Sampel 4.3.1 Populasi penelitian
Pada penelitian ini yang menjadi populasi adalah semua pasien yang didiagnosis sebagai Abortus Inkomplit dan Hamil Normal Trimester I.
4.3.2 Populasi terjangkau
Populasi terjangkau penelitian ini adalah semua pasien yang didiagnosis sebagai Abortus Inkomplit dan ibu Hamil Normal Trimester I yang datang ke Poliklinik dan IRD Obstetri dan Ginekologi RSUP Sanglah Denpasar.
4.3.3 Sampel penelitian
23
Sampel penelitian adalah semua ibu hamil trimester pertama yang datang ke Ruang Bersalin IRD dan Poliklinik Kebidanan dan Penyakit Kandungan RSUP Sanglah Denpasar yang memenuhi kriteria inklusi.
4.3.3.1 Kriteria inklusi :
1. Ibu hamil yang datang ke poliklinik dan IRD Obstetri dan Ginekologi RSUP Sanglah Denpasar yang didiagnosis Abortus Inkomplit dan ibu hamil Normal Trimester I.
2. Bersedia ikut penelitian. 4.3.3.2 Kriteria eksklusi :
1. Abortus provokatus. 4.3.4 Pemilihan sampel
Sampel ditentukan dengan cara concecutive sampling dari ibu hamil dengan abortus inkomplit yang datang ke poliklinik dan IRD obstetri dan ginekologi RSUP Sanglah Denpasar dari bulan Nopember 2012 sampai dengan Mei 2013yang memenuhi kriteria inklusi.
4.3.5 Penghitungan besar sampel
Sampel dihitung dengan rumus Levy & Lemeshow (2008) : n1 = n2= 2 (Zα + Zβ ) S 2
(x1-x2)
≈ 28 1. α = tingkat kesalahan tipe I dipergunakan 0,05
2. β = tingkat kesalahan tipe II adalah 20% 3. Zα = 1,960
5. S = simpang baku = 80,58 (Wiktor, dkk., 2004)
6. X1= 179,97 (rerata 8OHdG pada Kehamilan Normal) (Wiktor, dkk., 2004) 7. X2= 240 (rerata 8OHdG pada abortus, diharapkan 30% lebih tinggi dari
rerata Hamil Normal)
8. Power penelitian sebesar 90%
Cadangan 20% dari jumlah sampel untuk mengantisipasi kerusakan sampel, sehingga jumlah sampel penelitian sebesar 68, masing-masing kelompok 34 sampel.
4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Variabel bebas
Variabel bebas adalah 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin. 4.4.2 Variabel tergantung
Variabel tergantung adalah Abortus Inkomplit. 4.4.3 Variabel terkontrol
Variabel terkontrol adalah umur ibu, umur kehamilan dan paritas. 4.5 Definisi Operasional Variabel
1. Kadar serum hidroksi-2’-deoksiguanosin adalah nilai satuan 8-hidroksi-2’- deoksiguanosin serum yang diperiksa dengan metoda ELISA dan dikerjakan di Laboratorium Klinik RSUP Sanglah.
2. Abortus Inkomplit Trimester I adalah setiap pasien yang didiagnosis Abortus Inkomplit ≤ 14 minggu oleh tim jaga IRD Kebidanan RSUP Sanglah Denpasar.
4. Umur kehamilan adalah umur hamil trimester I yang dihitung dari hari pertama haid terakhir (HPHT) menurut Naegle.
5. Kehamilan Normal adalah kehamilan trimester I tanpa keluhan dan sesuai dengan umurnya secara klinik atau pada USG ditemukan hal sama.
4.6 Alat Pengumpul Data
Alat-alat pengumpul data meliputi : 1) lembar status pasien
2) timbangan berat badan 3) alat pengukur tinggi badan 4) tensimeter
5) spuit disposibel 3 cc 6) lembar pengumpul data 4.7 Alur Penelitian
Ibu-ibu hamil yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi seperti yang disebutkan di atas dimasukkan dalam sampel Abortus Inkomplit dan sampel Hamil Normal kemudian diminta untuk membaca dan menandatangani formulir yang telah disediakan. Selanjutnya semua sampel penelitian dikelola sesuai dengan pedoman terapi Lab/SMF Obstetri dan Ginekologi FK UNUD/RSUP Sanglah Denpasar.
Langkah-langkah yang akan dilakukan pada penelitian ini adalah:
Gambar 4.1 Alur Penelitian
4.8 Analisis Data
Data dianalisis dengan program SPSS 16.0 for windows dengan langkah-langkah :
1. Karakteristik sampel disajikan secara deskriptif, dengan menggunakan tabel dan narasi.
2. Uji normalitas dengan tes One-Sample Kolmogorov-Smirnov. Penapisan pada ibu Hamil Normal dan Abortus Inkomplit
dengan umur kehamilan ≤14 minggu yang datang ke IRD dan Poliklinik Kebidanan dan Penyakit Kandungan RSUP
Sanglah Denpasar Informed consent Sampel penelitian Abortus Inkomplit ANALISIS DATA Kriteria (inklusi, eksklusi) Hamil Normal Serum Serum
3. Uji homogenitas dengan Levene’s test.
4. Uji t-independent untuk membandingkan nilai rerata 8-OHdG antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan Kelompok Hamil Normal. 5. Perhitungan rasio prevalens dengan uji Chi-Square.
BAB V
HASIL PENELITIAN
Penelitian dengan rancangan cross-sectional yang melibatkan 68 orang sampel dilakukan di Poliklinik dan IRD Kebidanan dan Penyakit Kandungan RSUP Sanglah Denpasar pada bulan Nopember 2012 sampai dengan Mei 2013. 5.1 Karakteristik Sampel Penelitian
Sebanyak 68 orang sampel terdiri dari 34 orang Kelompok Abortus Inkomplit dan 34 orang lainnya Kelompok Hamil Normal. Data karakteristik subjek pada kedua kelompok disajikan pada Tabel 5.1.
Tabel 5.1
Karakteristik subjek penelitian pada Kelompok Abortus Inkomplit dan Kelompok Hamil Normal
Variabel Kelompok p
Abortus Inkomplit Hamil Normal
Umur (th) 26,65± 5,09 28,03±4,79 0,25
Paritas 0,94±0,95 1,18±1,06 0,36
Umur Kehamilan (mgg) 10,79±1,92 10,63±2,13 0,74
Tabel 5.1 di atas, menunjukkan bahwa dengan uji t-independent didapatkan nilai p>0,05 pada ketiga variabel, hal ini berarti bahwa tidak ada perbedaan rerata umur, paritas, dan umur kehamilan antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan Kelompok Hamil Normal.
5.2. Perbedaan Kadar 8-OHdG antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan Kelompok Hamil Normal
Perbedaan kadar 8-OHdG antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan Kelompok Hamil Normal ≤14 minggu diuji dengan t-independent. Hasil analisis disajikan pada Tabel 5.2 berikut.
Tabel 5.2
Perbedaan kadar 8-OHdG antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan Kelompok Hamil Normal
n Rerata 8-OHdG
(ng/ml) SD t P
Abortus Inkomplit 34 5,00 1,54
6,64 0,001
Hamil Normal 34 3,03 0,78
Tabel 5.2 di atas menunjukkan bahwa terdapat perbedaan rerata kadar 8-OHdG antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan Kelompok Hamil Normal ≤14 minggu secara bermakna (p<0,05).
5.3 Kadar 8-OHdG pada Kelompok Abortus Inkomplit Lebih Tinggi dibandingkan Kelompok Hamil Normal
Untuk mengetahui peranan kadar 8-OHdG terhadap terjadinya abortus inkomplit dipakai uji Chi-Square. Nilai cut off point kadar 8-OHdG berdasarkan kurva ROC 3,73 ng/ml, dengan nilai sensitivitas 91,2% dan nilai spesifisitas sebesar 82,4%. Hasil analisis disajikan pada Tabel 5.3.
Tabel 5.3
Kadar 8-OHdG pada Kelompok Abortus Inkomplit lebih tinggi dibandingkan Kelompok Hamil Normal
Kelompok RP IK 95% P Abortus Inkomplit Hamil Normal Kadar 8OHdG Tinggi 31 6 8,66 2,93-25,62 0.001 Rendah 3 28
Tabel 5.3 menunjukkan bahwa kadar 8-OHdG pada Kelompok Abortus Inkomplit lebih tinggi dibandingkan kelompok hamil normal (RP= 8,66; IK 95%= 2,93-25,62; p=0,001).
BAB VI PEMBAHASAN
6.1 Karakteristik Sampel Penelitian
Studi cross sectional pada 68 orang pasien terdiri atas 34 orang sampel abortus inkomplit dan 34 sampel hamil normal ≤14 minggu. Berdasarkan hasil analisis didapatkan bahwa rerata umur ibu Kelompok Abortus Inkomplit sebesar 26,655,09, sedangkan Kelompok Hamil Normal sebesar 28,03±4,79 dan tidak berbeda secara statistik (p>0,05). Rerata paritas Kelompok Abortus Inkomplit adalah 0,94±0,95 dan Kelompok Hamil Normal adalah 1,18±1,06 dan rerata umur kehamilan Kelompok Abortus Inkomplit adalah 10,79±1,92 dan rerata Kelompok Hamil Normal adalah 10,63±2,13.
Berdasarkan hasil analisis dengan uji t-independent didapatkan bahwa karakteristik subjek pada ke dua kelompok tidak berbeda bermakna (p>0,05). Jadi didapatkan dari data tersebut di atas pengaruh dari variabel pengganggu dapat dikurangi pada Kelompok Abortus Inkomplit dan Hamil Normal dengan umur kehamilan ≤14 minggu. Pada penelitian ini umur pada ke dua kelompok tidak berbeda, ini berarti bahwa pada saat hamil terjadinya abortus inkomplit tidak dipengaruhi oleh umur, demikian juga umur kehamilan dan paritas bukan merupakan predisposisi terjadinya abortus inkomplit.
6.2 Perbedaan Kadar 8-OHdG antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan Kelompok Hamil Normal Trimester I
Nilai cut of point kadar 8-OHdG berdasarkan kurva ROC adalah 3,730 ng/ml,
dengan nilai sensitifitas 91,2% dan nilai spesifisitas sebesar 82,4%. Hasil analisis menunjukkan bahwa rerata kadar 8-OHdG pada Kelompok Abortus Inkomplit lebih tinggi dibandingkan Kelompok Hamil Normal (RP= 8,66; IK 95%= 2,93-25,62;p=0,001). Hasil tersebut sesuai dengan hipotesis penelitian ini yaitu kadar serum 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin lebih tinggi pada Abortus Inkomplit dibandingkan dengan Kehamilan Normal Trimester I. Apabila kita analisis hasil penelitian tersebut di atas berarti memang benar terjadi kerusakan DNA pada abortus inkomplit.
Pada masa awal kehamilan, ekspulsi spontan kehamilan umumnya terjadi akibat berhentinya proses-proses biologis pada embrio. Penelitian yang dilakukan terhadap 1000 kasus abortus spontan menunjukkan bahwa 49% kasus terjadi degenerasi embrio. Hal tersebut dapat disebabkan oleh cacat kromosom dari salah satu orang tua yang bertindak sebagai pembawa kromosom cacat. Abnormalitas akibat cacat kromosom dapat dimulai pada saat meiosis gamet, fertilisasi atau pembelahan dini mitosis. Kelainan kromosom yang terjadi lebih dini akibat buruknya kualitas oosit, maka pengeluaran hasil konsepsi abnormal tanpa didahului periode amenorea. Berdasarkan hasil penelitian lain, didapatkan bahwa usia gamet berkaitan dengan kejadian abortus spontan (Hariadi, 2004).
Penelitian kasus kontrol oleh Imam, dkk. (2011) mengevaluasi stres oksidatif dan kerusakan DNA pada keguguran berulang yang tidak diketahui penyebabnya. Hasilnya terjadinya stress oksidatif mengacu pada ketidakseimbangan antara peningkatan level radikal bebas dan rendahnya kapasitas total antioksidan menjadi salah satu faktor penyebab kerusakan DNA. Rata-rata kapasitas total antioksidan
pada sampel kontrol adalah 6,95 mM secara signifikan lebih tinggi dibandingkan pada wanita dengan idiopathic recurrent pregnancy loss 2,98 mM (p<0,05). Rata-rata DNA fragmentasion index (DFI) pada kelompok kasus dan Rata-rata-Rata-rata DFI pada kelompok kontrol secara signifikan (p<0,05) lebih tinggi pada kelompok kasus dibandingkan kelompok kontrol.
Pada penelitian yang dilakukan oleh Kakimoto, dkk. (2002) terhadap tikus percobaan dengan diabetes menunjukkan terdapat kerusakan pada mitokondria DNA ditandai dengan peningkatan kadar 8-OHdG. Pemeriksaan dilakukan dengan memeriksa ekskresi urin per hari untuk menilai kadar 8-OHdG per hari, dan hasilnya 8-OHdG pada tikus percobaan dengan diabetes dan pada tikus kontrol pada 4 minggu pertama berbeda signifikan (p< 0.01) dan pada 8 minggu kedua nilai p< 0.001.
Dewasa ini peran penurunan antioksidan dan peningkatan oksidan atau radikal bebas pada wanita hamil telah banyak diteliti. Hal ini penting untuk mengikuti perkembangan kehamilan. Ketidakseimbangan antara antioksidan dan radikal bebas dalam kehamilan menimbulkan perubahan patologis menghasilkan komplikasi kehamilan. Marker biokimia antioksidan dan oksidan semacam ini sangat berguna dalam mengamati perkembangan kehamilan (Argawal, 2005). 6.3 Analisis Rasio Prevalensi antara Kelompok Abortus Inkomplit dengan
Kelompok Hamil Normal Trimester I
Di samping uji perbedaan kadar 8-OHdG antara ke dua kelompok, juga dianalisis berdasarkan uji Chi-Square (X2) dan didapatkan bahwa kadar 8-OHdG
yang tinggi terjadi Abortus Inkomplit 8,5 kali lebih banyak (IK95%=2,93-25,62; p=0,001) dibandingkan Hamil Normal.
Pada sistem reproduksi wanita ROS dan antioksidan mempunyai peran fisiologi selama folikulogenesis, maturasi oosit, regresi luteal dan fertilisasi. Vaskularisasi folikel menentukan kandungan oksigen intrafolikuler serta kemampuan berkembangnya oosit. Hipoksia intrafolikuler menyebabkan kelainan agregasi kromosom dan gangguan mosaik embrio. Hal tersebut menjelaskan kembali bagaimana ROS dapat merusak oosit (Agarwal, dkk., 2006). Sebagai contohnya adalah peningkatan marker kerusakan oksidatif DNA, 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin pada sel granulosa dan cumulus oophorus cells, berhubungan dengan rendahnya kemampuan fertilisasi oosit, kualitas embrio yang rendah dan mengurangi kesuksesan implantasi. Disebutkan juga bahwa 8-hidroksi-2’-deoksiguanosin ini tidak hanya sebagai marker stres oksidatif dalam sel granulosa selama proses ovulasi sehingga mempengaruhi fertilisasi tetapi juga mempengaruhi pertumbuhan embrio (Seino, dkk., 2002). Kelainan kromosom sangat menonjol dalam penilaian dampak penyakit genetik yaitu sekitar 50% kematian mudigah, 5-7% kematian janin, 6-11 % lahir mati dan kematian neonatus dan 0,9% dari bayi lahir hidup. Gamet-gamet abnormal kecil kemungkinannya menghasilkan konsepsi dibandingkan dengan gamet normal. Apabila tetap terjadi pembuahan maka seleksi menyebabkan sebagian besar hasil konsepsi aneuploidi (kelainan kromosom) akan lenyap sebelum implantasi (Cunningham, dkk., 2006).
Hal tersebut dapat terjadi akibat buruknya kualitas oosit dan sistem hormonal yang mendukung terjadinya fertilisasi seperti insufisiensi fase luteal. Kondisi endometrium dan faktor hormonal yang mengatur peristaltik tuba dan kontraksi uterus, maturasi endometrium dan pembentukan desidua, reaksi dan umpan balik proses nidasi blastokis, serta hubungan seluler trofoblas dengan endometrium sangat menentukan kualitas dan kelangsungan hidup embrio. Dengan demikian semua faktor yang diperlukan untuk kelangsungan hidup embrio harus berada pada kondisi yang optimal. Begitu juga dengan infeksi dan beberapa penyakit sistemik pada ibu telah diketahui sebagai penyebab abortus spontan.
Radikal hidroksil dapat menyebabkan kelainan kromosom/buruknya kualitas oosit. Dari beberapa penelitian tentang kualitas oosit, didapatkan kosentrasi 8-OHdG pada cairan intrafolikel wanita yang menjalani IVF-ET diperoleh dengan tingkat degenerasi oosit yang tinggi (Tamura, dkk., 2008).
Oksigenasi intrafolikel yang rendah berhubungan dengan penurunan potensi berkembangnya oosit seperti yang direfleksikan dengan meningkatkan frekuensi kerusakan sitoplasma oosit, menyebabkan lemahnya pembelahan dan kelainan agregasi kromosom oosit yang berasal dari folikel yang miskin vaskularisasi. ROS bertanggung jawab terhadap terjadinya fragmentasi embrio sebagai akibat peningkatan apoptosis. Sehingga dengan meningkatnya level ROS tidak memungkinkan pertumbuhan dan perkembangan embrio. Penelitian terkini lebih memfokuskan diri kepada kemampuan growth factors untuk melindungi keadaan embrio in vitro dari pengaruh ROS yang merugikan seperti apoptosis.
Plasentasi yang abnormal mengarah kepada stres oksidatif plasenta yang merugikan sinsitiotrofoblast dan terlibat dalam mekanisme etiopatogenesis abortus. Puncak ekspresi dari marker stress oksidatif pada trofoblast terdeteksi pada kehamilan normal dan jika berlebihan akan menyebabkan abortus dini. (Agarwal, dkk., 2006)
Pada manusia proses oksidatif terjadi didalam mitokondria, gunanya untuk menghasilkan energi yang dibutuhkan manusia itu sendiri. Pada wanita hamil jumlah mitokondrianya bertambah banyak karena plasenta yang terbentuk kaya mitokondria. Bertambahnya jumlah mitokondria akan meningkatkan aktivitas reaksi dan apabila tubuh tidak mampu untuk mengeliminirnya maka terbentuklah suatu keadaan yang disebut stres oksidatif. Terbentuknya spesies oksigen reaktif memicu terjadinya peroksidasi asam lemak tidak jenuh, kerusakan membran lipid maupun darah sehingga mempengaruhi fungsi sel. Beberapa reaksi oksidasi yang terjadi ini menghasilkan radikal bebas oksigen.
Kehamilan merupakan suatu kondisi yang sangat rentan terhadap segala macam stres yang berakibat pada terjadinya perubahan fisiologis maupun fungsi metabolik. Pada kehamilan juga terjadi peningkatan kebutuhan energi dan oksigen. Di samping itu plasenta ternyata mengandung banyak mitokondria yang meningkatkan proses metabolisme oksidatif untuk menghasilkan energi. Proses metabolisme ini meningkatkan penggunaan oksigen dan apabila oksigen yang digunakan tidak maksimal, menyebabkan terbentuknya stres oksidatif dan keadaan ini menghasilkan radikal bebas berlebihan yang akhirnya berpengaruh terhadap kelangsungan suatu proses kehamilan.
Serangan radikal hidroksil terhadap oosit sebelum fertilisasi juga serangan terhadap proses fertilisasi dan perkembangan embrio,, implantasi, pembentukan dan perkembangan plasenta sama-sama memberikan peran yang sangat besar terhadap kelangsungan kehamilan di trimester pertama.
BAB VII
SIMPULAN DAN SARAN
7.1 Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian ini didapatkan kadar serum 8-OHdG secara bermakna lebih tinggi pada Kelompok Abortus Inkomplit dibandingkan dengan Kelompok Hamil Normal. Pada kadar 8-OHdG yang tinggi risiko terjadinya abortus inkomplit adalah 8,5 kali lebih banyak dibandingkan hamil normal. 7.2 Saran
Diperlukan penelitian multisenter, penelitian kasus kontrol atau penelitian kohort dengan memanfaatkan hasil penelitian ini untuk meningkatkan tingkat kepercayaan. Perlu dipertimbangkan untuk memeriksa kadar 8-OHdG dan pemberian antioksidan sebelum merencanakan hamil untuk mencegah terjadinya abortus inkomplit.
DAFTAR PUSTAKA
Agarwal, A., Gupta, S., and Sharma, R. K. 2005. Role of Oxidative Stress in Female Reproduction. Reproductive Biology and Endocrinol; 3: 28-35
Agarwal, A. .2006. Role of Oxidative Stress in Female Reproduction. Reproductive Biology and Endocrinology. Available from: http://www.rbej.com Anonim. 2008. DNA damage ELISA kit: For the detection and quantification of
8-hydroxy-2’-deoxiguanosine in urine, serum, and saliva samples. www.assaydesigns.com, Toll free 1-800-833-8651 Fax 734-668-2793.
Behrman, H.R., Kodaman, P.H., Preston, S.L., Gao, S. 2001. Oxydative stress and the ovary. J.Soc Gynecol Investig, 8 (suppl.1):S40-S42.
Cunningham, F.G., Gant, N.F., Leveno, K.J., Gilstrap, III L.C., Hauth, J.C., Wenstrom, K.D. 2006. Abortus : Abortus Inkomplit. Obstetric Williams, 2:951-965.
Cunningham, F.G., Gant, N.F., Leveno, K.J., Bloom, S.L., Hauth, J.C., Rouse, D.J., Spong, C.Y. 2010. Williams Obstetric. Twenty third edition. The Mcgraw-Hill Companies.
Eric, J., Tereza, C., Jemma, J., Christina, D., Joanne, H., Frank, J., Graham, J. 2004. Distribution and Transfer Pathways of Antioxidant Molecules Inside the First Trimester Human Gestational Sac. Journal Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol.89, No.3.1452-1458.
Gracia, C.R., Sammel, M.D., Chittams, J., Hummel, A.C., Shaunik, A., Barnhart, K.T. 2005. Risk factors for spontaneous abortion in early symptomatic first-trimester pregnancies. Americans College of Obstretrician and Gynecologists, 106(5):993-999.
Griebel, C.P., Halvorsen, J., Golemon, T.B. and Day, A.A. 2005. Management of spontaneous abortion. Am Fam Physician, 72:1243-1250.
Halliwell, B. 2000. Why and how should we measured oxidative DNA damage in nutritional studies? how far have we come?. Am J Clin Nutr, 72:1082-1087.
Hariadi, R. 2004. Ilmu kedokteran fetomaternal. Himpunan Kedokteran Fetomaternal POGI.
Hasegawa, I., Takakuwa, K., Tanaka, K. 1996. The role of oligomenorrhoea and fetal chromosomal abnormalities in spontaneous abortions. Human Reproduction, 11:2304-2305.
Imam, S.N., Shamsi, M.B., kumar, K., Deka, D., Dada, R. 2011. Idiopathic Recurrent Pregnancy Loss: Role of Paternal Factors; A Pilot Study. J Reprod Infertil, 12(4):267-276.
Kakimoto, M., Inoguchi, T., Sonta, T., Yu H.Y., Imamura, M., Etoh, T., Hashimoto, T., Nawata, H. 2002. Accumulation of 8-hydroxy-2’deoxyguanosine and mitochondrial DNA deletion in kidney of diabetic rats. Journal of Diabetes. Vol 51:1588-1589.
Kodaman, P.H., Behrman, H.R. 2001. Endocrine-regulated and protein kinase c-dependent generation of superoxide by rat preovulatory follicles. Endocrinology, 142:687-693.
Kohen, R., Nyska, A. 2002. Oxidation of biological systems: oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reactions,and methods for their quantification. The Society of Toxicologic Pathology, 30:620-650.
Ledo, A., Arduini, A., Asensi, M.A., Sastre, J., Escrig, R., Brugada, M., Aguar, M., Saenz, P., Vento, M. 2009. Human milk enhances antioxidant defences against hydroxyl radical aggression in preterm infants. The American Journal of Clinical Nutrition, 89:210-215.
Levy, P.S., Lemeshow, S. 2008. Sampling of Population: Methods and Application. Fourth Edition. A Willey interscience Publication. John Willey & Sons inc.
Ruder, E.H., Hartman, T.J., Goldman, M.B. 2009. Impact of oxidative stress on female fertility. Curr Opin Obstet Gynecol, 21(3):219-222.
Sadler, T.W., Langman Jan. 2003. General embryology. Langman’s Medical Embryology. Ninth Edition, 8-45.
Seino, T., Saito, H., Kaneko, T., Takahashi, T., Kawachiya, S., Kurachi, H. 2002. Eight-hydroxy-2;-deoxyguanosine in granulose cells is correlated with the quality of oocyte and embryo in an in vitro fertilization-embryo transfer program. American Society for Reproductive Medicine, 77(6):1184-1190.
Umekawa,T., Sugiyama, T., Sagawa, N. 2008. Overexpression of Thioredoxin-1 Reduces Oxidative Stress in the Placenta of Transgenic Mice and Promotes Fetal Growth via Glucose Metabolism. Endocrinology, 149(8): 3980-3988.
Takami, M., Preston, S.L., Behrman, H.R. 2000. Eicosatetraynoic and eicosatriynoic acids, lipoxygenase inhibitors block meiosis via antioxidant action. Am J Physiol Cell Physiol, 278:C646-C650.
Tamura, H., Takasaki, A., Miwa, I., Taniguchi, K., Maekawa, R., Asada, H., Taketani, T., Matsuoka, A., Yamagata, Y., Shimamura, K., Morioka, H., Ishikawa, H., Reiter, R.J., Sugino, N. 2008. Oxidative stress impairs oocyte quality and melatonin protects oocytes from free radical damage and improve fertilization rate. Journal of Pineal Research, 44:280-287.
Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 2009. 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OhdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. Journal of Environmental Science and health Part C, 27:120-139.
