29
III. METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni sampai bulan September 2018. Persiapan sampel dilakukan di Laboratorium Agroteknologi Universitas Muhammadiyah Malang, sedangkan Isolasi DNA sampel, PCR, Elektroforesis dan analisis data dilakukan di laboratorium Genetika dan Molekular Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang. Sekuensing Nukleotida dilaksanakan di 1st Base, Axil Scientific Pte Ltd.ayang berbasis di Singapura.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan penelitian sampel adalah dua jenis sampel Fusarium yang diperoleh dari dua bagian tanaman yang berbeda, yaitu akar dan tanah pada dataran sedang dari Karangploso. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah: agarose, Tris-Boric PCR master mix, EDTA (TBE), ddH2O, Loading Dye, Beta Mercaptoetanol
Ethidium Bromide (EtBr), Marker, Buffer ekstrasi, PBS, aquades, Kentang, alkohol
70%, Primer ITA1 dan ITS4, dan Tisu.
Alat-alat yang digunakan diantaranya adalah pinset, gunting, cawan petri, , rak tube, tube Eppendorf 0,5 mL dan 1,5 mL, mikropipet (ukuran volume 5-10 μl, 2-20 μl, 20-200 μl, 100-1000 μl), waterbath, blue tip, vortex, sentrifuge HIRAEUS Pico17, spatula, yellow tip, white tip, neraca analitic, microwave, cetakan agar, gelas ukur, erlenmeyer, , Molecular Imager® Agar Doc XR System BIO-RAD, perangkat Elektroforesis BIO-RAD, AE-200 Nano Nucleic Acid Analyzer, dan
30
MyCycler Thermal Cycler BIO-RAD, kertas label, alumuniumfoil, plastik, spidol, erlemeyer, , jarum preparat, autoclave, lampu spiritus.
3.3 Rancangan penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian Deskriptif Eksploratif dan Kualitatif. Objek Penelitian ini adalah Fusarium oxiporum pada dataran sedang Karangploso. 3.4 Pelaksanaan Penelitian
Penelitian dilakukan dalam rangka mengetahui karakter molekuler
Fusarium oxiporum yang bersumber dari akar dan tanah pada dataran sedang
Karangploso. Pelaksanaan penelitian antara lain pembuatan media, mempersiapan sampel, ekstraksi DNA, PCR-elekroforesis, pengamatan di gel Doc, Sekuensing, penyusunan jarak genetik dan rekonstruksi pohon Filogenetik.
3.3.1 Pembuatan Media
a. Media Potato Dextrose Agar (PDA)
1. Mengupasskentangsdan memotong bentuk daduakecil-kecil (1x1acm) 2. Menimbang 20 gadextrose, 20 g agar, dana200 g potongan kentang untuka1
liter PDA
3. Merebus 800 ml aquadesahingga mendidih dan memasukkanakentang kedalam aquades tersebutaserta mendiamkannya selama 10 menitadengan api kecil Menyaring aquades rebusanakentang tersebut kemudian menambahkan dengana20 g agar, dan ditambahkanaaquades sampai l L 4. Merebus kembali larutan tersebutasambil diaduk hingga mendidihadan
31
5. Menuangkan larutan mediaake dalam elemeyer untukadi steril dalam autoclaveadengan suhu 121°Caselama 15 menit.
b. Media water agar (WA) 1. Menimbang agara
2. Merebus aquades dalamapanci hingga mendidih 3. Mengecilkan api pada kompora
4. Memasukkan agar ke dalamaaquades rebusan sambil diadukasampai larutan mendidiha
5. Mematikan kompor kemudian memindahkanalarutan ke dalam elemeyer dan siap untukadisteril dalam autoclave denganasuhu 121°C selamaa15 menit.
c. Media Potato DextroseaBroth (PDB)
1. Mengupas kentang danamemotong bentuk daduakecil-kecil (1x1 cm) 2. Menimbang 20 g dextroseadan 200 g potonganakentang untuk 1 literaPDB 3. Merebus 800 aquades hinggaamendidih dan memasukkanakentang kedalam aquades tersebut sertaamendiamkannya selama 10amenit dengan api kecil. 4. Menyaring aquades rebusan kentangatersebut dan ditambahkan aquades
hinggaa100 ml
5. Merebus kembali larutan sambilamengaduknya hingga mendidihdan tambahkan 20 gadextrose
6. Menuangkan media ke dalamaelemeyer kemudian di strerilapada autoclave dengan suhua121°C selama 15 menit.
3.3.2 Persiapan Sampel
Metode dalam mempersiapkan sampelayang akan digunakan untuk analisis molekuleraadalah metode isolasi single spore yangadikembangkan oleh Choi, Y.H. (1999).aLangkah-langkah pelaksanaan metodeatersebut adalah :
1. Biakan fungi Fusarium oxiporumapada PDA yang telah tersedia dipersiapkanauntuk diperbanyak ke PDAayang baru.
2. Menyiapkan alat dan bahanayang akan digunakan, antaraalain LAF, alkohol, tisue,alampu spirtus, jarum preparat,akertas label, wrap, alat tulis, mediaaPDA.
3. Memindahkan spora dariamiselium menngunakan jarumapreparat kemudian di tanamanapada media PDA yang baru.a
4. Sterilkan di dekataapi spirtus
5. Membungkus bagian samping cawanapetri dengan kertas wrapakemudian memberi label.
6. Menunggu hingga tumbuh sekitara7 HSI
7. Memindahkan spora dari miseliumadengan menggunakan forcaps dalam aquades sterilauntuk mendapatkan suspensi sporaa
8. Memindahkan suspensiaspora ke media Water Agar sterila
9. Mengamati spora hingga terjadiagerminasi setiap 12 atau 24 jamakemudian memindahkan spora yang bergerminasiatersebut ke media PDA untuk persediaan.aBiakan single spore murni siapadigunakan untuk proses selanjutnya setelaha7 HSI.
33
10. Germinasi tersebut dapat pulaadipindahkan ke mediaaPDB bila dibutuhkan sampel basah.aShaker selama 3 hingga 7ahari hingga jumlah miselium di dapatasesuai dengan jumlah yang cukup danasiap digunakan.
11. Langkah-langkah bersertaadokumentasinya dilampirkan padaaLampiran 1. untuk melihat bagaimana metodeaini dilaksanakan sehingga lebih jelas denganabantuan visual.
3.3.3 Ekstraksi DNA
Metodeaektraksi manual DNA Fusarium sp. dilakukanadengan mengacu pada penelitian Mishra (2014).aUrutan langkah kerja ekstraksi DNA berdasarkan metodeatersebut adalah sebagai berikut :
1. 200 mg miselium Fungiadipindahkan ke dalam tabungamicrocentrifuge eppendrof 1/5 mL steril denganabantuan scalpel
2. Menambahkan buffer ekstraksia(0.1 M Tris-HCl, Ph 8, 10amM EDTA pH 8, 2.5 M NaCl, 3.5 %aCATB, 150 mL dari 20 mg/mLaproteinase K) dan glass beads 0.5-1 mmasebanyak 15 buah. Vortex dengan kecepatanatinggi selama 5 menit agar homogen.a
3. Memindahkan sampel ke water bathadengan suhu 56o C selamaa30 menit 4. Sentrifuge sampel 10.000 rpmaselama 10 menit dalam suhu ruanga
5. Supernatant di ambil dan dipindahkanake dalam tube baru,akemudian ditambahkan dengan phenol-cloroform-isoamylalcohola(25;24;1) dengan volume yang seimbangaterhadap jumlah supernatant yang di dapat.a
6. Mencampuran di sentrifuge kembalia10.000 rpm selama 10 menit dalam suhuaruang. Kemudian supernatant di ambil danadipindahkan kembali ke
tube baru danaditambahkan dengan chloroform-iso-amyl-alkohola(24;1) dengan volume yang seimbang terhadapajumlah supernatant yang diperoleh 7. Mencampuran di sentrifuge kembaliadengan kecepatan dan waktuayang sama seperti langkah sebelumnya,akemudian supernatant di ambiladan ditambahkan dengan isopropanola
8. Inkubasi campuran tersebut denganasuhu – 20o C selama 1 – 2 jama
9. Sampel kemudian di sentrifuge selama 15amenit dengan kecepatan 13.000 rpm untukamemperoleh pellet DNA.
10. Supernatant di pindahkan / dibuang,akemudian DNA pellet di cuci dengan 800auL ethanol 70%.
11. DNA pellet dikeringanginkanakemudian dilarutkan kedalama200 uL TE buffer
12. Koleksi DNA siap untuk penggunaanaselanjutnya
13. Langkah-langkah berserta dokumentasinya dilampirkanapada Lampiran 1. untuk melihat bagaimanaametode ini dilaksanakan sehingga lebih jelas denganabantuan visual.
3.3.4 PCR-elektroforesis
DNA yang didapat kemudianadiperbanyak dengan Polymerase chain
reaction. Primerayang digunakan untuk proses PCR ini adalah primeraITS 1 dan ITS 4. Campuran larutanaPCR nya adalah 1-2 ul primer,a5 ul sampel DNA, dan 6 ul PCR mixa(Setengah reaksi). Kondisi PCR dijalankanadalam 5 menit 94o celcius untuk pre-denaturasi,akemudian dilanjutkan dengan 35 siklus dimanaa masing-masing siklus terdiri dari 30 detika94o celcius denaturasi, 30 detik 50oacelcius untuk
35
annealing, dan 1 menit suhua72o celcius untuk extention yang kemudianadiakhiri dengan satu kali siklus 1amenit dengan suhu 72o derajat celcius.aHasil PCR kemudian di elektroforesisaselama 25 menit. Berikut dibawah iniatahapan dalam melakukan elektroforesis. Khususasuhu annealing, di uji pula padaasuhu 48o C sebagaimana suhuaannealing yang direkomendasikanapasang primer.
1. Membuat gel agarose denganamencampurkan 1% agarose (0,3 gram) dengan 30 ml TBE 1xa(dari Tris base dan boric acid 10x)adi dalam tabung erlenmeyer. 2. Agarose dilarutkan dengan caraadipanaskan pada microwave selamaa±2 menit hingga larutan benar-benar larutadan bening kemudian tambahkan ETBRa2 µl dan dituang ke dalam cetakan gelayang telah dipasang sisir (comb). Gel dibiarkan mengerasaselama ±30 menit. Setelah ituasisir dilepas dari cetakan dan gel dipindahkan ke dalamatangki elektroforesis.
3. Larutan DNA sampel 3 μl dicampurkanadengan loading dye 1 μl danaair 2 μl di atas kertas parafilmakemudian memasukan campuran tersebut dan markerake dalam sumur gel agarose. Mengatur posisiagel agarose di dalamaelektroforesis. 4. Setelah campuran DNA loadingadye dan air dimasukkanake dalam sumur,
perangkat elektroforesisakemudian dihubungkan pada sumber listrik.a
5. Men-set pengaturan elektroforesisadengan tegangan 100 volt danawaktu 25 menit kemudian di runninga
6. Elektroforesis selesai. Gel agaroseadi angkat Gel agarose di bawaake dalam gel doc disinari denganaalat UV-Transilluminatoradan gel difoto dengan gel documentatorauntuk melihat visualisasi hasila
8. Langkah-langkah bersertaadokumentasinya dilampirkan padaaLampiran 1. untuk melihatabagaimana metode ini dilaksanakanasehingga lebih jelas dengan bantuan visual.a
3.5 Analisis Data
3.5.1 Pengukuran Konsentrasi danaKemurnian DNA Hasil Ekstraksi
Pengukuran konsentrasi danakemurnian DNA hasil ekstrasi menggunakan NanoDropadengan dua panjang gelombang yang berbeda,apanjang gelombang 260 dan 280. Kemurnian DNAadapat diketahui dengan membagi hasil dariapengukuran NanoDrop kedua panjangagelombang tersebut. Sedangkan konsentrasiaDNA nya di dapat langsung dariaNanoDrop tersebut.
3.5.2 Analisis Hasil Pembacaan Gel Doc.a
Analisa hasil pembacaanaGel Doc dilakukan secara kualitatif dengan mengamatiadan menentukan ukuran Band yang keluar hasil PCR-elektroforesis dibandingkan dengan Markernya. Informasiatersebut kemudian dibandingkan denganaliteratur untuk memastikan apakah target lokasi DNAayang diperoleh tepat merupakan lokasi ITS.a
3.5.3 Sequensing hasil amplifikasi sampel DNAa
Hasil amplifikasi sampel DNA yangadiperoleh kemudian dikirim ke PT. Genetika ScienceaIndonesia untuk di sequencing. Prosesasequencing itu sendiri dilakukan oleh perusahaana1st Base, Axil Scientific Pte Ltd.ayang berbasis di Singapura. Bahan yang digunakan untuk prosessequencing DNA adalah BigDye®
37
3.5.4 Analisis Data Hasil sequencing
Hasil sekuensing berdasarkanaprimer ITS 1 atau ITS 4 setiapaisolat disejajarkan kemudian di edit menggunakanapiranti lunak Mega v.10. dengan mengacu pada kromatogramnyaadan diubah menjadi bentuk fasta.aData dalam bentuk fasta dilakukan dianalisisalebih lanjut dengan mencariakesamaannya menggunakan programabasic local alignment search tool (BLAST)adari database Gen yang dimiliki GeneBankaNational Center of Biotechnology Information/
NCBI.a
BLAST digunakan untuk menentukan spesiesayang memiliki homologi terdekat. Daerah yangaambigu pada sikuen yang telah sejajaraditiadakan dari analisis. Gap dianggap sebagai dataayang hilang : Sejarah evolusi pohon filogeni disimpulkanaberdasarkan metode Neighbor-Joining (Saitou N, 1987). Jarakaevolusioner dihitung menggunakan metode Maximum Composite
Likelihooda(Tamura K., 2004). Dan berada dalam satuanajumlah subtitusi basa per situsnya.aAnalisis evolusi dilakukan dengan aplikasiaMEGA X (Kumar S., 2018). Penyusunan TabelaMatrik jarak genetik Fusarium oxysporum sampelaKarangploso dengan beberapa Gen spesiesAyang terdata dalam dari GenBankajuga dilakukan dengan menggunakan aplikasi MEGA X.a
