E
E
nz
nz
ym
ym
e
e
-Link
-Link
e
e
d I
d I
m
m
m
m
uno
uno
s
s
orb
orb
e
e
nt
nt
A
A
s
s
s
s
a
a
y
y
(ELISA)
(ELISA)
Kelompok
Kelompok
G
G
h
h
a
a
z
z
i
i
a
a
h
h
K
K
u
u
s
s
u
u
m
m
a
a
w
w
a
a
t
t
i
i
(
(
1
1
8
8
0
0
3
3
4
4
1
1
8
8
6
6
3
3
0
0
4
4
0
0
)
)
I
I
l
l
d
d
a S
a S
a
a
r
r
t
t
i
i
f
f
a
a
S
S
a
a
r
r
i
i
(
(
1
1
8
8
0
0
3
3
4
4
1
1
8
8
6
6
3
3
0
0
6
6
7
7
)
)
I
I
r
r
a
a
n
n
i
i
L
L
a
a
i
i
l
l
a
a
t
t
u
u
l
l
B
B
a
a
d
d
r
r
i
i
a
a
(
(
1
1
8
8
0
0
3
3
4
4
1
1
6
6
6
6
3
3
0
0
6
6
7
7
)
)
Penggunaan enzim untuk
immunoassay
telah ditemukan dan ekspresi terbaiknya
adalah bila enzim digabungkan dengan antibodi fase padat dalam teknik yang
dikenal
enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA).
Variasi pada teknik ini melibatkan sistem kompetitif dan non-kompetitif, tetapi
teknik ini paling baik digunakan bila dikombinasikan dengan dua antibodi
monoklonal dalam format yang disebut ‘dua situs’.
Enzim yang umum digunakan sebagai
llabel
Enzim yang umum digunakan sebagai label meliputi alkali fosfatase,
horseradish
peroksidase, dan β
-galaktosidase. Enzim yang digunakan seharusnya mampu
berikatan kovalen ke antigen atau antibodi, tanpa menghilangkan aktivitas katalitik
dan imunoreaktivitasnya. Glutaraldehid dapat digunakan sebagai senyawa pengikat,
sedangkan enzim glikoprotein seperti peroksidase dapat dihubungkan melalui gugus
karbohidrat dengan menggunakan asam periodat untuk membentuk gugus aldehid
yang reaktif (Bintang, 2010).
ELISA
Sistem
homogen
Dipengaruhi oleh aktivitas enzim dan tidak diperlukan pencucian dan reaksi bertahap. Kerugian tes ini adalah tidak sensitif sehingga tidak digunakan untuk skrining
Sistem
heterogeen
kompetitif ELISA
Kompetitif
:digunakan untuk pengukuran
antigen melalui kompetitif antara antigen yang
tidak dilabel dan antigen yang yang dilabel pada
antibodi yang dilapiskan pada mikroplate
polystirol atau polyvinyl.
Non kompetitif
ELISA adalah sistem yang
paling banyak digunakan dan dikembangkan
karena lebih sensitif dibanding model sistem
lainnya.
Komponen Perangkat ELISA
Antibodi.
Ab adalah immunoglobulin (Ig) dari hewan yang diimunisasi Ag patogen sasaran (AgP).
Antigen.
Ag yang digunakan sebagai AgP pada teknik ELISA adalah partikel vir us, sel bakteri, propagul jamur,
atau senyawa protein dan polisakarida patogen yang antigenik, dapat merangsang timbulnya Ab pada hewan yang
diimunisasi.
Imunoprob (Immunoprobe).
Imunoprob untuk ELISA dibuat dengan mengkonjugasikan Ab dengan suatu enzim
menjadi ‛konjugat Ab-enzim’. Konjugat ini dapat dibuat dengan mengkonjugasikan AbP atau AbS dengan enzim
tertentu.
Substrat dan bahan kimia lain
. Senyawa kimia yang digunakan sebagai media (substrate) untuk reaksi enzimatik
berbeda-beda, bergantung pada enzim yang dugunakan.
Reagen lain yang diperlukan dalam ELISA adalah bufer, blocking reagent, dan pelarut substrat.
Cawan ELISA.
Tempat reaksi ELISA yang mula-mula digunakan adalah cawan polystyrene berlubang 96 buah
yang disebut cawan ELISA (ELISA plate) atau cawan mikrotiter (microtiter plate). Cawan lain yang terbuat dari
polyvinyl dan bahan plastik lain juga telah digunakan.
Tipe ELISA
1. Dir ect
ELISA
Direct ELISA adalah salah satu model ELISA yang langsung diikatkan antara antigen dan antibodi, dimana antibodi harus
ddilabel dahulu baru divisualisasi dengan cara menambahkan substrat..Untuk deteksi langsung, antigen yang dilapisi ke pelat
multi-well dideteksi oleh antibodi yang telah langsung terkonjugasi ke enzim. Metode deteksi ini adalah pilihan yang baik
jika tidak tersedia secara komersial ELISA kits untuk protein target.
Tipe ELISA
2. Inderc t
ELISA
Untuk deteksi tidak langsung, antigen yang dilapisi ke pelat multi-well dideteksi dalam dua tahap atau
lapisan. Pertama antibodi primer yang tidak dilabeli, yang khusus untuk antigen, diterapkan. Selanjutnya,
sekunder berlabel enzim antibodi terikat pada antibodi pertama. Antibodi sekunder biasanya antibodi
anti-spesies dan sering poliklonal (Boster, tanpa tahun).
Model ini banyak digunakan di berbagai tingkatan laboratorium, karena bahan yang digunakan
untuk uji ini sudah banyak dipasarkan dan mudah dibeli di pasaran.
Tipe ELISA
3. S andwis h
ELISA
Sandwich ELISA adalah model tes ELISA yang menggunakan perangkat tiga macam antibodi.
Antibodi pertama biasanya menggunakan antibody monoclonal yang dilapiskan pada mikroplate dan
selanjutnya direaksikan dengan antigen. Setelah dilakukan pencucian baru ditambahkan antibodi kedua atau
sampel serum yang akan dideteksi dan selanjutnya direaksikan dengan antibodi ketiga yaitu fragmen
immunoglobulin anti immunoglobulin yang akan dideteksi. Model ini sering digunakan untuk mendeteksi
antigen selain pada serum, plasma, juga antigen maupun antibodi pada cairan serebrospinal (
cerebrospinal
fluid
), cairan ludah, sekresi air mata.
Tipe ELISA
4. C ompetitive
ELISA
Peristiwa kunci dari ELISA kompetitif (juga dikenal sebagai inhibisi ELISA) adalah
proses reaksi kompetitif antara antigen sampel dan antigen terikat ke sumur pelat
Indere
ct
Direct Sandwi
ch
Competit
ive
Capture Ab Coating
X
X
√
X
Antigen Coating
√
√
X
√
Blocking
√
√
√
√
Sample
(Antigen)
Incubation
X
X
√
√
Primary Ab Incubation
√
√
√
√
Secondary Ab
Incubation
√
X
√
√
Substrate Prep
√
√
√
√
Signal Detection
√
√
√
√
Data Analysis
√
√
√
√
Tabel 1. Summary of KeySteps in Different ELISA Types Sumber: Boster
E nzyme multiplied immunoas s ay technique
(EMIT)
Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique ( EMIT ) adalah metode umum untuk penentuan kualitatif dan
kuantitatif obat dan protein tertentu dalam serum dan urin.
EMIT merupakan teknik immunoassay
, dimana digunakan dasar reaksi imunologik antara antigen dan
antibodi dan untuk beberapa jenis obat yang reseptornya berupa enzim. Pengujian dengan metode ini
didasarkan dari adanya kompetisi antara obat pada sampel dan obat yang telah dilabeli dengan enzim
glukosa-6-fosfat dehidrogenase (G6P-DH) dengan sisi aktif dari suatu antibodi (immunoassay competitive).
Komponen dalam metode uji EMIT:
Komponen yang digunakan dalam metode pengujian EMIT adalah:
R
adio immunoas s ay
(RIA)
RIA (Radioimmunoassay) adalah salah satu teknik immunoassay yang lebih baik dan lebih
sensitif. Teknik ini berdasarkan kompetisi antara antigen yang tidak berlabel dengan jumlah
tertentu antigen sejenis yang telah dilabel, untuk direaksikan dengan reseptor antibodi tertentu
yang mengandung sejumlah antibodi dengan tepat ikatan untuk antigen yang terbatas (Bintang,
2010).
Fluores cence polarization immunoas s ay
(FPIA)
Fluorescence polarization immunoassay
(FPIA) merupakan metode
pengukuran kadar homosistein dalam plasma diukur dengan metoda
fluoresence polarization immunoassay (FPIA).
Contoh Batasan kadar homosistein total mengacu pada klasifikasi
Normal : < 10 µmol /L
Hiperhomosisteinemia Ringan (mild) : 10-15 µmol /L
Hiperhomosisteinemia Sedang (moderate) : 16
–
25 µmol /L
Hiperhomosisteinemia Sedang berat (Intermediate) : 31
–
50 µmol /L Hiperhomosisteinemia Berat
(Severe) : > 50 µmol /L
Keuntungan menggunakan immunoassay :
•Sensitif untuk jumlah sampel yg rendah (ug/L (ppb)
•Pemeriksaan cepat
•Pemeriksaan relatif mudah dilakukan
•Pemeriksaan dapat dilakukan dimana saja (dengan alat penunjang)
•Teknik pengerjaan relatif sederhana
•Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
•Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik)
•Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
•Metode ini untuk mendiagnosa berbagai penyakit diidentifikasi dengan bantuan infeksi,
•Kecepatan pengujian laboratorium
•Kesederhanaan relatif teknik
•Kemungkinan penilaian obyektif
•Kekuatan respon imun terhadap antigen dari patogen
•Pelacakan dinamika respon imun
•Kelebihan metode ini adalah waktu yang diperlukan untuk pengujian relatif singkat sekitar 2-10 menit dan hasil uji dapat dilihat secara langsung.
•Pengujian dengan metode ini juga dapat dilakukan oleh setiap orang karena tidak memerlukan ketrampilan khusus
•Selain itu, metode ini dapat dijadikan sebagai pemeriksaan awal (screening test) untuk uji kualitatif dan dapat dikerjakan langsung di lapangan karena merupakan alat uji yang sederhana
