Dna

Laporan Biokimia

ISOLASI DNA DARI BUAH DAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Nama : Ansori Muchtar

NIM : 10510071 Kelompok : 02

Tanggal Praktikum : 14 November 2012

Tanggal Laporan : 21 November 2012

Asisten: Bunga (10510 )

Laboratorium Biokimia

Program Studi Kimia

Fakultas Matematika Dan IPA

Institut Teknologi Bandung

2012

ISOLASI DNA DARI BUAH DAN ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

I. Tujuan

 Menentukan fragmen-fragmen DNA hasil isolasi dari buah menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa

II. Teori Dasar

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315--316; Raven & Johnson 2002: 94).

Metoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing).

III. Data Pengamatan

IV. Pembahasan

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap buah naga dan kiwi. Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan dengan mengambil beberapa bagian dagiang buah naga yang dihancurkan didalam tabung. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis, yaitu menggunakan detergen.

Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan ekstrak dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang berwarna merah. Fasa atas yang kemudian diambil untuk digunkan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan DNA dari zat-zat lainnya.

DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

Keterangan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA

Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna

loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas

sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur, selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.

Agarosa merupakan suatu koloidal laut yang dimurnikan dari alga. Gel agarosa ini dibuat dengan melarutkan sebanyak 0,4 gram agarosa dalam 40 mL buffer TAE ( tris asetat 0,04M, EDTA 0,001 M pH 8) sambil dipanaskan hingga mendidih agar agarosa larut semuanya. Ketika dididihkan dalam suatu larutan buffer, agarosa akan larut dan ketika didinginkan akan memadat membentuk gel. Dengan menambahkan larutan buffer Tris Asetat EDTA (TAE) yang dapat memberikan resolusi terbaik untuk DNA. Gel agarosa mempunyai laju pemisahan lebih cepat, dapat memisahkan fragmen DNA antara 100 bp–50 kb tergantung dari konsentrasi gel agarosa yang digunakan, medan gerak biasanya horizontal. Pendinginan dilakukan sekitar suhu 50-60°C, apabila terlalu panas akan merusak karet-karet penyimpan agar. Selain itu, viskositasnya rendah sehingga akan menimbulkan gelembung-gelembung, sehingga apabila dituangkan dikhawatirkan ada udara yang terjebak. Dalam hal ini buffer TAE sebagai media penghantar arus, dimana fragmen DNA akan bergerak dengan perbedaan kecepatan akibat adanya perbedaan kekuatan ionik. Fragmen DNA akan memisah berdasarkan ukuran pasangan basa. Ethidium bromida ditambahkan setelah agarosa bersuhu sekitar 50-60°C. Senyawa ini berfluorosence merah-orange dibawah sinar UV dan tingkat fluorosence bertambah ketika terikat pada DNA untai tunggal. Stuktur ethidium bromida cukup kompleks dikenal juga dengan nama phenenanthridium-3,8-diamino-5-etil-6-fenil-bromida. Ethidium bromida dapat tersisipkan diantara basa asam nukleat dan memberikan deteksi dalam gel. Larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar. Ethidium bromida ini terdapat dalam bentuk bubuk atau larutan yang larut dalam air. Kristal atau bubuknya tidak berbau dan menunjukkan warna merah tua.

Dapat tersisipnya ethidium bromida diantara basa asam nukleat, karena ethidium bromida sedikit mirip pasangan basa dan dapat masuk ke dalam rantaiganda DNA di antara pasangan basanya. Hal tersebut sangat mutagen. Ethidium bromida merupakan fluoresence yang lemah. Fluorosensi terjadi karena electron tereksitasi ke tingkat energi yang lebih

tinggi (dengan UV 365 nm). Ketika electron kembali pada tingkat energi yang lebih rendah, menimbulkan perbedaan energi (sinar tampak). Fluorosensi ethidium bromida bebas dalam larutan rendah, karena electron dapat mengalir diantara dua level energi, dalam tingkatan energi vibrasi.

Ketika ethidium bromida terikat pada DNA yang lebih kaku maka jalur pengeluaran energy rendah. Jalur fluorosensi ini yang umum terjadi dimana Ethidium bromida tidak tersisipkan lebih panjang di antara pasangan basa yang bersesuaian dengan stemakseptor tRNA valin. Karena itu tersisipnya akan berada di antara pasangan basa pada struktur stem-loop panjang bagian bawah. Dengan demikian ethidium bromida lebih suka sisi penyisipannya dekat dari basa RNA helical stem.

Gambar : Penyisipan Ethidium Bromida pada Pasangan Basa

Setelah penambahan ethidium bromida, agarosa cair dituangkan ke dalam cetakan yang memiliki sisir untuk membentuk sumur gel. Setelah cetakan jadi, pada tiap sumur dimasukkan masing-masing sampel yang sebelumnya telah dicampur dengan Loading buffer. Loading buffer terdiri atas sukrosa 50%,EDTA Ph 8,0 dan brom fenol biru yang digunakan sebagai pewarna guna mempermudah pengamatan berpindahnya noda dalam gel dan memonitoring sejauh mana proses elektroforesis telah berlangsung, dengan adanya warna biru yang bergerak dalam agar. Selain itu, penambahan sukrosa ini sebagai pemberat bagi sampel sehingga sampel tenggelam ke dalam sumur gel.

Setelah sumur diisi, kemudian dimasukkan ke dalam alat elektroforesis dan proses dijalankan dengan tegangan. Tegangan yang digunakan tidak boleh dinaikkan karena fragmen besar akan berpindah sebanding dengan kecepatan fragmen kecil. Diketahui elektroforesis merupakan suatu pemisahan zat berdasarkan pengaruh medan listrik. Karena adanya aliran listrik yang mengalir pada gel, maka fragmen DNA bergerak ke kutub positif (ditandai dengannoda biru bergerak ke kutub positif). Hal ini karena molekul DNA relatif lebih kecil sehingga bergerak lebih dulu daripada molekul lain yang besar, selain itu DNA ini bermuatan negatif akibat adanya gugus fosfat pada ujung 5-nya.

Faktor yang mempengaruhi Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarosa, sebagai berikut:

1. Ukuran molekul DNA

Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.

2. Konsentrasi gel agarosa

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. Rumusnya adalah: log=log-KrT dimana  adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan T adalah gel konsentrasi serta  adalah electrophoretic mobility DNA.

3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:

 Konsentrasi gel agarosa

 Densitas kembaran superheliks pada bentuk I

 Pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III  Tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr

meningkat, pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I

 Konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg.

Semakin padat gel agarosanya maka akan semakin lambat laju migrasinya dan semakin basar berat molekul DNA maka laju migrasinya pun semakin lambat. Berdasarkan ukuran, semakin berat molekul DNA maka semakin lambat laju migrasinya, begitu juga sebaliknya. Menurut Pramono (2011), berdasarkan struktur molekulnya, DNA yang paling cepat lajunya adalah DNA bentuk

covalently closed circular (CCC) disusul oleh bentuk linier, dan yang

paling lambat adalah bentuk open circular (OC). Fungsi fungsi reagen:

1. Loading dye, digunakan sebagai pemberat (Bromophenol blue sebagai penanda jalannya elektroforesis, xylene cyalol sebagai penanda awal jalannya elektroforesis.

2. Larutan buffer TAE 1X (tris-base sebagai penyeimbang pH, asam asetat glasial sebagai elektrolit dan EDTA, digunakan untuk menginaktifkan enzim perusak DNA yaitu DNAase).

3. Agarosa, digunakan untuk memadatkan dan mengvisualisasi DNA.

DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan besar molekul. Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar, Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak bergerak. Selain itu kesalahan juga

dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak berisi DNA.

V. Kesimpulan

Ukuran DNA tidak dapat ditentukan.

VI. Daftar Pustaka

 Clark,John M. 1964. Experimental Biochemistry. WH Freeman and Company. San Franciso

 Eaton,David C.1980.The World of Organic Chemistry.Mc-Graw-Hill Book

Company. New york.

 http://biology-community.blogspot.com/2012/08/isolasi-dna.html, tanggal akses 20 November 2012.

 http://ditjenbun.deptan.go.id/bbp2tpsur/images/stories/perbenihan/uji%20 kualitatif%20dna.pdf, tanggal akses 20 November 2012.

 http://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis#Agarose , tanggal akses 20 November 2012.