Aktivitas Sitotoksik Natural Killer Cell: Pengukuran terhadap Mekanisme Apoptosis
Abstrak
Aktivitas sitotoksik Natural Killer cell (sel NK) sangat penting untuk membersihkan virus dan sel-sel yang berubah menjadi ganas. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk meneliti mekanisme apoptosis dari sel NK yang bertujuan untuk melakukan pengukuran tambahan terhadap fungsi efektor sel NK. 19 kontrol yang sehat (umur = 31 ± 7,2 tahun) berpartisipasi dalam penelitian ini.
Flow cytometric protocols menilai aktivitas sitotoksik sel NK melawan sel tumor
K562, protein litik, degranulasi dan produksi interferon gamma. Pelepasan perforin berkorelasi secara signifikan dengan aktivitas sitotoksik (r = -0.46, p <0,05) dan degranulasi (r = -0.60, p <0,05). Hasil ini menunjukkan bahwa perforin mungkin digunakan sebagai pengukuran tambahan terhadap fungsi efektor sel NK sitotoksik.
Kata kunci: Aktivitas Sitotoksik, Protein Litik, Degranulasi PENDAHULUAN
Natural Killer cell (sel NK) merupakan sel imun bawaan yang melisiskan
sel-sel yang terinfeksi dan dan berubah menjadi ganas melalui aktivitas sitotoksik [10]. Sel NK sitotoksik mengandung banyak granul sekretori yang menyimpan dan melepaskan death-inducing protein seperti perforin dan granzyme [18]. Protein litik ini disimpan dalam granul yang dikelilingi oleh lipid bilayer yang mengandung lisosom yang berkaitan dengan membran glikoprotein, meliputi CD107a, CD107b dan CD63 [25]. Jalur sekresi granula adalah jalur utama yang digunakan untuk aktivitas sitotoksik sel NK [24]. Pengenalan sel NK terhadap sel target mengaktifkan eksositosis protein litik dalam proses yang dikenal sebagai degranulasi, pelepasan perforin dan granzyme ke immune sinaps [12].
Perforin memfasilitasi pengiriman serin protease yang dikenal sebagai granzyme ke sel target dengan membentuk pori pada endosome dan membran plasma sel target [15, 31]. Pelepasan granzyme mengaktivasi tiga jalur apoptosis yang berbeda pada sel target. Pada manusia, granzyme B (GrzB) dan granzyme A (GrzA) adalah aktivator apoptosis yang paling poten [5, 14]. GrzB menginduksi
apoptosis melalui aktivasi kaskade caspase atau jalur mitokondria yang secara kinetis lebih lambat untuk mengaktivasi [4, 15]. Kedua jalur mengarah pada aktivasi deoxyribonuclease (DNase), yang memotong DNA berantai ganda, yang menyebabkan lisis sel secara cepat [5]. GrzA menginduksi apoptosis sel target secara independen dari aktivasi caspase dengan menargetkan kompleks yang berkaitang dengan retikulum endoplasma untuk proteolisis, yang mengaktivasi DNase menyebabkan pecahan rantai tunggal dalam DNA [4,15]. DNase bekerja melalui kombinasi dengan 3 'repair exonuclease (TREX1), mencegah perbaikan DNA dengan memblokir akhir DNA dari re-annealing dan menyebabkan lisis sitotoksik pada sel target [5].
Sel NK juga memulai apoptosis sel target melalui death receptor pathway [24]. Ligan tumor necrosis factor ( TNF ) diekspresikan pada sel NK dengan mengikat Fas ( CD95/Apo-1 ) dan TNF -related apoptosis inducing ligand (TRAIL) pada sel target untuk menginduksi apoptosis [29 , 32] . Death receptor pathway meningkatkan produksi sel NK dari sitokin interferon gamma ( IFN - γ ) [28 , 29] . IFN – γ meningkatkan ekspresi permukaan sel pada ligan terhadap TRAIL dan Fas dan mensensitisasi sel target terhadap efek sitotoksik death receptor
pathway dengan bertindak sebagai target transkripsi untuk gen pro-apoptosis
[13 , 28 , 29].
Kemampuan untuk mengukur aktivitas sitotoksik sel NK memiliki implikasi penting secara klinis dimana penurunan aktivitas berkaitan dengan kerentanan terhadap infeksi berat [30]. Pemeriksaan tradisional yang mengukur aktivitas sitotoksik sel NK meliputi Chromium Release Assay ( CRA ) dan flow cytometric
based cytotoxic assay yang mengukur lisisnya sel target yang diinduksi aktivitas
sitotoksik sel NK [12]. Penelitian lebih lanjut terhadap jalur aktivitas sitotoksik sel NK dapat menjadi pengukuran tambahan terhadap fungsi efektor sel NK yang berperan dalam induksi apoptosis pada sel target [21]. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki mekanisme induksi apoptosis sel NK untuk menentukan pengukuran tambahan terhadap aktivitas sitotoksik sel NK. Aktivitas sitotoksik sel NK dibandingkan melalui sampel sel mononuklear darah tepi/peripheral blood
mononuclear cells ( PBMC ) dan sel NK terisolasi untuk menentukan apakah
sel-sel NK yang terisolasi mengalami peningkatan sensitivitas terhadap aktivitas sitotoksik.
METODE
Subyek Penelitian
19 sukarelawan sehat (terdiri dari 10 pria, 9 wanita, usia: 31 ± 7,2 tahun) mendonorkan sampel darahnya. Analisa darah lengkap/full blood count (FBC) termasuk lima jenis diferensiasi dan uji C-reactive protein dimasukkan sebagai kriteria inklusi pada peserta penelitian ini.
Sel
Gradasi densitas sentrifugasi Ficoll-Hypaque digunakan untuk mengisolasi PBMC (GE Health Care, Uppsala). Peralatan MACS NK cell negative isolation (Miltenyi Biotec, Teterow) memisahkan sel-sel NK dari PBMC sesuai dengan instruksi. Setelah isolasi, PBMC dan sampel sel NK terisolasi disesuaikan pada konsentrasi 1x106sel/ml dengan RPMI-1640 (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad) ditambah dengan 10% fetal bovine serum (FBS ) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad), 1% streptomyocin/penisilin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad), larutan sodium piruvat (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad) dan larutan buffer 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad).
Pemeriksaan aktivitas sel NK sitotoksik
Kemampuan sel NK untuk melisiskan sel-sel tumor K562 diukur pada sampel PBMC dan Sel NK terisolasi dengan flow cytometer sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya [6]. Pada awalnya, sel-sel efektor diberi label Paul Karl Horan (PKH) -26 (Sigma-Aldrich, St Louis) dan dikombinasikan dengan sel target K562 ( 1x105 sel / ml) pada tiga efektor dengan rasio target (25:1, 50:1 dan 100:1)
untuk menentukan hubungan respon dosis antara jumlah sel K562 yang dilisiskan oleh sel NK efektor. Setiap sampel dibuat duplikat dan sampel kontrol K562 disertakan.
Sel-sel diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37° C dengan 5% CO2.
Setelah inkubasi, 7 amino - actinomycin D (7 - AAD) (BD Biosciences , San Jose) dan fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V (BD Bioscience , San Jose ) ditambahkan untuk menentukan jumlah sel-sel K562 yang apoptosis pada FACS – Calibur flow cytometer (Becton Dickinson [BD] FACSCalibur, San Jose). Sebanyak 10.000 kejadian dianalisis dan jumlah kejadian di masing-masing regio
digunakan untuk menentukan aktivitas sel NK sitotoksik sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya [6].
Pewarnaan Intraseluler Protein Litik
Pewarnaan intraseluler digunakan untuk mendeteksi keberadaan perforin, Grz A dan GrzB di dalam sel NK [ 17 ]. Sampel kontrol dan sel K562 yang distimulasi (25:1) dengan PBMC atau sel NK ( 1x106 sel/ml) dibuat duplikat dan
dimasukkan dalam inkubator pada suhu 37° C dengan 5% CO2 selama 4 jam.
Setelah inkubasi, fluorochromeconjugated monoclonal antibodi ditambahkan untuk pewarnaan permukaan CD (cluster differentiation) yang spesifik untuk sel NK . Untuk sampel perforin dan GrzA , ditambah CD16 FITC dan CD56 phycoerythrin (PE) ditambahkan ke sampel GrzB. Antibodi monoklonal, perforin PE , PE dan GrzA GrzB FITC (BDBiosciences, San Jose) ditambahkan ke setiap sampel untuk dianalisa pada flow cytometer. Sebanyak 10.000 kejadian dianalisis pada setiap sampel untuk menentukan persentase gated lymphocytes CD56 + /CD16 + dan protein-protein litik.
Pengukuran Degranulasi dan Interferon Gamma
Ekspresi sel NK pada CD107a diukur sebagai marker untuk degranulasi dan pewarnaan intraseluler yang menentukan produksi IFN - γ [2]. CD107a dan IFN – γ memerlukan penambahan monensin (BD Bioscience , San Jose) untuk mencegah degradasi CD107a dan Brefeldin A (BD Bioscience , San Jose) untuk menghambat eksositosis IFN - γ [2 , 8]. PBMC dan sel NK (1x106cells/ml)
distimulasi dengan sel-sel K562 (1x105/ml) dengan rasio 25:1 atau 10ng/ml
phorbol 12 - miristat 13 – asetat (PMA) (Sigma - Aldrich , St Louis) dan 1μg/ml ionomycin (I) (Sigma - Aldrich ,St Louis) [1 , 2] . CD107a FITC ditambahkan ke semua sampel untuk mendeteksi sel NK yang terdegranulasi . Sampel dibuat duplikat dan diinkubasi pada suhu 37° C dengan 5% CO2 selama 6 jam . Setelah
inkubasi, ditambah CD56 PE (BD Bioscience ,San Jose) dan pewarnaan intraseluler menentukan produksi IFN -γ. Sebanyak 10.000 kejadian dikumpulkan dan dianalisis pada aliran flow cytometer untuk menentukan persentase gated
Analisa Statistik
Analisis statistik telah diselesaikan pada GraphPad PRISM (versi 6). Uji independent sample T digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan yang signifikan antara pria dan wanita pada FBC dan uji C-reactive protein. Sebuah pengukuran analisis varian berulang (ANOVA) pada dua variabel dependen dilakukan pada kumpulan data dari pengukuran lisis K562, protein litik dan CD107a/IFN-γ. Bonferronii’s multiple comparison mengidentifikasi signifikansi dimana nilai P kurang dari 0,05 . Korelasi Spearman mengidentifikasi setiap hubungan yang signifikan antara mekanisme yang merangsang apoptosis dan aktivitas sitotoksik yang ditentukan oleh lisis K562.
HASIL
Karasteristik partisipan
Kriteria inklusi dari studi ini telah ditentukan oleh tes FBC dan C reaktif protein. Peningkatan yang signifikan (p<0.05) dari sel darah putih, monocytes, sel darah merah, haemoglobin, haematokrit dan konsentrasi corpuscular haemoglobin yang dibandingkan antara laki-laki dan perempuan (table 1)
Peningkatan aktivitas NK Cell Cytotoxic di PBMCs
Aktivitas NK cell cytotoxic telah ditentukan oleh jumlah dari sel K562 yang apoptosis dan lisis. Di dalam sampel PBMC, peningkatan effecter rasio target, menyebabkan peningkatan yang signifikan (p<0.01) dari aktivitas NK cell cytotoxic ketika rasio 25:1, yang dibandingkan dengan 50:1 dan 100:1 (figure 1[A]). Tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan pada aktivitas cytotoxic dalam sampel NK sel yang diisolasi (figure 2[B]). Perbandingan aktivitas cytotoxic dengan perbedaan rasio di PMBC dan NK sel yang diisolasi menunjukan tidak adanya perbedaan yang signifikan (data tidak ditunjukan).
Berkurangnya lisis protein NK sel di PMBC
Perforin, GrzA dan GrzB dalam NK sel telah ditemukan di sampel (Figure 2 [B]) dan NK sel yang diisolasi (Figure 2 [C]). Protein lisis telah dibandingkan di kontrol dan sampel yang distimulasi K562, dan hasilnya tidak ada perubahan yang signifikan. Ekspresi dari protein lisis lebih tinggi pada NK sel yang diisolasi.
Peningkatan degranulasi NK sel dan Stimulasi ikutan IFN-γ
NK sel telah distimulasi untuk degranulasi dan menghasilkan IFN-γ. Perbandingan antara sel yang distimulasi K562 dan sampel control menunjukan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam ekspresi CD107a dan IFN-γ (Figure 3[B]). Ketika hasil dari sel yang distimulasi PMA/I dibandingkan dengan sampel control, didapatkan peningkatan yang signifikan (p<0.05) dalam ekspresi CD107a dan IFN-γ baik dalam PBMC maupun sampel NK sel yang diisolasi.
Korelasi antara mekanisme apoptosis NK sel dan aktivitas cytotoxic
Korelasi yang signifikan ditemukan antara NK sel perforin dan aktivitas cytotoxic di 25:1 (table 2). Pada NK sel yang distimulasi dengan K562, korelasi yang dignifikan juga ditemukan antara protein lisis (perforin, GrzA and GrzB) dan ekspresi CD107a.
PEMBAHASAN
Aktifitas sitotoksik merupakan suatu proses yang penting untuk menjaga kesehatan karena menjamin terhapusnya sel –sel yang terinfeksi kuman patogen dan sel – sel yang berubah menuju keganasan. Penelitian terbaru yang dilakukan menguji mekanisme induksi apoptosis pada jalur aktivitas sitotoksik sel NK, untuk menentukan sebuah tolok ukur tambahan mengenai fungsi efektor sel NK. Hasilnya menunjukkan bahwa perforin secara signifikan berkorelasi dengan aktivitas sitotoksik dan degranulasi, sehingga kita mungkin dapat menggunakannya sebagai tolok ukur tambahan untuk aktivitas sitotoksik dari sel NK.
Pemeriksaan kesehatan rutin yang dilakukan pada populasi peserta tidak mengidentifikasi adanya variabel pengganggu yang dapat mempengaruhi proses pengukuran aktivitas sitotoksik dari sel NK. Sementara itu terdapat beberapa perbedaan signifikan rerata antara pria dan wanita yang diamati menggunakan parameter – parameter FBC, hal ini mungkin dapat terjadi karena adanya perbedaan gender yang disebabkan oleh variasi genetik dan adanya tiga orang wanita pada populasi yang menderita anemia.
Aktifitas sitotoksik sel NK pada populasi yang sehat dalam penelitian ini konsisten pada nilai 41,1± 15% seperti yang telah dilaporkan dalam literatur. Respon dosis tersebut berkorelasi dengan peningkatan rasio target disebabkan oleh meningkatnya PBMC yang signifikan. Hal ini juga berhubungan dengan
peningkatan aktifitas sitotoksik yang signifikan. Pada sel NK yang terisolasi, peningkatan efektor pada target rasiotidak berpengaruh signifikan terhadap aktifitas sitotoksik. Hal ini mungkin dapat dijelaskan dengan adanya pengaturan ketat pada sel NK untuk berhenti sesaat , yang mana hal ini akan mencegah pewarisan penyakit autoimun.
Protein litik adalah mekanisme yang mengaktivasi apoptosis, yang dilepaskan oleh butiran – butiran sitotoksik sel NK. Bila dibandingkan dengan sampel – sampel PBMC, pada sel NK terisolasi terdapat peningkatan perforin, GrzA dan GrzB yang signifikan. Penurunan level protein litik pada sampel PBMC mungkin karena munculnya limfosit lain termasuk makrofag, sel T dan sel B. CD56 dari sel NK meliputi 15±8% dari total limfosit dalam darah, yang mana hal˖ ini juga meneyebabkan penurunan protein litik dalam sampel PBMC
Oleh karena itu, bila dibandingkan dengan total populasi limfosit dalam peredaran darah perifer, hanya ada beberapa sel NK yang tersedia yang dapat berubah menjadi lebih sedikit lagi protein litik. Untuk memperoleh efek sitotoksik,sel-sel NK ini butuh diaktifkan dari fase istirahat. Degranulasi merupakan suatu langkah penting yang diperlukan untuk melepaskan protein litik dari granul sekresi dalam sel NK. Tidak ada perbedaan yang signifikan. Aktivitas sitotoksik sel NK Telah diamati antara ekspresi CD107a dan produksi IFN - gamma dalam sampel PBMC dan sel NK terisolasi. Stimulasi sel NK oleh PMA /I yg diregulasi oleh CD107a dan IFN gamma. PMA adalah pengganti diasilgliserol (DAG ) ,salah satu protein adaptor yang dibutuhkan untuk aktivasi protein kinase C. Ionomycin adalah kalsium ionofor selektif yang meningkatkan kadar kalsium intraseluler. Oleh karena itu, kombinasi PMA /I memfasilitasi aktivasi protein kinase C dan masuknya kalsium intraseluler, yang merupakan signaling untuk degranulasi.
Perforin dalam sel NK secara signifikan berkorelasi dengan aktifitas sitotoksik dan degranulasi. Kedua korelasi tersebut bersifat negatif, menunjukkan bahwa penurunan perforin berhubungan dengan peningkatan degranulasi dan aktivitas sitotoksik. Literatur mendukung adanya korelasi antara ekspresi CD107a dan pengeluaran perforin, lebih jauh lagi menekankan pentingnya ekspresi CD107a sebagai penanda untuk aktifitas sitotoksik dari sel NK. Tidak ada korelasi yang ditemukan antara ekspresi CD107a dan lisis sel NK pada sel – sel K562. Literatur juga menyebutkan adanya korelasi positif antara ekspresi CD107a dengan aktifitas sitotoksik dari sel NK. Ekspresi CD107a pada sel NK dari
populasi penelitian ini mungkin tidak berhubungan dengan aktifitas sitotoksik, mengacu pada rasio 25:1 yang digunakan. Pada kisaran rasio yang lebih rendah, mulai dari 1:1 dan 10:01 telah dilaporkan sebagai rasio yang optimal untuk mendeteksi ekspresi CD107a.
Korelasi antara pelepasan perforin dengan lisis sel tumor dan degranulasi menunjukkan bahwa perforin mungkin dapat digunakan sebagai indikator tambahan terhadap fungsi efektor sel NK. Dimana perforin adalah sebuah protein litik yang dilepaskan oleh sel NK untuk menginduksi apoptosis terhadap sel target, pengukuran perforin mungkin bermanfaat dalam kepentingan klinis untuk mengidentifikasi defisiensi / kelemahan / penyakit yang mempengaruhi aktifitas sitotoksik.
Keterangan Gambar
Gambar 1: Aktivitas NK sel sitotoksik dalam sampel PBMC(A) dan sel NK yang terisolasi (B). Plot kotak menunjukkan lisisnya sel NK dari sel K562 pada tiga rasio. Kotak mewakili untuk setiap ratio interquartile range (IQR), dan menunjukkan distribusi data. Garis tengah di setiap kotak mewakili nilai median. * Denotes Significance (** p<0,01 dan ***p <0,001).
Gambar 2 : Protein litik dalam sel NK. Cytometry figures mengalir dari sampel sel NK yang terisolasi (A) mewakili jumlah CD56+/CD16+ sel NK yang mengekspresikan perforin, GrzA dan GrzB. Protein litik dalam sampel PBMC(B) dan sampel sel NK yang terisolasi (C) tidak menunjukkan perbedaan stimulasi patogen yang signifikan. Data disajikan sebagai mean±standard error mean. Gambar 3 : CD107a dan IFN-γ pada PBMC dan Sel NK yang terisolasi. Aliran Cytometry mewakili gambaran sel NK dari sampel PBMC mengekspresikan CD107a dan IFN-γ (A). Dalam sampel kontrol, 1,22% dari limfosit mengekspresikanCD107a dan IFN-γ. Ketika sel-sel tersebut dirangsang dengan sel K562 dan PMA/I, jumlah sel NK yang mengekspresikan CD107a dan IFN-γ ditingkatkan menjadi 15,84 dan 19,60% secara berturut-turut. IQR pada sampel sel PBMC dan sel NK meningkat dari kontrol ke sel K562 dan PMA/ I yang telah terangsang (B). Nilai rata-rata untuk sampel diwakili oleh garis ditengah kotak. *Denotes Significance (p <0,05)
. Gambar 1
Tabel 1 : Parameter darah dan C-reactive protein subyek penelitian. Hasil disajikan sebagai sarana ± standar deviasi dari analisis diferensial lima bagian dari leukosit, jumlah sel darah merah dan parameter hematologis. * Menunjukkan perbedaan yang signifikan (p <0,05).
Males Females P Value
Total Participants (N) 10 9
White blood cells (x109/L) 6.641 ± 1.494 5.216 ± 0.653 0.017*
Neutrophils (x109/L) 3.683 ± 0.928 2.977 ± 0.955 0.121
Lymphocytes (x109/L) 2.028 ± 0.474 1.636 ± 0.470 0.089
Monocytes (x109/L) 0.558 ± 0.127 0.357 ± 0.118 0.002*
Eosinophils (x109/L) 0.284 ± 0.360 0.160 ± 0.079 0.331
Basophils (x109/L) 0.089 ± 0.037 0.158 ± 0.220 0.340
Red Blood Cells (x1012/L) 5.370 ± 0.430 4.763 ± 0.277 0.002* Haemoglobin (g/L) 156.400 ± 8.181 138.111 ± 11.731 0.001*
Haematocrit (L/L) 0.445 ± 0.026 0.407 ± 0.034 0.013*
Mean corpuscular volume (fL) 83.080 ± 3.889 85.556 ± 6.619 0.328 Mean corpuscular haemoglobin (pg) 29.240 ±1.730 29.078 ± 2.491 0.870 Mean corpuscular haemoglobin
concentration (g/L)
351.900 ± 7.475 339.556 ± 6.598 0.001* Red cell distribution width (%) 11.660 ± 0.353 12.611 ± 1.140 0.039 C reactive protein (mg/L) 0.599 ± 0.324 0.829 ± 0.699 0.384 Tabel 2 : Korelasi signifikan diidentifikasi antara mekanisme apoptosis sel NK dan aktivitas sitotoksik. Perforin secara signifikan berkorelasi dengan aktivitas sel NK sitotoksik dan ekspresi CD107a
R P value
Perforin& Cytotoxic Activity -0.467 0.044
Perforin& CD107a -0.571 0.029
GrzA& CD107a -0.561 0.049
