14 III. METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Agronomi Universitas Muhammadiyah Malang, dan screenhouse yang terletak di Dusun Kasin, Desa Ampeldento, Kecematan Karangploso, Kabupaten Malang. Penelitian dilakukan selama tiga bulan dimulai pada bulan Oktober hingga Desember 2018.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan adalah Erlenmeyer, Gelas Beker, Scalpel, Jarum Ose, Laminar Air Flow (LAF), Bunsen Burner, Cawan Petri Steril, Tabung Reaksi, Spereader, Polybag, Gunting, Kompor Gas, Autoclaf, Tisu Steril, Label, Pipet Tetes, , Plastik Wrap, Haemocytometer, Pipet Mikro, Timbangan Analitik, Mikroskop Binokuler, Alumunim Foil, Panci, Penggaris, Dan Alat Kamera.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman Kubis sakit, Sampel tanah terinfeksi Akar Gada, tanaman Kubis sehat, sampel tanah sehat, cendawan hasil eksplorasi, pupuk kandang, Potato Dextrose Agar, akuades, alkohol 96%, dan air.
3.3 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan acak kelompok (RAK) sederhana dengan 6 perlakuan. Perlakuan diulang sebanyak empat kali sehingga terdapat 24 unit percobaan. Adapun perlakuan yang diberikan adalah :
15 CO : Kontrol
CT1 : Cendawan Tanah 1 (Fusarium sp) CT2 : Cendawan Tanah 2 (Aspergillus sp) CT3 : Cendawan Tanah 3 (Trichoderma sp) CA2 : Cendawan Akar 2 (Fusarium sp) CA3 : Cendawan Akar 3 (Trichoderma sp)
Desain denah penelitian digambarkan sebagai berikut:
U1
U2
U3
U4
Gambar 1. Denah Penelitian
Keterangan :
1. Jarak antar baris adalah 30 cm 2. Jarak antar ulangan adalah 50 cm
3. UI, U2, U3, U4 merupakan kelompok atau ulangan perlakuan
CT2 CO CT3 CA2 CT1 CA3
CA3 CT1 CO CT2 CA2 CT3
CO
CT3 CT2 CA2
CO
CA2
CT1 CA3
CT3 CT2 CA3 CT1
U
16 3.4 Pelaksanaan Penelitian
Penelitian dilakukan dengan metode eksplorasi pada bagian akar dan tanah perakaran (rhizosfer) tanaman kubis yang sehat di Dau Kab. Malang, Pujon, dan Cangar Kab. Malang dan melakukan uji antagonis mikroba pada patogen Plasmodiophora brassicae Wor pada bibit tanaman kubis
3.5 Tahapan Penelitian
3.5.1 Pembuatan Inokulum Patogen Plasmodiophora brassicae Wor
Patogen Plasmodiophora brassicae Wor merupakan jenis jamur yang bersifat parasit obligat yaitu patogen yang dapat tumbuh dan berkembang biak secara alami hanya dalam inang yang hidup (Semangun, 2007). Sehingga isolasi patogen ini dilakukan saat pembibitan tanaman kubis. Pembibitan tanaman kubis berlangsung selama kurang lebih enam minggu dengan ditandai munculnya 5-6 helai daun yang sempurna. Sampel yang digunakan untuk isolasi patogen ini adalah akar tanaman kubis yang terinfeksi sejumlah 5 tanaman.
Inokulum P. brassicae diperoleh dengan mengumpulkan akar sakit tanaman kubis yang bergejala dari daerah pertanaman Brassicaceae. Akar-akar tersebut terlebih dahulu di cuci pada air mengalir untuk menghilangkan sisa-sisa tanah sampai bersih, selanjutnya akar dihancurkan dengan cara diblender kemudian disaring menggunakan kain saring. Hasil saringan selanjutnya disentrifugasi dengan alat centrifuge pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menit. Cairan hasil sentrifugasi diambil dan endapannya dibuang, kemudian kepadatan sporanya dihitung dengan haemacytometer. Suspensi spora tersebut kemudian dicampurkan ke dalam tanah yang telah disiapkan dengan kepadatan 107spora/ml/g berat kering
17 tanah dan diaduk secara merata. Selanjutnya diinokulasi secara buatan dengan suspensi spora P. brassicae sebagai media tanam pada saat pembibitan (Asniah et al, 2003).
3.5.2 Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)
Metode dalam membuat Media Potato Dextrose Agar (PDA) adalah sebagai berikut ini :
1) Mengupas kentang dan memotong bentuk dadu kecil-kecil (1x1 cm).
2) Menimbang 20 g dextrose, 20 g agar, dan 200 g potongan kentang untuk 1 liter PDA.
3) Merebus 800 ml akuades hingga mendidih dan memasukkan kentang ke dalam akuades tesebut serta mendiamkannya selama 10 menit dengan api kecil.
4) Menyaring akuades rebusan kentang tersebut kemudian menambahkan dengan 20 g agar dan ditambahkan akuades sampai 1000 ml.
5) Merebus kembali larutan tersebut sambil diaduk hingga mendidih dan menambahkan 20 g dextrose.
6) Menuangkan larutan media ke dalam Elenmeyer untuk disteril dalam Autoclave dengan suhu 121o C selama 15 menit
3.5.3 Eksplorasi Mikroba
Mikroba dapat diperoleh dengan melakukan eksplorasi. Eksplorasi dilakukan langsung dengan mendatangi petani kubis. Sampel yang dibutuhkan untuk mendapatkan Mikroba adalah sampel akar tanaman kubis sehat dan sampel tanah rizosfer yang belum terinfeksi (sehat). Setelah memperoleh sampel yang dibutuhkan, dilanjutkan dengan kegiatan isolasi. Kategori tanaman sehat yang
18 digunakan adalah tanaman kubis yang belum terserang hama dan penyakit serta belum disemprot dengan pestisida kimia.
3.5.4 Isolasi, Purifikasi dan Identifikasi Mikroba a. Bagian Akar Sehat Tanaman Kubis
Akar yang digunakan berasal dari lahan petani kubis yang terletak di daerah Pujon. Bagian akar yang akan diisolasi sebelumnya dibersihkan terlebih dahulu dengan air mengalir lalu mengeringkannya. Selanjutnya, memotong akar seluas 5- 10 mm2 yang berisi bagian sehat dan merendam potongan tersebut dalam larutan Natrium Hypoclotire (NaOCl) 3,5%, selama 2-3 menit bergantung pada tebal dan tipisnya jaringan yang disterilisasi. Selanjutnya mencuci dengan akuades steril sebanyak 3 kali dan meletakkan pada tisu steril untuk dikeringkan kemudian memotong-motong sampel dengan ukuran 1 mm2 yang berisi bagian yang sehat dan menumbuhkannya pada media PDA dan menginkubasi selama 7 hari. Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan biakan murni dengan memindahkan misellium yang tumbuh ke cawan petri yang telah berisi media PDA. Adapun identifikasi mikroba berdasarkan penamapakan makroskopis dan mikroskopis. Identifikasi mikroskopis mikroba disesuaikan dengan buku identifikasi Burnett dan Hunter (1999).
b. Tanah Rhizosfer Tanaman Kubis Sehat
Tanah yang digunakan berasal dari lahan petani kubis yang terletak di daerah Pujon. Isolasi mikroba pada tanah rhizosfer dilakukan dengan cara melarutkan 1 gram sampel tanah ke dalam air akuades dan menghomogenkannya dengan vortex homogenizer. Suspensi tanah diencerkan sampai mencapai volume 10 ml yang kemudian dilakukan pengenceran bertingkat 10-1 ,10-3,10-5. Suspensi diambil 1 ml
19 dan dituangkan ke dalam cawan petri yang sebelumnya sudah dituangkan media PDA. Teknik ini dinamakan dengan “Metode Tuang atau pour plate”. Inokulum disimpan pada suhu kamar. Isolat setelah berumur 7 hari dilakukan purifikasi.
Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan biakan murni dengan memindahkan misellium yang tumbuh ke cawan petri yang telah berisi media PDA. Adapun identifikasi mikroba berdasarkan penamapakan makroskopis dan mikroskopis.
Identifikasi mikroskopis mikroba disesuaikan dengan buku identifikasi Burnett dan Hunter (1999).
3.5.5 Perhitungan jumlah spora Mikroba
Isolat mikroba dipanen dari dalam petri dengan cara menambahkan 10 ml akuades kemudian memasukkannya ke dalam Beaker Glass. Setelah itu mengaduk hasil panen sampai homogen lalu mengambilnya menggunakan pipet tetes.
Selanjutnya meletakkan Haemocytometer pada meja mikroskop dan meneteskan suspensi tepat pada ruang hitungnya sebanyak 1 tetes kemudian menutup tetesan suspensi dengan penutup preparat dan dijaga agar tidak terjadi gelembung udara di dalam kotak-kotak Haemocytometer. Preparat diamati menggunakan mikroskop dan dihitung jumlah spora dalam setiap kotak.
3.5.6 Pembibitan Tanaman Kubis
Pembibitan merupakan hal yang sangat penting untuk memperoleh bibit yang berkualitas baik. Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan media tanam yaitu tanah dan pupuk kompos dengan perbandingan 1:1 (b/b), polybag dengan ukuran diameter 25 cm. Selanjutnya mengisi media tanam ke dalam polybag yang telah disediakan Setelah itu menyiram dengan sedikit air dan melubangi media
20 tanam dengan kayu kecil. Langkah selanjutnya yakni memasukkan benih ke dalam lubang dan menutup tipis lubang tanam dengan media tanam serta menyiram dengan sedikit air. Berikutnya polybag diletakkan di dalam screenhouse. Media tanam yang digunakan adalah tanah steril, sterilisasinya menggunakan cara sterilisasi uap pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 15 menit.
3.5.7 Infeksi Patogen Plasmodiophora brassicae Wor
Inokulum P. brassicae yang telah diperoleh kemudian dituagkan pada media tanam yang akan digunakan sebagai tempat tumbuh bibit tanaman kubis.
Suspensi spora yang disiapkan dengan kepadatan spora 107 spora/ml/g berat.
Selanjutnya suspensi spora P. brassicae sebagai media tanam pada pembibitan tanaman kubis (Asniah, et al, 2003).
3.5.8 Pengujian Mikroba dalam menekan Penyakit Akar Gada
Aplikasi Mikroba dilakukan saat pembibitan dengan kepadatan 107 spora/ml/g berat kering tanah. Bibit kubis yang sudah di tanam menggukana polibag dan selanjutnya dan telah diinokulasi oleh inokulum P. brassicae sebanyak 107 spora/ml/g berat kering tanah.
3.5.9 Pemeliharaan Tanaman
Kegiatan pemeliharaan tanaman meliputi penyiraman, pemupukan, dan pengendalian hama. Penyiraman dilakukan setiap hari selama berlangsungnya penelitian. Pemupukan dilakukan pada saat tanaman berumur 14 dan 21 hari (pembibitan) dengan memberikan pupuk NPK sebanyak 1 g/tanaman.
Pengendalian hama dilakukan secara manual, yakni mengambil hama yang terdapat pada tanaman dengan menggunakan tangan.
21 3.6 Variabel Pengamatan
Variabel-variabel pengamatan yang diamati dalam penelitian ini adalah adalah sebagai berikut :
1. Karakterisasi Mikroskopis dan Makroskopis Mikroba
Pengamatan makroskopis meliputi pola sebaran miselium, warna koloni (atas-bawah), kecepatan pertumbuhan miselium, dan tekstur koloni. Mikroskopis meliputi bentuk spora. Pengamatan mikroskopis dapat diamati secara visualisasi langsung dari masing-masing isolat di cawan petri dengan panduan buku Barnet dan Hunter (1972). Bentuk spora diamati secara mikroskopis menggunakan mikroskop kamera binokuler dengan cara mengambil sedikit bagian isolat kemudian diletakkan pada kaca preparat ditetesi air sedikit kemudian dihomogenkan dan ditutup dengan cover glass. Selanjutnya didokumentasikan sesuai perbesaran. (Barnet dan Hunter, 1972).
2. Biodiversitas Mikroba
Biodeversitas mikroba dapat diamati pada dua tahap antara lain pada tahap awal (Biodeveristas awal) dan tahap akhir (Biodeversitas akhir). Biodeversitas Awal diamati setelah isolasi awal (mikroba-mikroba yang tumbuh) sebelum di purifikasi sedangkan biodeversitas akhir diamati setalah dilakukan purifikasi dan sudah teridentifikasi.
3. Karakteristik Patogen P. brassicae
22 Pengamatan patogen P. brassicae ini lakukan dengan mencari tanaman kubis yang terserang penyakit akar gada. Akar dari tanmanan yang terserang kemudian dipisahkan dan diamati secara morfologinya.
4. Gejala Serangan patogen P. brassicae pada tanaman kubis
Gejala serangan patogen P. Brassiciae pada tanaman kubis dapat dilihat dari bibit tanaman kubis yang terserang patogen tersebut. Ciri-ciri gejala serangan patogen P. Brassiciae meliputi, tanaman kerdil, daun layu, daun menguning, hingga mati.
5. Masa Inkubasi (Hari)
Pengamatan periode inkubasi dilakukan setiap hari setelah aplikasi patogen P. brassicae dengan cara mengamati gejala serangan P. brassicae yang muncul pada setiap perlakuan. Pengamatan dilakukan untuk mengetahui periode awal munculnya gejala serangan penyakit pada tanaman.
6. Jumlah Daun (Helai)
Penghitungan jumlah daun dimulai dengan munculnya daun pada bibit tanaman kubis. Cara menghitung jumlah daun yaitu dengan cara visual. Pengamatan ini dilakukan 1 kali dalam seminggu hingga bibit tanaman berumur 35 HSI.
7. Tinggi Tanaman (cm)
Tinggi tanaman pada tanaman kubis ini diukur menggunakan penggaris.
Cara mengukur tinggi tanaman yaitu di mulai pangkal batang di atas permukaan tanah sampai pada pucuk termuda. Pengukuran ini dilakukan 1 kali dalam seminggu hingga bibit tanaman berumur 35 HSI
8. Panjang Akar (cm)
23 Panjang akar pada tanaman kubis ini diukur menggunakan penggaris. Cara mengukur panjang akar yaitu dari titik tumbuhnya akar sampai paling ujung bawah akar. Pengkuran ini dilakukan diakhir pengamatan setalah umur bibit kubis 35 HSI 9. Berat Segar Akar (g)
Dilakukan pada akhir pengamatan (35 HSI) dengan mencabut tanaman, membersihkan akar dan memisahkan akar dari tanaman. Kemudian menimbang akar menggunakan timbangan pocket.
10. Berat Kering Akar (g)
Setelah dilakukan penimbangan berat segar akar, akar dimasukkan pada amplop yang sebelumnya sudah dilubangi dengan alat pelubang kertas dan kemudian di oven selama 2 hari (48 jam) dengan suhu 850C. Kemudian menimbang akar yang sudah di oven menggunakan timbangan pocket.
11. Intensitas Serangan Penyakit (%)
Pengamatan terjadinya serangan dimulai pada waktu terbentuknya bercak yang pertama. Intensitas infeksi jamur pada tanaman kubis ditentukan dengan menggunakan rumus (Suganda et.al dalam Novianti, 2014):
I = ∑(n x v)
Z x N x 100%
Keterangan:
I = Intensitas serangan (%)
n = Tanaman yang menunjukkan gejala pada perlakuan tertentu v = Nilai skala pada tiap tanaman
N = Jumlah tanaman yang diamati Z = Nilai skala tertinggi.
24 Menurut (Datnoff et al., 1987) Skala Skor penyakit akar gada 0 = tidak ada serangan, 1 = 0-35% pembengkakan terjadi pada akar sekunder, 2 = >35-70 % pembengkakan terjadi pada akar utama, 3 = >70-100% pembengkakan terjadi pada akar utama maupun akar sekunder.
3.7 Analisis Data
Data karakterisasi morfologi isolat mikroba disajikan dalam bentuk deskriptif serta dibandingkan dengan literatur. Data disajikan dalam bentuk tabel dan gambar. Data pengujian antagonis yang diperoleh dianalisis dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA). Apabila terdapat beda nyata antar perlakuan, maka dilakukan uji lanjut beda nyata (BNJ) 5%.
