PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PENINGKATAN KADAR ANTIBODI DARAH PADA TIKUS PUTIH JANTAN GALUR WISTAR
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Maria Amarylis Illona Muda NIM : 058114083
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
ii
PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOLIK DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) TERHADAP PENINGKATAN KADAR ANTIBODI DARAH PADA TIKUS PUTIH JANTAN GALUR WISTAR
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Maria Amarylis Illona Muda NIM : 058114083
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
v
Berusahalah dahulu hingga kau pantas
menjadi pemberi, dan sebuah alat
untuk membagi.
Sebab sesungguhnya, kehidupanlah
yang memberi pada kehidupan.
(Kahlil Gibran)
vii PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala kasih dan berkat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanolik Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap Peningkatan Kadar Antibodi Darah pada Tikus Jantan Galur Wistar”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penulisan skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa adanya dukungan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih kepada:
1. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt selaku dosen pembimbing, yang telah memberikan inspirasi kepada penulis serta selalu memberikan semangat, dukungan, bimbingan, dan saran selama penyusunan skripsi. 2. Rm. Sunu Hardiyanta, M.Sc., S.J., selaku dosen penguji yang telah
berkenan menguji dan banyak memberikan masukan dan pengetahuan yang berkaitan dengan skripsi ini, terutama dalam analisis statistik. 3. dr. Fenty, M.Kes., Sp.P.K., selaku dosen penguji yang telah berkenan
menguji dan memberikan masukan dan saran.
4. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku dekan fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma.
viii
6. Mbak Yuli, Pak Yudhi, Bu Arsi, segenap karyawan LPPT dan PAU UGM yang telah banyak membantu dan menemani selama penelitian skripsi ini.
7. Papa, Mama, dan Lora, yang menjadi pelita dan motivasi bagi penulis. Untuk setiap doa dan kasih sayang yang tak tertandingi.
8. Anna, Rias, Ika, Yesika, atas kerjasama, diskusi, senyum, tawa, dan keluh kesah selama penelitian dan penyusunan skripsi.
9. Tami, Nolen, Sekar, Lina Boy, Paulina, Siska, Jovan, teman-teman 2005 FST dan FKK atas persahabatan, dukungan, masukan, dan kebersamaan selama ini.
10. Tim penelitian Steviosida (Retha, Tyas, Diana, Nia, Ferry) atas keceriaan yang telah dibagikan.
11. Komunitas pendamping PIA Maguwo atas persahabatan dan keriangan yang selalu menyegarkan.
12. Semua pihak yang telah memberikan dukungan dalam penyusunan skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa dalam skripsi ini masih banyak terdapat kekurangan dan kesalahan. Oleh karenanya penulis mengharapkan kritik dan saran atas skripsi ini. Penulis berharap tulisan ini dapat berguna bagi kepentingan ilmu kefarmasian.
ix
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 20 Januari 2009 Penulis
x INTISARI
Sistem imun merupakan sistem pertahanan yang melindungi tubuh dari suatu penyakit. Tanaman mimba merupakan tumbuhan obat tradisional yang dapat digunakan sebagai obat alternatif untuk menyembuhkan berbagai penyakit. Berbagai penelitian yang telah dilakukan menyatakan bahwa ekstrak air daun dan batang mimba memiliki aktivitas imunostimulan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol daun mimba terhadap peningkatan kadar antibodi dan berapa besar persentase peningkatan kadar antibodi.
Penelitian ini bersifat eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Tikus jantan galur Wistar diberi perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dan diinduksi dengan antigen vaksin Hepatitis B. Uji peningkatan kadar antibodi dilakukan dengan metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Data hasil uji dianalisis secara statistik menggunakan uji Kruskal Wallis.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun mimba dengan dosis 35;70;140 mg/kg BB tidak memberikan efek imunostimulan dengan meningkatkan kadar antibodi darah.
xi ABSTRACT
Immune System protects the body from many diseases. Neem plant is one of traditional herbal drug that can be used as alternative medicine for healing many diseases. Various researches had been done previously showed that water extract of neem’s leaf and bark had the immunostimulant activity. The purposes of this research are to know the effect of ethanolic extract of neem’s leaf on the increase of antibody concentration and to determine the percentage of the increase of antibody concentration.
This research is a pure experimental research with the one way pattern complete random design. Male Wistar rats were given ethanolic extract of neem’s leaf and induced by Hepatitis B vaccine. Increase of antibody concentration was measured by using ELISA method (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). The result was statistically analyzed by using Kruskal-Wallis test.
The result indicates that ethanolic extract of neem’s leaf at the dose of 35;70;140 mg/kgBB does not show immunostimulant activity to the increase of antibody concentration.
xii DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL………. ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……… iii
HALAMAN PENGESAHAN……….... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN……… v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI vi PRAKATA………...…….. vii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……… ix
INTISARI………..…… x
A. Latar Belakang……...………... 1
1. Rumusan masalah……..………. 2
2. Keaslian penelitian………...………... 2
3. Manfaat penelitian…………...……… 3
B. Tujuan Penelitian………...………... 3
1. Tujuan umum………..……… 3
xiii
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA……… 5
A. Azadirachta indica A. Juss………... 5
B. Sistem Imun……….. 7
C. Imunomodulator………... 8
D. Antibodi……….... 9
E. Antigen………. 11
1. Vaksin Hepatitis B……….. 12
2. Hepavax-Gene®……….. 12
F. Ekstraksi………..………. 13
G. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)………... 14
1. ELISA langsung……….. 15
2. ELISA tak langsung……… 15
3. ELISA penangkap antigen atau ELISA sandwich……….. 16
4. ELISA penangkap antibodi………. 16
5. ELISA kompetitif atau ELISA pemblok………. 16
H. Kerangka Pemikiran………. 17
I. Hipotesis………..………. 18
BAB III METODOLOGI PENELITIAN……….. 19
A. Jenis dan Rancangan Penelitian……… 19
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional………..…… 19
1. Variabel penelitian………..… 19
xiv
C. Alat dan Bahan Penelitian……… 20
1. Alat penelitian………. 20
2. Bahan penelitian……….. 20
D. Tatacara Penelitian………... 21
1. Determinasi tumbuhan……… 21
2. Pengumpulan daun mimba……….. 22
3. Pengeringan daun mimba……… 22
4. Pembuatan serbuk daun mimba……….. 22
5. Pembuatan ekstrak etanolik daun mimba……… 22
6. Perlakuan hewan percobaan……… 23
7. Metode ELISA……… 23
E. Analisis Hasil……… 24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN………... 25
A. Pengumpulan Daun Mimba dan Pembuatan Simplisia………… 25
B. Hasil Ekstraksi……….. 26
C. Hasil Perlakuan terhadap Hewan Uji……… 26
D. Hasil Pengamatan Titer Antibodi………. 29
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………. 34
A. Kesimpulan………... 34
B. Saran………. 34
DAFTAR PUSTAKA……… 36
LAMPIRAN……….. 39
xv
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Data Rata-rata Absorbansi Titer Antibodi Setelah Perlakuan………
32
Tabel II. Profil Berat Badan Tikus Hasil Rata-rata Mingguan Selama Masa Perlakuan………..
42
xvi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh………... 8 Gambar 2. Profil Rata-rata Berat Badan Tikus Setiap Minggu
Selama Masa Perlakuan……….. 28 Gambar 3. Foto histologi hepar……….... 29 Gambar 4. Skema ikatan yang terjadi dalam plat ELISA………… 31 Gambar 5. Reaksi substrat NPP dengan enzim alkalin fosfatase…. 31 Gambar 6. Grafik Rata-rata Absorbansi Kelompok Kontrol dan
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Perhitungan Dosis………... 40
Lampiran 2. Rata-rata Berat Badan Tikus per Minggu………. 42
Lampiran 3. Data Absorbansi Peningkatan Titer Antibodi………... 43
Lampiran 4. Hasil Analisis Statistik Deskriptif……… 43
Lampiran 5. Uji Normalitas Data dengan Uji Shapiro-Wilk dan Uji Homogenitas Data……….. 45
Lampiran 6. Hasil Uji Kruskal-Wallis……...………... 46
Lampiran 7. Uji Kruskal-Wallis untuk Kelompok yang Mendapat Perlakuan Daun Mimba……… 47
Lampiran 8. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A.Juss)………. 48
Lampiran 9. Daun Mimba (Azadirachta indica A.Juss)…………... 49
Lampiran 10. Serbuk Daun Mimba………. 50
Lampiran 11. Ekstrak Etanolik Daun Mimba………. 50
Lampiran 12. 96 well plate (Nunc)………. 51
Lampiran 13. ELISA reader SLT 340 ATC………... 51
1 BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Berbagai penyakit yang timbul dewasa ini berakar pada permasalahan sistem imun. Sistem imun merupakan mekanisme pertahanan tubuh terhadap zat asing (misalnya penyebab infeksi). Imunitas yang lemah memudahkan terjadinya infeksi mikroorganisme patogen. Imunitas dapat bersifat alami maupun diperoleh (adaptif). Imunitas alami adalah imunitas yang dimiliki sejak lahir dan bersifat nonspesifik, sedangkan imunitas adaptif adalah imunitas yang diperoleh karena adanya paparan suatu penyebab infeksi, bersifat spesifik dan diperantarai oleh antibodi atau sel limfoid.
Pemeliharaan kesehatan yang ideal adalah yang berawal dari pemeliharaan sistem imun. Dengan sistem imun yang kuat dan berfungsi baik, tubuh dapat terhindar dari berbagai penyakit. Pemeliharaan sistem imun dapat dilakukan melalui berbagai cara seperti cukup beristirahat, berolahraga, mengonsumsi makanan yang memberikan asupan gizi seimbang dan suplemen yang mengandung komponen yang dapat meningkatkan imunitas tubuh.
2
Salah satu tumbuhan yang diketahui memiliki potensi sebagai imunostimulan adalah mimba (Azadirachta indica A. Juss). Berbagai penelitian yang dilakukan terhadap tumbuhan ini menunjukkan bahwa mimba memiliki aktivitas antiinflamasi, antipiretik, analgesik, hipoglikemik, antiulcer, antifertilitas, antimalaria, antifungi, antibakteri, antivirus, antikarsinogenik, hepatoprotektif, antioksidan, dan imunostimulan (kulit batang pohon mimba) (Biswas, 2002). Penelitian lain menyebutkan bahwa ekstrak air daun mimba juga memiliki aktivitas imunostimulan (Ray, 1996).
Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh pemberian ekstrak etanolik daun mimba dalam peningkatan produksi antibodi yang merupakan molekul komponen sistem imun. Penelitian dilakukan secara in vivo pada hewan uji dan perbedaan kadar antibodi diukur dengan metode ELISA.
Penelitian ini diharapkan dapat memunculkan suatu pengembangan sediaan herbal yang mampu meningkatkan sistem imun tubuh, sehingga tubuh selalu dalam keadaan siap menghadapi penyakit.
1. Rumusan Masalah
a. Apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan kadar antibodi dalam darah pada tikus jantan galur Wistar?
b. Berapa persen peningkatan kadar antibodi darah pada tikus jantan galur Wistar dengan pemberian ekstrak etanolik daun mimba?
2. Keaslian Penelitian
3
dalam darah pada tikus jantan galur wistar. Penelitian yang pernah dilakukan terkait efek imunostimulan mimba antara lain: Efek Imunomodulator dari Minyak Mimba (Azadirachta indica A.Juss) (Upadhyay, 1992); Modulasi respon imun humoral dan seluler oleh Azadirachta indica (Mimba) pada mencit (Ray, 1996); Efek Imunomodulator NIM-76, suatu Fraksi Menguap dari Minyak Mimba (Sairam, 1997); Daun mimba Meningkatkan Aktivasi Imun yang Menghambat Perkembangan Murine Erlich Carcinoma dan B16 Melanoma (Baral, 2004); Preparat mimba meningkatkan respon imun tipe Th1 dan imunitas anti tumor melawan antigen tumor payudara (Mandal, 2007).
3. Manfaat Penelitian
Penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap peningkatan kadar antibodi ini diharapkan bermanfaat antara lain:
a. manfaat teoritis penelitian ini adalah menambah khasanah ilmu pengetahuan dan eksplorasi tanaman yang dapat meningkatkan sistem imun tubuh dengan peningkatan kadar antibodi dalam darah
b. manfaat praktis penelitian ini adalah daun mimba dapat digunakan sebagai suplemen peningkat sistem imun.
B. Tujuan 1. Tujuan umum
4
2. Tujuan Khusus
a. Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun mimba dapat meningkatkan kadar antibodi dalam darah tikus jantan galur Wistar.
5 BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Azadirachta indica A. Juss
Pohon mimba (Azadirachta indica) merupakan tumbuhan asli Asia Tenggara. Tumbuhan ini cepat tumbuh, dapat bertahan di tanah yang buruk dan kekurangan nutrisi, serta tetap berdaun sepanjang tahun. Pohon mimba dapat mencapai 30 meter, dengan cabang-cabang berdaun yang menyebar (Anonim, 1998). Sistematika tumbuhan mimba adalah sebagai berikut:
Divisi : Spermatophyta Sub divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Bangsa : Meliales Suku : Meliaceae Marga : Azadirachta
Jenis : Azadirachta indica A. Juss (Hutapea, 1993)
6
Tumbuhan mimba memiliki banyak kegunaan. Salah satu kegunaannya yang paling dikenal adalah sebagai biopestisida. Hampir seluruh bagian mimba memiliki fungsi dan kegunaan yang dapat dimanfaatkan, antara lain sebagai repelan, penyubur, makanan diabetik, pakan ternak, kayu bakar, bahan dasar batu bara, tanaman peneduh, bahan tambahan pada media pertumbuhan tanaman, dan penurun keasaman tanah (Anonim, 1998).
Ekstrak mimba digunakan untuk mengatasi berbagai masalah kesehatan. Mandi dengan air rendaman mimba dipercaya dapat menyembuhkan ruam panas dan bisul. Minyak mimba digunakan untuk mengatasi ulcer perut dan rematik. Batang mimba mengandung antiseptik kuat dan mimba digunakan untuk membuat sabun dan pasta gigi. Ranting mimba digunakan untuk membersihkan gigi (Anonim, 1998). Selain kegunaan-kegunaan tersebut, daun Azadirachta indica juga berkhasiat sebagai obat demam dan untuk menguatkan badan (Hutapea, dkk, 1993).
7
B. Sistem Imun
Imunitas adalah resistensi terhadap penyakit terutama penyakit infeksi (Bratawidjaja, 2004). Imunitas bersifat alami (bawaan) dan didapat (adaptif). Imunitas yang alami adalah imunitas yang tidak diperoleh melalui kontak dengan suatu antigen dan bersifat non spesifik, sedangkan imunitas didapat adalah imunitas yang diperoleh setelah pemaparan terhadap suatu penyebab infeksi, bersifat khusus dan dapat diperantarai oleh antibodi atau sel limfoid. Masuknya zat asing dalam tubuh akan menimbulkan berbagai macam reaksi yang bertujuan untuk mempertahankan keutuhan dirinya (Gan, 1991). Gabungan sel, molekul dan jaringan yang berperan dalam resistensi terhadap infeksi disebut sistem imun, dan reaksi yang dikoordinasi sel-sel dan molekul-molekul terhadap mikroba dan bahan lainnya disebut respons imun (Bratawidjaja, 2004).
Respons imun merupakan serangkaian proses yang saling berkaitan dan diatur oleh suatu sistem yang saling menunjang. Dalam keadaan optimal atau dalam keadaan sehat sistem ini berfungsi secara efisien sehingga seseorang dapat terhindar dari dampak yang tidak menguntungkan akibat masuknya substansi asing (antigen). Setelah terjadi respon imun, sel-sel yang spesifik terhadap antigen bersangkutan bertambah banyak, dan sel-sel efektor beraksi untuk menyingkirkan antigen (Kresno, 1996).
8
dari dua jenis sel, yaitu sel B dan sel T. Pada kontak pertama, di bawah pengaruh antigen, sel B akan berdiferensiasi dan berproliferasi menjadi sel plasma yang menghasilkan antibodi, sedangkan sel T (thymus derived) akan tersensitisasi menjadi sensitized T cells menghasilkan limfokin, reaksi imun seluler. Disamping itu, diferensiasi dan proliferasi sel B dan sel T menghasilkan sel memori. Pada kontak ulang, sel memori tersebut akan lebih cepat berproliferasi menjadi sel plasma dan sensitized T cells (gambar 1). Memori imunologik dapat berada dalam bentuk memori pasif jangka pendek dan memori aktif jangka panjang (Gan, 1991).
Gambar 1. Pengenalan Antigen dan Respon Imun Tubuh (Anonim, 2008a)
C. Imunomodulator
9
menempatkan sistem imun pada posisi vital yaitu antara kondisi sehat dan sakit (Juyal, 2003). Imunomodulator juga dideskripsikan sebagai suatu agen kimia yang memodifikasi respon atau fungsi sistem imun, baik dengan stimulasi pembentukan antibodi atau penghambatan aktivitas sel darah putih (Anonim, 2008b).
Imunomodulator dapat diklasifikasikan menjadi tiga, yaitu imunorestorasi, imunosupresan, dan imunostimulan. Imunorestorasi adalah pengembalian fungsi sistem imun yang terganggu dengan memberikan berbagai komponen sistem imun, seperti imunoglobulin (Baratawidjaja, 2004). Imunostimulan adalah senyawa dari luar yang dapat membantu meningkatkan resistensi tubuh terhadap antigen yang masuk (Juyal, 2003). Imunosupresi adalah suatu penekanan sistem imun (Baratawidjaja, 2004).
Senyawa-senyawa yang bersifat sebagai imunomodulator antara lain: rutin, saponin, polisakarida, artemisin, ginsenosid, inosin, limonen, asam linoleat, asam oleanolik, ursolic acid. Sedangkan senyawa yang bersifat imunostimulan antara lain: phosphorus (Duke, 1996).
D. Antibodi
10
Imunoglobulin merupakan salah satu sistem genetik yang paling menarik. Kemampuannya untuk mengikat antigen yang spesifik memberikan dasar imunitas humoral (Korsmeyer, 1991). Antibodi pertama kali dikenal sebagai protein Bence Jones pada tahun 1874, dan dideskripsikan sebagai senyawa baru yang tidak diketahui spesifisitasnya yang terdapat dalam urin pasien dengan ‘Mollities Ossium’ (Dasgupta, 1992).
Imunoglobulin merupakan substansi pertama yang diidentifikasi sebagai molekul dalam serum yang mampu menetralkan sejumlah mikroorganisme penyebab infeksi. Molekul ini disintesis oleh sel B dalam 2 bentuk berbeda, yaitu sebagai reseptor permukaan (untuk mengikat antigen), dan sebagai antibodi yang disekresikan ke dalam cairan ekstraseluler. Antibodi yang disekresikan dapat berfungsi sebagai adaptor yang mengikat antigen melalui binding-sites-nya yang spesifik, sekaligus merupakan jembatan yang menghubungkan antigen dengan sel-sel imun atau mengaktivasi komplemen (Kresno, 2001). Adaptor mempunyai bagian pengenalan komplementer bentuk terhadap mikroorganisme dan selanjutnya dapat terikat secara kuat (Roitt, 2003).
Terdapat 5 kelas imunoglobulin dalam serum manusia yaitu IgG, IgA, IgM, IgD, dan IgE. Perbedaan di antara kelima kelas tersebut didasarkan pada tiga karakteristik utama: antigenisitas, sifat fisik, dan aktivitas biologis dari molekul antibodi (Dasgupta, 1992).
Imunoglobulin G (IgG)
11
tergantung pada sel T dibandingkan IgM. Dalam respon terhadap stimulus antigen, molekul imuoglobulin ini muncul segera setelah antibodi IgM. IgG dapat dengan segera berdifusi ke dalam rongga ekstravaskuler serta meningkatkan fagositosis dan membantu netralisasi toksin. Makrofage memiliki reseptor untuk bagian fragmen crystalline (Fc, yaitu bagian yang mudah terkristalkan dari molekul IgG dan tidak memiliki kemampuan untuk berikatan dengan antigen) dari molekul IgG tertentu. Sel lain yang memiliki reseptor permukaan yang mampu berikatan dengan Fc adalah sel B dan sel K. IgG mampu menembus plasenta dan memproteksi bayi dalam minggu-minggu hingga bulan-bulan pertama kehidupannya (Dasgupta, 1992).
E. Antigen
Antigen yang juga disebut imunogen adalah bahan yang dapat merangsang respon imun atau bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi yang sudah ada tanpa memperhatikan kemampuannya untuk merangsang produksi antibodi. Secara fungsional antigen dibagi menjadi imunogen dan hapten (Bratawidjaja, 2004).
12
1. Vaksin Hepatitis B
Vaksin Hepatitis B terdiri atas partikel antigen permukaan hepatitis B yang diinaktifkan (HbsAg) dan diabsorpsi dengan tawas, dimurnikan dari plasma manusia/karier hepatitis. Vaksin rekombinan HbsAg (rHBsAg) diproduksi dengan rekayasa genetik galur Saccharomyces cerevisae yang mengandung plasmid/gen untuk antigen HbsAg (Bratawidjaja, 2004).
2. Hepavax-Gene®
Hepavax-Gene® adalah suatu vaksin rekombinan hepatitis B. Komponen imunogenik yang terkandung, yaitu rekombinan antigen permukaan hepatitis B (HbsAg), diproduksi dengan modifikasi yeast menggunakan Crucell’s propietary Hansenula polymorpha expression system. 1 ml vaksin mengandung 20 mcg HbsAg yang diabsorbsikan pada 0,5 mg alumunium hidroksida. Hepavax-Gene® adalah salah satu vaksin yang kualitasnya diakui WHO untuk imunisasi aktif melawan virus Hepatitis B (Anonim, 2008c). Vaksin ini diproduksi oleh Berna Biotech Korea Corporation.
F. Ekstraksi
13
Cairan penyari yang biasa digunakan adalah air, eter atau campuran etanol dan air. Penyarian simplisia dengan air dilakukan dengan cara maserasi, perkolasi atau penyeduhan dengan air mendidih. Penyarian dengan campuran etanol dan air dilakukan dengan cara maserasi atau perkolasi. Penyarian dengan eter dilakukan dengan cara perkolasi (Anonim, 1979).
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain. Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan (Anonim, 1986).
G. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
14
Quinn et al (2004) menyebutkan bahwa metode ELISA yang memenuhi persyaratan memiliki Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantification (LOQ) untuk sampel serum yang mengandung IgG masing-masing sebesar 0,09 µg/ml dan 3,0 µg/ml. Sensitivitas metode ini adalah sebesar 97,8%, sedangkan spesifisitasnya 97,6%.
Prinsip teknik ELISA sama dengan teknik RIA (radioimmunoassay), yaitu dengan mereaksikan antigen (Ag) yang tidak dilabel dan terdapat dalam spesimen, bersama antigen yang dilabel (Ag*) dengan antibodi (Ab) spesifik, sehingga antigen berlabel dan antigen dalam spesimen akan berkompetisi untuk mengikat antibodi dan membentuk kompleks Ag*-Ab-Ag. Apabila kadar Ag* sebelum reaksi diketahui, maka sisa Ag* yang tidak bereaksi atau yang terikat pada kompleks dapat diukur. Pada teknik ELISA indikator yang digunakan adalah enzim. Kelebihan teknik ELISA adalah: cukup sensitif, reagen mempunyai half life yang lebih panjang dibanding reagen RIA, dapat menggunakan
spektrofotometer biasa dan mudah dilakukan, serta tidak mengandung bahaya radioaktif (Kresno, 1996).
Bergantung pada apa yang ingin diuji, pada teknik ELISA harus ada antibodi atau antigen yang dikonjugasikan dengan enzim dan substrat yang sesuai. Enzim yang paling disukai adalah fosfatase alkali (AP) dan horseradish peroxidase (HRP), sedangkan substrat yang paling sering digunakan adalah
o-phenylenediamine (OPD), dan tetramethylbenzidine (TMB). Substrat
para-nitrophenylphosphate (pNPP) dapat dipilih apabila enzim yang digunakan adalah
15
tertentu dan reaksi dihentikan dengan penambahan asam atau basa kuat. Karena banyaknya antibodi berlabel enzim (AbE) yang terikat pada kompleks Ag-AbE sesuai dengan kadar Ag dalam spesimen, maka banyaknya enzim yang terikat pada kompleks dan intensitas warna yang timbul setelah substrat dihidrolisis oleh enzim yang terikat pada kompleks Ag-AbE merupakan ukuran untuk kadar Ag yang diuji (Kresno, 1996).
ELISA telah banyak mengalami perubahan sejak teknik ini pertama kali dipublikasikan. Keragaman terbesar dalam ELISA dapat dilihat dari pemilihan konjugat dan substratnya. Keragaman lain terdapat pada konfigurasinya. Konfigurasi paling sederhana adalah ELISA langsung, sedangkan konfigurasi lain adalah ELISA tak langsung, ELISA penangkap antigen atau ELISA sandwich, ELISA penangkap antibodi, dan ELISA kompetitif atau ELISA pemblok (Burgess, 1995).
1. ELISA langsung
Ini merupakan konfigurasi paling sederhana. Antigen secara langsung diadsorbsikan ke suatu substrat padat. Permukaan substrat dicuci dan antibodi yang ditempeli enzim digunakan untuk menunjukkan adanya antigen. Konfigurasi ini memerlukan antiserum yang dikonjugasikan pada enzim dan bersifat sesifik untuk antigen yang dimaksud. Terapannya meliputi skrinning antigen seperti imunoglobulin pada serum janin sapi (Burgess, 1995).
2. ELISA tak langsung
16
padat. Antibodi primer diperoleh dari serum atau bermacam cairan tubuh lainnya. Antibodi sekunder terikat pada enzim yang sesuai, dan biasanya disebut sebagai konjugat. Hasil akan tampak bila ditambahkan substrat. Cara ini juga digunakan untuk identifikasi antigen dan untuk skrining Hibridoma (Burgess, 1995).
3. ELISA penangkap antigen atau ELISA sandwich
Konfigurasi ini menggunakan antibodi yang terikat pada fase padat untuk menangkap antigen secara spesifik. Konfigurasi sisanya serupa dengan ELISA tidak langsung. Antibodi penangkap, antigen dan sistem indikator dibuat konstan dan yang berubah adalah titer antibodi primer untuk antigen spesifik (Burgess, 1995).
4. ELISA penangkap antibodi
Konfigurasi ini menggunakan antiglobulin yang terikat pada substrat padat. Antibodi sampel yang diuji ditangkap dan sistem indikator menempeli antigen berlabel (Burgess, 1995).
5. ELISA kompetitif atau ELISA pemblok
17
H. Kerangka Pemikiran
Sistem imun merupakan suatu sistem pertahanan tubuh yang berfungsi untuk menolak segala substansi asing yang dapat memberikan efek buruk bagi tubuh. Salah satu substansi yang berperan dalam imunitas tubuh adalah antibodi. Substansi ini bertugas melindungi tubuh dari zat asing yang masuk ke tubuh, yang dikenal sebagai antigen. Karena peranan yang sangat penting, yaitu mencegah serangan penyakit dan menjaga kesehatan tubuh, maka sistem imun harus selalu dalam kondisi baik dan kuat. Salah satu cara meningkatkan kekuatan sistem imun adalah dengan pemberian suplemen.
18
I. Hipotesis
19 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian jenis eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas
Dosis ekstrak etanolik daun mimba yaitu 35 mg/kg BB tikus, 70 mg/kg BB tikus, dan 140 mg/kg BB tikus.
b. Variabel tergantung
Titer antibodi dalam darah pada tikus pada tiap perlakuan dalam jangka waktu 7 hari setelah setiap pemberian antigen.
c. Variabel pengacau terkendali
1) Waktu pengambilan darah dilakukan setiap 7 hari setelah pemberian antigen.
2) Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar berusia 3 bulan dengan berat badan 150-250 g.
20
d. Variabel pengacau tak terkendali Kondisi patofisiologis hewan uji. 2. Definisi Operasional
a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan galur wistar yang diperoleh dari Unit Pemeliharaan Hewan Percobaan (UPHP) UGM berumur 3 bulan.
b. Ekstrak etanolik daun mimba merupakan hasil penyarian serbuk daun mimba secara maserasi dengan penyari etanol 70%.
c. Imunostimulan adalah senyawa yang menyebabkan peningkatan sistem imun tubuh antara lain dengan peningkatan kadar antibodi.
d. Antibodi yang terukur adalah subkelas imunoglobulin G (IgG).
e. Titer antibodi merupakan besaran konsentrasi antibodi yang dinyatakan dalam absorbansi atau optical density (OD).
C. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat penelitian
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas, blender, maserator, vacuum rotary evaporator, oven, desikator, alumunium foil, timbangan analitik (Sartorius), alat injeksi (Terumo), magnetic stirrer, tabung sentrifuge (Nunc), swing rotor sentrifuge, lemari pendingin, mikropipet, volume repeator, 96-well plate (Nunc), ELISA reader (SLT 340 ATC), tissue (Nice), sarung tangan, masker.
2. Bahan penelitian
21
a. Daun mimba segar yang diambil dari Desa Gayamharjo, Sleman, Yogyakarta b. Hewan uji: tikus jantan galur Wistar yang berusia 3 bulan dengan berat badan
150-250 gram c. Etanol teknis 70% d. Aquades
e. Antigen: vaksin hepatitis B (Hepavac-gene®) f. Bahan untuk metode ELISA:
1) Larutan phosphate-buffered saline (PBS): Natrium Klorida (E-Merck), Natrium dihidrogen fosfat Merck), Natrium 2-dihidrogen fosfat (E-Merck), Tween 20 (E-Merck)
2) Reagen pem-blok: bovine serum albumin (BSA) (Gibco) 3) Natrium hidrogen karbonat (E-Merck)
4) Natrium karbonat (E-Merck)
5) Antibodi sekunder: konjugat anti-mouse IgG Alkaline Phosphatase 6) Substrat: 4-nitrofenil fosfat (NPP) (E-Merck)
7) Reagen stopper: asam Sulfat (E-Merck)
D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tumbuhan
22
2. Pengumpulan daun mimba
Daun mimba yang diambil dari pohon mimba yang tumbuh di Desa Gayamharjo, Sleman, Yogyakarta, pada bulan Mei 2008, yang dipilih adalah daun yang sudah tua dan berwarna hijau tua. Daun disortir dan dicuci dengan air mengalir.
3. Pengeringan daun mimba
Daun mimba diratakan, ditata setipis mungkin agar cepat kering bila dikeringkan di bawah sinar matahari, dengan ditutup kain hitam. Penjemuran dilakukan sampai daun mimba kering, yang ditandai dengan mudah dipatahkannya daun tersebut dengan tangan. Pengeringan dijaga agar jangan sampai daun menjadi coklat karena dikhawatirkan kandungan senyawa mungkin rusak.
4. Pembuatan serbuk daun mimba
Setelah kering, daun mimba dibuat serbuk dengan cara diremas-remas, kemudian diblender sampai halus dan diayak dengan ayakan tepung yang mempunyai 132 lubang per 1 cm2.
5. Pembuatan ekstrak etanolik daun mimba
23
6. Perlakuan hewan percobaan
Tikus diinduksi dengan ekstrak etanolik daun mimba sesuai dengan tiga kelompok perlakuan kadar setiap hari selama 2 minggu. Tikus diimunisasi dengan antigen vaksin Hepatitis B, secara intraperitonial. Imunisasi diulang setiap 2 minggu hingga 3 kali pemberian antigen. Tikus diambil darahnya satu kali sebelum dimulai perlakuan dan tiga hari setelah imunisasi terakhir. Sampel serum dianalisis dengan metode ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) untuk mengetahui jumlah antibodi yang dihasilkan
terhadap antigen vaksin hepatitis B. 7. Metode ELISA
Mikroplet dilapisi dengan antigen vaksin Hepatitis B kadar 5 µg/ml dalam PBS sebanyak 100 µl per sumuran, kemudian diinkubasi semalam pada suhu 370C. Cuci 3 kali dengan PBST20 0,05%. Blok dengan BSA 0,5% dalam PBS sebanyak 100 µl per sumuran, diinkubasikan selama 1 jam pada 370C. Serum dilarutkan dalam PBS dengan perbandingan 1:50, kemudian dimasukkan ke dalam mikroplet sebanyak 100 µl per sumuran. Mikroplet kemudian diinkubasikan pada 370C selama 2 jam. Cuci 3 kali dengan PBST20 0,05%. Goat antimouse IgG dimasukkan ke dalam sumuran sebanyak 100 µl per
24
E. Analisis Hasil
25 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengumpulan Daun Mimba dan Pembuatan Simplisia
Daun yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari tanaman Azadirachta indica (A. Juss). Daun segar diambil dari Desa Gayamharjo, Sleman,
Yogyakarta, pada bulan Mei tahun 2008. Bahan yang digunakan berasal dari satu pohon dan dikumpulkan dalam satu waktu yang sama untuk mengurangi variabel pengacau seperti umur tanaman dan kondisi lingkungan saat daun dipetik, yang akan mempengaruhi kandungan kimia dalam daun. Daun yang dipilih adalah yang umurnya tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua agar senyawa kimia yang dikandung optimal. Setelah dipetik, dilakukan pemisahan antara daun dengan ibu tangkai daun dan bahan-bahan asing lainnya, kemudian dicuci dengan air bersih mengalir. Pencucian bertujuan untuk menghilangkan pengotor dari permukaan daun.
26
B. Hasil Ekstraksi
Serbuk simplisia yang telah diperoleh diekstraksi dengan pelarut etanol teknis 70%. Pelarut akan menembus dinding sel simplisia dan melarutkan senyawa dengan kepolaran yang sesuai. Perbedaan konsentrasi senyawa di dalam dan di luar sel akan menimbulkan gradien konsentrasi sehingga senyawa di dalam sel akan terdesak keluar. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi dengan pengadukan secara kontinu selama 24 – 48 jam. Metode maserasi dipilih karena mudah, sederhana, tidak memerlukan panas tinggi dan dapat menyari secara efektif.
Hasil maserasi disaring kemudian dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Selanjutnya ekstrak kental
dimasukkan ke dalam oven bersuhu 40 – 600 C sampai diperoleh ekstrak kering. Untuk keperluan pembuatan ekstrak etanolik daun mimba diperlukan 1100 gram serbuk simplisia, dan diperoleh 72,36 gram ekstrak kering berwarna hitam.
C. Hasil Perlakuan terhadap Hewan Uji
27
hormon resproduksi dibandingkan tikus betina, sehingga dapat meminimalisasi variasi data.
Dalam penelitian menggunakan hewan uji penting untuk memperhatikan kondisi pemeliharaan hewan, seperti makanan, minuman, kebersihan, cahaya dan sirkulasi udara di tempat pemeliharaan. Hal-hal tersebut penting karena dapat mempengaruhi kesahihan penelitian. Peningkatan titer antibodi diinduksi dengan pemejanan antigen, yaitu vaksin Hepatitis B. Oleh karena itu faktor-faktor lain yang dapat menginduksi peningkatan titer antibodi perlu diminimalisir. Tikus diberi perlakuan ekstrak etanolik daun mimba selama 48 hari dengan dosis 35 mg/kg BB, 70 mg/kg BB, dan 140 mg/kg BB. Pemberian dosis tersebut mengacu pada penelitian yang menyebutkan bahwa ekstrak air daun mimba dengan dosis 100 mg/kg BB dapat meningkatkan respon imun secara humoral dan seluler (Ray, 1996). Pemejanan ekstrak dilakukan melalui rute oral karena rute tersebut merupakan rute administrasi yang digunakan oleh manusia.
28
Gambar 2. Profil Rata-rata Berat Badan Tikus Setiap Minggu Selama Masa Perlakuan
29
kapsula Glissoni (selaput pembungkus hepar), inflamasi, pelebaran sinusoid, hemorraghi pada daerah di sekitar kapsula Glissoni, namun hepatosit normal. Perubahan-perubahan tersebut bersifat reversibel karena sel hepatosit tetap normal.
(a) (b)
Gambar 3. (a) Histologi Hepar Tanpa Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba (Perbesaran 400x) (b) Histologi Hepar dengan Perlakuan Ekstrak Etanolik Daun Mimba Dosis 140mg/kgBB (perbesaran 400x) (i) hepatosit (ii) sinusoid (iii) kapsula glissoni (iv) vakuola (v) sel radang
D. Hasil Pengamatan Titer Antibodi
Serum hewan uji diperoleh dengan pengambilan sampel darah sebelum mulai diberi perlakuan ekstrak etanolik daun mimba dan setelah perlakuan berakhir. Pengukuran titer antibodi dilakukan dengan metode ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Konfigurasi yang dipilih adalah ELISA tak
30
Untuk pengukuran digunakan mikroplet dengan 96 sumuran. Mikroplet dilapisi antigen vaksin Hepatitis B yang dilarutkan dalam medium Phosphate-Buffered Saline. Selanjutnya ditambahkan larutan BSA yang berfungsi sebagai
pemblok untuk mempertahankan lapisan pertama agar tetap menempel pada dinding sumuran. Pemblokan substrat padat juga bertujuan untuk menghambat terjadinya reaksi pengikatan non-spesifik yang dapat mengganggu pengukuran. BSA mengisi tempat-tempat kosong yang tertinggal pada substrat padat sehingga menghambat pengikatan non-spesifik. Serum yang diperoleh dari hewan uji kemudian dimasukkan ke dalam mikroplet dan diinkubasi selama 2 jam. Setelah inkubasi, mikroplet dicuci dengan medium PBST20 untuk menghilangkan imunoglobulin yang tidak berikatan dengan antigen (imunoglobulin sisa). Goat anti-mouse IgG yang terkonjugasi enzim ditambahkan sebagai antibodi sekunder
31
Ganbar 4. Skema ikatan yang terjadi dalam plat ELISA (Anonim, 2008d)
Gambar 5. Reaksi substrat NPP dengan enzim alkalin fosfatase
32
Tabel I. Data Rata-rata Absorbansi Titer Antibodi Setelah Perlakuan
KELOMPOK MEAN ± SD
K 0.054 ± 0.001
D1 0.053 ± 0.002
D2 0.052 ± 0.001
D3 0.054 ± 0.001
Grafik Rata-rata Absorbansi Ke lompok Kontrol dan Pe rlakuan
Gambar 6. Grafik Rata-rata Absorbansi Kelompok Kontrol dan Perlakuan
Untuk melihat ada tidaknya perbedaan antar kelompok perlakuan dilakukan uji statistik dengan taraf kepercayaan 95%. Uji yang digunakan adalah uji Kruskal Wallis menggunakan program SPSS 12.0. Uji Kruskal Wallis dipilih karena distribusi data tidak normal dan data tidak homogen. Hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan ada perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan (P<0,050).
33
Mimba memiliki kandungan senyawa imunomodulator, baik yang beraktivitas sebagai imunostimulan maupun imunosupresan. Hasil penelitian ini bertolak belakang dengan hasil penelitian pengaruh ekstrak etanolik daun mimba terhadap proliferasi sel limfosit (belum dipublikasi) di mana ekstrak etanolik daun mimba pada dosis 35; 70; 140 mg/kg BB mampu meningkatkan proliferasi sel limfosit dibandingkan kelompok kontrol aquades. Dari perbandingan hasil ini diketahui bahwa ekstrak etanolik daun mimba mampu meningkatkan proliferasi sel limfosit namun juga dapat menurunkan produksi antibodi. Perbedaan hasil tersebut dimungkinkan terjadi karena dalam ekstrak etanolik daun mimba terdapat flavonoid. Dalam suatu penelitian mengenai efek imunomodulasi flavonoid disebutkan bahwa flavonoid dapat menghambat proliferasi PBMC (human peripheral blood mononuclear cells) dan berakibat pada penghambatan produksi
interleukin-2 dan interferon-γ (Yuh-Chi, 2004). IL-2 merupakan salah satu sitokin yang menstimulasi sel B untuk berproliferasi dan mensekresi imunoglobulin (Punturee, 2005).
34 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Ekstrak etanolik daun mimba pada dosis 35 mg/kg BB, 70 mg/kg BB, dan 140 mg/kg BB yang dipejankan pada tikus jantan galur Wistar tidak memberikan efek imunostimulan dengan peningkatan kadar antibodi.
2. Pada pemberian ekstrak etanolik daun mimba dosis 35 mg/kg BB dan 70 mg/kg BB cenderung terjadi penurunan kadar antibodi (imunosupresan).
3. Hasil histologi hepar menunjukkan adanya perubahan pada organ hepar setelah pemejanan 140 mg/kgBB ekstrak etanolik daun mimba, yaitu terjadi hemorraghi, inflamasi, pelebaran sinusoid dan penebalan kapsula glissoni. Perubahan ini masih reversibel selama sel hepatosit masih normal.
B. Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui senyawa yang bertanggung jawab terhadap efek imunostimulan dan imunosupresan dalam daun mimba. Penelitian dapat dilakukan dengan cara memfraksinasi dan mengisolasi senyawa-senyawa dalam ekstrak etanolik daun mimba, kemudian dilakukan uji peningkatan kadar antibodi.
35
36
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, edisi III, 9, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Anonim, 1986, Sediaan Galenika, 10-16, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 1998, The Neem Tree, HDRA-The Organic Organisation, http://www.gardenorganic.org.uk/pdfs/international_programme/NeemTree. pdf, diakses tanggal 20 Desember 2008.
Anonim, 2000, Parameter standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan 1, 1-6, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Anonim, 2008a, immune respons, http://www.biol.sc.edu/courses/bio102/f97-39.html, diakses tanggal 3 November 2008
Anonim, 2008b, Immunomodulator, http://medical.merriam-webster.com/medical/immunomodulator, diakses tanggal 8 Mei 2008.
Anonim, 2008c, Product-Hepavax-Gene, http://www.crucell.com/Products-Hepavax-Gene, diakses tanggal 16 Oktober 2008.
Anonim, 2008d, Plant Virus, http://www.apsnet.org/education/IntroPlantPath/PathogenGroups/plantVirus es/text/fig27.htm, diakses tanggal 7 Januari 2009.
Apriyanto, A., 2002, Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) pada Mencit, Skripsi, xvi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Baral, R., Chattopadhyay, U., 2004, Neem (Azadirachta indica) Leaf Mediated Immune Activation Causes Prophylactic Growth Inhibition of Murine Erlich Carcinoma and B16 Melanoma, Int. Immunopharmacol Mar;4(3):355-66, http://www.researchneem.com/research/IMMUNESYS TEM.pdf, diakses tanggal 10 Mei 2008
Burgess, G. W., 1995, Prinsip Dasar ELISA dan Variasi Konfigurasinya, dalam Burgess, G. W., (Ed.), Teknologi ELISA dalam Diagnosis dan Penelitian, 51-60, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
37
82, no. 11, 10 june 2002, www.ias.ac.in/currsci/jun102002/1336.pdf, diakses tanggal 3 Januari 2009.
Bratawidjaja, K. G., 2004, Imunologi Dasar, edisi ke-6, 7, 73, 77, 450, Balai Penerbit FKUI, Jakarta.
Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, 689-691, John Wiley and Sons, Inc., USA.
Dasgupta, 1992, Modern Immunology, 77, 79 Jaypee Brothers, New Delhi.
Duke, J., 1996, Dr. Duke’s Phytochemical and Ethnobotanical Databases, Azadiractha indica A. Juss Activities, http://sun.ars-grin.gov:8080/npgspub/xsql/duke/plantdisp.xsql?taxon=146, diakses tanggal 13 Mei 2008
Gan, V.H.S., dan Handoko, T., 1991, Farmakologi dan Terapi ed 3, 639 – 641, Gaya Baru, Jakarta.
Hutapea, J. R., dkk, 1993, Inventaris Tanaman Obat Indonesia II, 67, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Juyal, P.D., Singla L.D., 2008, Herbal Immunomodulatory and Therapeutics Approaches to Control Parasitic Infection in Lifestock, http://hillagric.ernet.in/education/covas/vpharma/winter%20school/lectures/ 24%20Herbal%20immunomodulatory%20approaches%20parasitic.pdf, diakses tanggal 25 April 2008
Korsmeyer, S. J., 1991, Immunoglobulin : Protein and Genes, in Schwartz, B. D., (Ed.), Immunology, 11, Upjohn Company, Kalamazoo.
Kresno, S. B., 1996, Imunologi, Diagnosis dan Prosedur Laboratorium, edisi pertama, 16, 65, 71, 413-414, Fakultas Kedokteran UI, Jakarta.
Mandal, I., Chattopadhyay, U., and Baral R., 2007, Neem Preparation Enhances Th1 Type Immune Response and Anti-tumor Immunity Against Breast Tumor Associated Antigen, Cancer Immunity vol 7, p.8, http://www.cancerimmunity.org/v7p8/070308.htm, diakses tanggal 10 Mei 2008
38
Quinn, C. P., Semenova, V. A., Elie, C. M., Romero-Steiner, S., Greene, C., Li, H., et al., 2002, Specific, Sensitive, and Quantitative Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Human Immunoglobulin G Antibodies to Anthrax Toxin Protective Antigen, http://www.cdc.gov/NCIDOD/eid/vol8no10/pdf/02-0380.pdf, diakses tanggal 5 Mei 2008
Ray, A., Banerjee B.D., Sen P., 1996, Modulation of humoral and cell-mediated immune responses by Azadirachta indica (Neem) in mice, Indian J Exp Biol. 1996 Jul ;34 (7):698-701 8979510, http://lib.bioinfo.pl/pmid:8979510 biobank, diakses tanggal 10 Mei 2008
Roitt, I. M., 2003, Immunologi Essential Immunology, edisi ke-8, diterjemahkan oleh Harahap, A., Kurniawan, L., Djauzi, S., Kresno, S. B., Dachlan, Y. P., 21-22, Widya Medika, Jakarta.
Sairam M, Sharma S.K., Ilavazhagan G., Kumar D., Selvamurthy W., 1997, Immunomodulatory Effect of NIM-76, A Volatile Fraction from Neem Oil,
J Ethnopharmacol, Jan; 55(2) :133-9, http://www.researchneem.com/research/IMMUNESYSTEM.pdf, diakses tanggal 10 Mei 2008
Upadhyay SN, Dhawan S, Garg S, and Talwar GP, 1992, Immunomodulatory effects of neem (Azadirachta indica) oil, Int J Immunopharmacol Oct;14(7) : 1187-93, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8979510?Dopt =Abstract, diakses tanggal 10 Mei 2008
Wang, C., 2001, Soluble CD4 Suppresses T-dependent IgG2a Antibody Response of CD4 Loosing Mice by Inhibiting IFNγ Production, J Microbiol Immunol Infect, 34, 36.
39
40
Lampiran 1. Perhitungan Dosis
Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan Ray (1996), ekstrak air daun mimba pada dosis 100 mg/kgBB mencit mempunyai efek peningkatan titer antibodi. Dosis yang digunakan dalam penelitian ini adalah ½ x, 1x, dan 2x dosis acuan.
Konversi dosis dari mencit 20 g ke tikus 200 g = 7,0 Dosis I : ½ x 100 mg/kgBB mencit = 50 mg/kgBB
Dosis pada mencit 20 g = x 50 mg/kgBB = 1 mg/20 g
Dosis pada tikus 200 g = 1 mg/20 g x 7,0 = 7 mg/200 g
Dosis per kgBB tikus = 7mg/200g x = 35 mg/kgBB
Dosis II : 100 mg/kgBB mencit = 100 mg/kgBB
Dosis pada mencit 20 g = x 100 mg/kgBB = 2 mg/20 g
Kelompok kontrol aquades :
41
Perhitungan dosis antigen
Antigen yang digunakan adalah Hepavax-Gene® dengan dosis 20 µg digunakan oleh masyarakat Indonesia dengan asumsi berat badan 50 kg. Konsentrasi antigen adalah 20 µg/ml
Konversi dosis dari manusia 70 kg ke tikus 200 g = 0,018
Dosis untuk manusia 70 kg = x 20 µg = 28 µg
Dosis antigen untuk tikus 200g = 0,018 x 28 µg = 0,504 µg/200 g Volume pemberian intraperitoneal = 2,5 ml
Konsentrasi yang dibuat = = 0,202 µg/ml ~ 0,2 µg/ml
42
Lampiran 2. Rata-rata Berat Badan Tikus per Minggu
Tabel II. Profil Berat Badan Tikus Hasil Rata-rata Mingguan Selama Masa Perlakuan
43
Lampiran 3. Data Absorbansi Peningkatan Titer Antibodi
Tabel III. Hasil Uji Peningkatan Titer Antibodi secara ELISA
Lampiran 4. Hasil Analisis Statistik Deskriptif
Case Processing Summary
44
Descriptives
Kelompok Statistic Std. Error
Mean .05367 .000408
Lower Bound .05273 95% Confidence
Interval for Mean Upper Bound
.05461
5% Trimmed Mean .05363
Median .05400
Variance .000
Std. Deviation .001225
Minimum .052
Maximum .056
Range .004
Interquartile Range .002
Skewness .292 .717
kontrol
Kurtosis .825 1.400
Mean .05318 .000569
Lower Bound .05191 95% Confidence
Interval for Mean Upper Bound
.05445
5% Trimmed Mean .05315
Median .05400
Variance .000
Std. Deviation .001888
Minimum .051
Maximum .056
Range .005
Interquartile Range .004
Skewness -.100 .661
D1
Kurtosis -1.613 1.279
Mean .05175 .000313
Lower Bound .05101 95% Confidence
Interval for Mean Upper Bound
.05249
5% Trimmed Mean .05172
Median .05150
Variance .000
Std. Deviation .000886
Minimum .051
Maximum .053
Range .002
Interquartile Range .002
45
Mean .05371 .000421
Lower Bound .05269 95% Confidence
Interval for Mean Upper Bound
.05474
5% Trimmed Mean .05374
Median .05400
Variance .000
Std. Deviation .001113
Minimum .052
Maximum .055
Range .003
Interquartile Range .002
Skewness -.249 .794
D3
Kurtosis -.944 1.587
Lampiran 5. Uji Normalitas Data dengan Uji Shapiro-Wilk dan Uji Homogenitas Data
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Absorbansi .187 26 .020 .890 26 .009
a Lilliefors Significance Correction
Hasil uji normalitas data dengan uji Shapiro-Wilk menunjukkan bahwa data tidak terdistribusi normal (p<0,05).
Test of Homogeneity of Variances
Absorbansi Levene
Statistic df1 df2 Sig.
3.315 3 31 .033
46
Berdasarkan hasil uji normalitas dan homogenitas, maka uji hipotesis yang digunakan adalah uji nonn-parametrik (uji Kruskal-Wallis).
Lampiran 6. Hasil Uji Kruskal-Wallis
Kruskal-Wallis Test
Test Statistics(a,b)
Absorbansi
Chi-Square 8.852
df 3
Asymp. Sig. .031 a Kruskal Wallis Test
b Grouping Variable: Kelompok
47
Lampiran 7. Uji Kruskal-Wallis untuk Kelompok yang Mendapat Perlakuan Daun Mimba
Kruskal-Wallis Test
Ranks
Kelompok N Mean Rank
D1 11 14.73
D2 8 8.25
D3 7 17.57
Absorbansi
Total 26
Test Statistics(a,b)
Absorbansi
Chi-Square 6.335
df 2
Asymp. Sig. .042 a Kruskal Wallis Test
b Grouping Variable: Kelompok
48
49
50
Lampiran 10. Serbuk Daun Mimba
51
Lampiran 12. 96 well plate (Nunc)
52
53
BIOGRAFI PENULIS
