BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Siklus Sel
Siklus sel merupakan proses perkembangbiakan sel yang memperantarai pertumbuhan dan perkembangan makhluk hidup. Setiap sel baik normal maupun kanker mengalami siklus sel. Siklus sel memiliki dua fase utama, yakni fase S (sintesis) dan fase M (mitosis). Fase S merupakan fase terjadinya replikasi DNA kromosom dalam sel, sedangkan pada fase M terjadi pemisahan 2 set DNA kromosom tersebut menjadi 2 sel (Nurse, 2000). Fase yang membatasi kedua fase utama tersebut yang dinamakan Gap. G1 (Gap-1) terdapat sebelum fase S dan setelah
fase S dinamakan G2 (Gap-2). Pada fase G1, sel melakukan persiapan untuk sintesis
DNA yang merupakan fase awal siklus sel. Penanda fase ini adalah adanya ekspresi dan sintesis protein sebagai persiapan memasuki fase S. Pada fase G2, sel melakukan
sintesis lebih lanjut untuk proses pembelahan pada fase M (Ruddon, 2007).
Siklus sel dikontrol oleh beberapa protein yang bertindak sebagai regulator positif dan negatif. Kelompok cyclin, khususnya cyclin D, E, A, dan B merupakan protein yang levelnya fluktuatif selama proses siklus sel. Cyclin bersama dengan kelompok cyclin dependent kinase (CDK), khususnya CDK 4, 6, dan 2, bertindak sebagai regulator positif yang memacu terjadinya siklus sel. Pada mamalia ekspresi kinase (CDK4, CDK2, dan CDC2/CDK1) terjadi bersamaan dengan ekspresi cyclin
(D, E, A, dan B) secara berurutan seiring dengan jalannya siklus sel (G1-S-G2-M)
keluarga INK4 (meliputi p16, p18, p19). Selain itu, tumor suppressor protein (p53 dan pRb) juga bertindak sebagai protein regulator negatif (Foster, et al., 2001).
Checkpoint pada fase G2 terjadi ketika ada kerusakan DNA yang akan
mengaktivasi beberapa kinase termasuk ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase. Hal tersebut menginisiasi dua kaskade untuk menginaktivasi Cdc2-CycB baik dengan jalan memutuskan kompleks Cdc2-CycB maupun mengeluarkan kompleks Cdc-CycB dari nukleus atau aktivasi p21. Checkpoint pada fase G1 akan dapat dilalui
jika ukuran sel memadai, ketersediaan nutrien mencukupi, dan adanya faktor pertumbuhan (sinyal dari sel yang lain). Checkpoint pada fase G2 dapat dilewati jika
ukuran sel memadai, dan replikasi kromosom terselesaikan dengan sempurna.
Checkpoint pada metaphase (M) terpenuhi bila semua kromosom dapat menempel pada gelendong (spindle) mitosis. Checkpoint ini akan menghambat progresi siklus sel ke fase mitosis, sedangkan checkpoint pada fase M (mitosis) terjadi jika benang
spindle tidak terbentuk atau jika semua kromosom tidak dalam posisi yang benar dan tidak menempel dengan sempurna pada spindle. Kontrol checkpoint sangat penting untuk menjaga stabilitas genomik. Kesalahan pada checkpoint akan meloloskan sel untuk berkembang biak meskipun terdapat kerusakan DNA atau replikasi yang tidak lengkap atau kromosom tidak terpisah sempurna sehingga akan menghasilkan kerusakan genetik. Hal ini kritis bagi timbulnya kanker. Oleh karena itu, proses regulasi siklus sel mampu berperan dalam pencegahan kanker (Ruddon, 2007).
2.1.1 Apoptosis dan proliferasi
organ akan mengalami kemunduran fungsi yang dapat menimbulkan penyakit. Sebaliknya, apabila terjadi proliferasi berlebihan, maka akan membentuk suatu massa tumor yang akan mengarah pada kanker (Sudiana, 2011).
Apoptosis adalah kematian sel melalui mekanisme genetik dengan kerusakan/fragmentasi kromosom atau DNA. Apoptosis dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu apoptosis fisiologis dan apoptosis patologis. Apoptosis fisiologis adalah kematian sel yang diprogram (programmed cell death). Proses kematian sel erat kaitannya dengan enzim telomerase. Pada sel embrional, enzim ini mengalami aktivasi sedangkan pada sel somatik enzim ini tidak mengalami aktivasi, kecuali sel bersangkutan mengalami transformasi menjadi ganas. Telomer yang terletak pada ujung kromosom merupakan faktor yang sangat penting dalam melindungi kromosom. Pada sel normal, telomer akan memendek pada saat pembelahan diri. Apabila ukuran telomer mencapai ukuran tertentu (level kritis) akibat pembelahan berulang, maka sel tersebut tidak dapat melakukan pembelahan diri lagi. Selanjutnya sel akan mengalami apoptosis secara fisiologis. Pada sel ganas, pemendekan telomerase sampai pada level kritis tidak terjadi karena pada sel ganas terjadi aktivasi dari enzim ribonukleoprotein (telomerase) secara terus menerus. Enzim ini sangat berperan pada sintetis telomer DNA, sehingga berbagai elemen yang dibutuhkan pada pembentukan telomer dapat dibentuk secara terus menerus dan ukuran telomer pada ujung kromosom dapat dipertahankan. Oleh karena itu, sel ganas dapat bersifat immortal (Sudiana, 2011).
aktivitas p53 karena sel memiliki gen cacat yang dipicu oleh banyak faktor, antara lain bahan kimia, radikal bebas, maupun virus (oncovirus). Gen yang cacat dapat memicu aktivitas beberapa enzim seperti PKC dan CPK-K2 yang dapat memicu aktivitas p53. P53 adalah faktor transkripsi terhadap pembentukan p21. Peningkatan p21 akan menekan semua CDK (Cyclin Dependent Kinase) dengan cyclin, dimana siklus pembelahan sel sangat tergantung pada ikatan kompleks antara CDK dengan
cyclin. Apabila terjadi pengikatan p21, maka semua CDK akan ditekan, baik pada CDK-1 pada fase M maupun CDK-4 dan CDK-6 pada fase S, lalu siklus sel akan berhenti sehingga p53 akan memicu aktivitas Bax. Protein Bax akan menekan aktivitas Bcl-2 sehingga terjadi perubahan membran permeabilitas dari mitokondria yang mengakibatkan pelepasan sitokrom c ke sitosol sehingga akan mengaktivasi kaskade kaspase. Kaspase aktif ini akan mengaktifkan DNA-se yang akan menembus membran inti dan merusak DNA, sehingga DNA akan terfragmentasi dan mengalami apoptosis (Sudiana, 2011).
berlebih maupun protein yang diekspresikan adalah protein abnormal. Terjadinya apoptosis melalui jalur ligan dan fas terjadi karena dipicu oleh adanya sel yang terinfeksi virus, dimana di permukaan sel terekspresi suatu protein yang disebut fas. Fas yang terdapat pada membran sel yang terinfeksi virus akan diikat oleh ligan yang berada di permukaan NK-cell atau CTL. Adanya ikatan antar fas-ligan akan mengaktifkan suatu protein yang disebut Fas Associated Protein Death Domain
(FADD) yang dapat mengaktivasi kaspase kaskade. Selanjutnya, kaspase yang aktif akan mengaktifkan DNA-se sehingga sel akan mengalami apoptosis (Sudiana, 2011).
2.2 Kanker
Kanker adalah segolonga tidak terkendali dan kemampuan sel menyera pertumbuhan langsung di jaringan tetangganya (invasif) maupun migrasi sel ke tempat yang lebih jauh (metastasis). Pertumbuhan yang tidak terkendali tersebut disebabkan kerusaka pembelahan sel. Sel kanker kehilangan fungsi kontrolnya terhadap regulasi daur sel maupun fungsi homeostasis sel pada organisme multiseluler sehingga sel tidak dapat berproliferasi secara normal. Akibatnya, sel akan berproliferasi terus-menerus sehingga menimbulkan pertumbuhan jaringan yang abnormal (Diandana, 2009).
berkembang menjadi karsinoma in situ di mana sel pada jaringan tersebut masih terlokalisasi dan mungkin memiliki kesamaaan fungsional dengan sel normal (King, 2000). Sel neoplasma mengalami perubahan morfologi, fungsi, dan siklus pertumbuhan yang akhirnya menimbulkan disintegrasi dan hilangnya komunikasi antarsel. Tumor diklasifikasikan sebagai benigna, yaitu kejadian neoplasma yang bersifat jinak dan tidak menyebar ke jaringan di sekitarnya. Sebaliknya, maligna disinonimkan sebagai tumor yang melakukan metastasis, yaitu menyebar dan menyerang jaringan lain sehingga maligna sering disebut sebagai kanker. Kanker sering dikenal sebagai tumor, tetapi tidak semua tumor disebut kanker
Sel kanker memiliki perbedaan yang sangat signifikan dengan sel normal. Sel kanker tidak mengenal apoptosis dan akan terus hidup meski seharusnya mati (bersifat immortal) (Sofyan, 2000). Sel kanker tidak mengenal komunikasi ekstraseluler atau asosial yang diperlukan untuk menjalin koordinasi antarsel sehingga dapat saling menunjang fungsi masing-masing. Dengan sifatnya yang asosial, sel kanker bertindak semaunya sendiri tanpa peduli apa yang dibutuhkan oleh lingkungannya. Sel kanker dapat memproduksi growth factor sendiri sehingga tidak bergantung pada rangsangan sinyal pertumbuhan dari luar untuk melakukan proliferasi sehingga dapat tumbuh menjadi tak terkendali. Sel kanker juga tidak sensitif terhadap sinyal yang dapat menghentikan pertumbuhan dan pembelahan sel. Sel kanker mampu menghindar dari sinyal antipertumbuhan yang berhubungan dengan siklus sel (Kumar, et al., 2005).
(Diandana, 2009).
jangkauan metastasis tumor, akan semakin sulit disembuhkan. Kanker pada stadium metastasis merupakan penyebab 90% kematian penderita kanker (Pecorino, 2005). Untuk mencukupi kebutuhan pangan dirinya sendiri, sel kanker mampu membentuk pembuluh darah baru (neoangiogenesis) meski dapat mengganggu kestabilan jaringan tempat ia tumbuh. Sinyal inisiasi pada proses neoangiogenesis diantaranya adalah Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) dan Fibroblast Growth Factor
(FGF). Selain itu, regulator yang lain adalah angiopoietin-1, angiotropin, angiogenin, epidermal growth factor, granulocytecolony-stimulating factor, interleukin-1 (IL-1), IL-6, IL-8, PDGF, TNF-α, kolagen, cathepsin. Sel kanker memiliki kemampuan yang tidak terbatas dalam memperbanyak dirinya sendiri (proliferasi) meski sudah tidak dibutuhkan dan jumlahnya sudah melebihi kebutuhan yang seharusnya (Kumar, et al., 2005).
2.2.1 Karsinogenesis
Kanker bukan termasuk penyakit yang datang begitu saja, melainkan akibat akumulasi atau penumpukan kerusakan-kerusakan tertentu di dalam tubuh. Serangkaian proses berkembangnya kanker disebut karsinogenesis. Karsinogenesis adalah suatu proses terjadinya kanker melalui mekanisme multi tahap yang menunjukkan perubahan genetik dan menyebabkan transformasi progresif sel normal menjadi sel malignan (ganas). Perubahan ini diawali dari mutasi somatik satu sel tunggal yang mengakibatkan perubahan dari normal menjadi hiperplastik, displastik, dan pada akhirnya menjadi suatu keganasan atau malignansi (memiliki kemampuan metastasis atau menginvasi jaringan di sekitarnya). Perubahan genetik ini termasuk perubahan seluler mendasar pada sel kanker yang dipengaruhi oleh beberapa gen seperti tumor suppresor genes (pRb, p53, PTEN, E-cadherin) dan proto-oncogenes (ras, c-myc, Bcl-2). Karsinogenesis dapat dibagi menjadi empat tahap utama, yaitu tahap inisiasi, promosi, progresi, dan metastasis (Tsao, et al., 2004).
Tahap inisiasi adalah tahap pertama pada karsinogenesis dan merupakan hasil perubahan genetik yang menuntun pada proliferasi tidak terkontrol (abnormal) sebuah sel. Tahap inisiasi dapat terjadi melalui jalur germinal dan somatik. Namun pada kebanyakan kasus diperoleh secara somatik akibat terjadinya kesalahan acak saat pembelahan sel atau karena paparan dari karsinogen spesifik seperti tobako dan radiasi. Pada tahap ini, senyawa yang berpotensi sebagai senyawa karsinogen diaktivasi terlebih dahulu di dalam tubuh terutama di hepar menjadi senyawa metabolitnya. Senyawa metabolit ini ada yang bersifat reaktif, mutagenik, dan mampu berikatan dengan makromolekul di dalam tubuh seperti DNA dengan ikatan
normal secara spontan, tetapi pada tingkat lebih lanjut dapat menjadi ganas (malignan) (King, 2000).
Selanjutnya tahap promosi yang merupakan tingkat lanjutan dari tahap inisiasi. Pada tahap ini, sel mulai mengalami hiperplastik pada inti sel. Berbeda dengan tahap inisiasi yang dapat melewati jalur germinal dan somatik, tahap promosi hanya diketahui terjadi melalui jalur somatik. Pada tahap promosi, sel akan memperoleh beberapa keuntungan selektif untuk tumbuh sehingga pertumbuhannya menjadi cepat dan berubah menjadi tumor jinak. Tahap promosi tidak melibatkan perubahan struktural dari genom secara langsung, tetapi biasanya terjadi perubahan ekspresi gen yang terinisiasi (Tsao, et al., 2004; King, 2000).
Pada tahap progresi, kemampuan pembelahan yang tinggi menuntun terbentuknya koloni sel yang lebih besar melalui perubahan genetik lebih lanjut dan munculnya keistimewaan lain seperti peningkatan mobilitas dan angiogenesis (Kumar, 2005). Pada tahap ini, sel tumor dikatakan sebagai sel malignan. Pada fase ini juga akan terjadi karsinoma dan metastasis melalui aktivasi onkogen dan malfungsi dari enzim topoisomerase (Pecorino, 2005).
terdegradasinya CAMs (Cell-cell Adhesion Molecules) dan E-cadherin sebagai molekul yang menjaga pertautan antarsel. Molekul tersebut diketahui sudah sangat sedikit bahkan tidak ditemukan lagi pada sel kanker, sehingga proses metastasis dapat terus terjadi (Kumar, et al., 2005).
Kanker dapat terjadi dalam berbagai jenis sel, antara lain karsinoma (pada kelenjar epitel), glioma (pada jaringan otak), leukemia (pada sel darah putih), sarkoma (pada jaringan lunak dan jaringan ikat seperti tulang rawan, lemak, otot, ataupun tulang), myeloma (pada jaringan selaput saraf/neuron), hepatoma (pada sel hati), fibroma (pada jaringan ikat fibrosa), dan limfoma (pada kelenjar getah bening) (Anonim1
2.2.2 Kanker payudara , 2014).
Kanker payudara merupakan kanker yang menyerang jaringan epitelial payudara, yaitu membran mukosa dan kelenjar sehingga kanker payudara tergolong pada karsinoma. Kanker payudara merupakan kanker yang paling umum diderita oleh wanita selain kanker serviks. Penyebab kanker payudara sangat beragam, antara lain kerusakan pada DNA yang menyebabkan mutasi genetik. Kerusakan ini dapat disebabkan oleh radiasi yang berlebihan. Selanjutnya karena kegagalan immune surveillance dalam pencegahan proses malignan pada fase awal, faktor pertumbuhan yang abnormal, dan malfungsi DNA repairs seperti BRCA1, BRCA2, dan p53 (Torosian, 2002).
umumnya kanker muncul baik dari saluran (ducts) maupun kelenjar (glands). Perkembangannya memerlukan waktu berbulan-bulan atau bertahun-tahun sampai tumor tersebut cukup besar untuk dirasakan pada payudara. Deteksi dapat dilakukan dengan mammogram yang kadang-kadang dapat mendeteksi tumor sejak dini (Elwood, et al., 1993).
Peningkatan insidensi kanker payudara disebabkan oleh kegagalan terapi terhadap kanker itu sendiri. Kegagalan ini diakibatkan oleh adanya multidrug resistance (MDR) dan terjadi hingga 71% dibandingkan dengan faktor penyebab lainnya (Mechetner, et al., 1998). Multidrug resistance atau resistensi obat ini diakibatkan oleh adanya breast cancer resistance protein (BCRP) yang salah satunya adalah P-glycoprotein (Pgp) (Imai, et al., 2005). Aktivasi Pgp dan peningkatan ekspresinya dapat menurunkan efikasi dari beberapa agen kemoterapi, seperti Taxol dan Doxorubicin (Mechetner, et al., 1998). Penekanan aktivitas Pgp dan ekspresinya mampu meningkatkan efektivitas agen kemoterapi (Zhou, et al., 2006).
Selain itu, paparan estrogen endogen yang berlebihan juga dapat berkontribusi sebagai penyebab kanker payudara. Sekitar 50% kasus kanker payudara merupakan kanker yang bergantung pada estrogen dan sekitar 30% kasus merupakan kanker yang positif mengekspresi HER-2 berlebihan. Kedua protein tersebut selain berperan dalam metastasis, juga berperan dalam perkembangan kanker payudara (early cancer development) (Gibbs, 2000).
mengatur proliferasi sel. Estrogen dapat memacu ekspresi protein yang berperan dalam siklus sel seperti cyclin D1, CDK4, cyclin E, dan CDK2. Selain itu, aktivasi reseptor estrogen mampu mengaktivasi beberapa onkoprotein yang berperan dalam sinyal pertumbuhan, misalnya Ras, Myc, dan cycD1 (Foster, et al., 2001). Aktivasi protein ini mengakibatkan adanya pertumbuhan yang berlebihan melalui aktivasi onkoprotein yang lain seperti P13K, AKT, Raf, ERK, dan MAP kinase (Hahn, et al.,
2002). Di lain pihak, kompleks estrogen dengan reseptornya juga akan memacu transkripsi beberapa gen tumor suppressor, seperti BRCA1, BRCA2, dan p53. Namun, pada penderita kanker payudara (yang umumnya telah lewat masa menopause), gen tersebut telah mengalami perubahan (transformed) akibat dari hiperproliferasi sel payudara selama perkembangannya sehingga tidak berperan sebagaimana mestinya (Adelmann, et al., 2000, Clarke, 2001; Ingvarsson, et al.,
2002).
Beberapa jenis sel kanker payudara yang dapat dikultur adalah MCF-7, Ia-270, BT-20, BT-474, BT-549, Colo-824, HBL-100, MA-CLS-2, MDA-MB-231, MDA-MB-435S, MDA-MB-436, MB-MDA-468, MX-1, SK-BR-3, ZR-75-1, dan T47D (Pao, et al., 1985; Anonim2
2.2.2.1 Sel T47D
, 2014). Banyaknya jenis sel kanker payudara ini akan memberikan hasil yang berbeda pada setiap selnya. Perbedaan hasil ini akan memberikan peluang baru untuk menyelidiki perkembangan yang terjadi pada resistensi obat pada pasien dengan tumor payudara yang memiliki p53 termutasi (Schafer, et al., 2000).
sehingga resisten terhadap mekanisme apoptosis (Ruddon, 2007; Junedi, et al., 2010). Pada sel ini, p53 mengalami missense mutation pada residu 194 (dalam zinc-binding domain L2) sehingga p53 kehilangan fungsinya. Jika p53 tidak dapat mengikat response element pada DNA, maka akan mengurangi atau menghilangkan kemampuannya dalam meregulasi siklus sel dan memacu apoptosis. Sel ini dapat kehilangan estrogen reseptor (ER) apabila kekurangan estrogen pada jangka waktu lama selama percobaan in vitro. Oleh karena itu, sel ini digunakan pada model untuk penelitian resistensi obat pada pasien dengan tumor payudara yang memiliki p53 termutasi (Abcam, 2007).
Sel T47D sering digunakan dalam penelitian kanker secara in vitro karena mudah penanganannya, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas atau cepat pertumbuhannya, memiliki homogenitas yang tinggi dan mudah diganti sel baru yang telah dibekukan jika terjadi kontaminasi (Abcam, 2007). Sel T47D memiliki mekanisme antiapoptosis dan karsinogenesis lebih kuat daripada sel MCF-7. Beberapa protein yang terlibat dalam stimulasi pertumbuhan sel ini termasuk caspase-3 subunit p12, protein nuklir Hcc-1, G1/S-specific cyclin-D3, cathepsin B,
protein CDV3 homolog, N (G), N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2, dan prohibitin (Aka, et al., 2012).
2.2.3 Sel Vero
diferensiasi sel, sitotoksisitas, dan transformasi sel yang diinduksi oleh berbagai senyawa kimia (Goncalves, et al., 2006).
2.2.4 P-glycoprotein
P-glycoprotein (Pgp) merupakan protein ABC-transporter pada manusia yang termasuk dalam subfamili MDR/TAP (Allen, et al., 2002). Pgp dikenal dalam beberapa sebutan, yaitu ABCD1, ATP-binding cassette sub-family B member 1, MDR1, dan PGY1 (Choi, et al., 2005). ABCD1 atau Pgp termasuk dalam
ATP-dependent efflux pump yang memiliki substrat spesifik, antara lain: obat (colchicine dan tacrolimus), agen kemoterapi (etoposide, adriamycin, dan vinblastine), lipid, steroid, xenobiotik, peptide, bilirubin, cardiac glycoside (digoxin), glucocorticoids (dexamethasone), dan agen terapi HIV tipe 1 (inhibitor protease dan nonnucleoside reverse transcriptase) (Kitagawa, 2006). Di dalam tubuh, Pgp dapat ditemukan pada sel usus, hati, tubula ginjal dan capillary endothelial (Deng, et al., 2001).
agen tersebut terhadap sel kanker. Pada kondisi ekspresi berlebihan, Pgp dapat menyebabkan resistensi obat terutama agen kemoterapi pada jenis kanker payudara seperti doksorubisin (Mechetner, et al., 1998). Pgp akan mengikat doksorubisin sebagai salah satu substratnya untuk dikeluarkan dari dalam sel (Wong, et al., 2006). Pgp atau ABCD1 pertama kali diujikan sebagai multidrug resistance dan terbukti sebagai penyebab resistensi obat kemoterapi (Juliano, et al., 1976). Mekanisme pemompaan oleh Pgp dapat dilihat pada Gambar 2.1.
Pgp memompa senyawa-senyawa (2a, 2b, 2c) yang termasuk substratnya untuk dikeluarkan dari dalam sel. Ekspresi berlebih dari Pgp ini dapat menyebabkan resistensi obat pada terapi kanker payudara (Matheny, et al., 2001).
Gambar 2.1 Mekanisme pemompaan oleh Pgp (Matheny, et al., 2001)
Penghambatan aktivasi dan ekspresi Pgp memegang peranan penting dalam keberhasilan terapi kanker (Zhou, et al., 2006). Penghambatan aktivitas Pgp dapat melalui beberapa mekanisme, antara lain penghambatan substrat Pgp secara langsung dengan berikatan pada Pgp-binding domain dan penghambatan hidrolisis ATP oleh ATPase melalui ikatan substrat dengan ATP. Penghambatan ini dapat dilakukan menggunakan senyawa flavonoid dan polifenol melalui dua sisi ikatan pada
ATP-Membran
sel Sekresi obat
Ekstraselular
binding sites dan steroid interacting region dimana ATPase berikatan dengan Pgp
cytosolic domain (Kitagawa, 2006).
Deng, et al., (2001) melaporkan bahwa aktivasi NF-κB sebagai akibat
adanya stimulus dari lingkungan berupa stress, paparan agen sitotoksik, heat shock, iradiasi, stress genotoksik, inflamasi, paparan sitokin, dan faktor pertumbuhan dapat
meningkatkan ekspresi Pgp. NF-κB yang aktif mampu berikatan dengan promoter
gen MDR1 sehingga proses ekspresi Pgp dapat berjalan. Inaktivasi NF-κB mampu
menghambat ekspresi Pgp.
2.3 Penanganan Kanker
Penanganan kanker ada dua macam, yaitu pencegahan dan penghambatan kanker. Upaya pencegahan kanker disebut kemopreventif. Senyawa kemopreventif dibagi menjadi dua kategori, yaitu blocking agent dan suppressing agent. Blocking agent mencegah karsinogen mencapai target aksinya, baik melalui penghambatan aktivasi metabolisme maupun menghambat interaksi dengan target makromolekul seperti DNA, RNA, atau protein. Sedangkan suppressing agent
menghambat pembentukan malignan dari sel yang telah terinisiasi pada tahap promosi atau progresi (Surh, 1999).
untuk meminimalkan resiko yang mungkin terjadi setelah terapi untuk malignan primer. Upaya penyembuhan (kuratif) kanker, antara lain kemoterapi menggunakan obat-obatan, seperti golongan siklofosfamid, methotreksat, dan 5-flurourasil. Pada dasarnya kinerja obat-obatan tersebut sama, yaitu menghambat proliferasi sel sehingga sel tidak jadi memperbanyak diri. Kemoterapi bisa diberikan secara tunggal ataupun kombinasi dengan harapan bahwa sel-sel yang resisten terhadap obat tertentu juga bisa merespon obat yang lain sehingga bisa diperoleh hasil yang lebih baik. Dampaknya pada pasien biasanya rambut rontok, selera makan menurun, serta rasa lemah dan letih (Sharma, 2000).
Terapi hormon digunakan untuk jenis kanker yang berkaitan dengan hormon, misalnya kanker payudara (berkaitan dengan hormon estrogen) pada wanita dan kanker prostat (berkaitan dengan hormon androgen) pada pria. Terapi hormon pada dasarnya berusaha menghambat sintesis steroid sehingga sel tidak dapat membelah. Terapi ini membawa dampak negatif bila diaplikasikan pada wanita yang masih dalam usia subur karena dapat menghambat siklus menstruasi. Radioterapi menggunakan sinar-X dengan dosis tertentu dapat merusak DNA dan memaksa sel untuk berapoptosis. Efek negatif yang ditimbulkan hampir sama dengan kemoterapi (Sharma, 2000; Wargasetia, 2005).
2.3.1 Penanganan kanker payudara
Upaya penyembuhan kanker payudara dapat digolongkan secara pembedahan, kemoterapi, terapi hormon, radioterapi, dan terapi gen (Jong, 2005; Sharma, 2000; Wargasetia, 2005).
stadium 0 (tumor in situ, sel-sel kanker berada pada tempatnya di dalam jaringan payudara yang normal), stadium 1 (tumor dengan garis tengah kurang dari 2 cm dan belum menyebar keluar payudara), stadium 2A (tumor dengan garis tengah 2-5 cm dan belum menyebar ke kelenjar getah bening, ketiak, atau tumor dengan garis tengah kurang dari 2 cm tetapi sudah menyebar ke kelenjar getah bening ketiak), stadium 2B (tumor dengan garis tengah lebih besar dari 5 cm dan belum menyebar ke kelenjar getah bening ketiak atau tumor dengan garis tengah 2-5 cm tetapi sudah menyebar ke kelenjar getah bening ketiak), stadium 3A (tumor dengan garis tengah kurang dari 5 cm dan sudah menyebar ke kelenjar getah bening ketiak disertai perlengketan satu sama lain atau perlengketan ke struktur lainnya, atau tumor dengan garis tengah lebih dari 5 cm dan sudah menyebar ke kelenjar getah bening ketiak), stadium 3B (tumor telah menyusup keluar payudara, yaitu ke dalam kulit payudara atau ke dinding dada atau telah menyebar ke kelenjar getah bening di dalam dinding dada dan tulang dada), dan terakhir stadium 4 (tumor telah menyebar keluar daerah payudara dan dinding dada, misalnya ke hati, tulang, atau paru-paru) (American Cancer Society, 2014).
yang biasanya diberikan antara lain antrasiklin-cyclophosphamide, taxanes-cyclophosphamide, dan antrasiklin-cyclophosphamide-taxol (Anonim3
2.3.1.1Doksorubisin
, 2014).
Doksorubisin merupakan golongan antibiotik antrasiklin sitotoksik yang diisolasi dari Streptomyces peucetius var. caesius. Doksorubisin telah digunakan secara luas untuk mengobati kanker payudara. Senyawa ini menunjukkan kemampuan yang kuat dalam melawan kanker dan telah digunakan sebagai obat kemoterapi kanker sejak akhir tahun 1960-an (Singal, et al., 1998). Struktur kimia doksorubisin ditunjukkan pada Gambar 2.2.
Gambar 2.2 Struktur kimia doksorubisin
Hodgkin, dan non-Hodgkin baik dalam aplikasi tunggal maupun kombinasi dengan beberapa agen antitumor lainnya (Tyagi, et al., 2004).
Efek samping yang timbul segera setelah pengobatan dengan doksorubisin adalah mual, imunosupresi, dan aritmia yang sifatnya revesibel serta dapat dikontrol dengan obat-obat lain. Efek samping yang paling serius dalam jangka waktu yang lama adalah hepatotoksik (Ekowati, et al., 2013) dan cardiomyopathy yang diikuti dengan gagal jantung (Tyagi, et al., 2004). Berdasarkan hasil penelitian restrospektif, diketahui bahwa toksisitas kardiak akibat pemberian doksorubisin merupakan efek samping yang bergantung pada dosis. Mekanisme yang memperantarai toksisitas kardiak tersebut diduga disebabkan oleh terbentuknya spesies oksigen reaktif, meningkatnya kadar anion superoksida dan pengurasan ATP yang kemudian menyebabkan luka jaringan kardiak (Wattanapitayakul, et al., 2005). Permasalahan yang sering timbul pada penggunaan doksorubisin dalam terapi kanker terutama kanker payudara adalah resistensi obat yang menjadi penyebab kegagalan terapi. Pengeluaran obat yang disebabkan oleh adanya pompa efflux Pgp menjadi salah satu penyebab utama resistensi obat ini (Mechetner, et al., 1998).
Doksorubisin termasuk obat golongan antrasiklin yang merupakan substrat Pgp. Doksorubisin akan dikenali oleh Pgp dan selanjutnya segera dikeluarkan dari dalam sel sehingga menurunkan konsentrasi efektif doksorubisin dalam sel kanker. Mekanisme pemompaan oleh Pgp sangat bergantung pada aktivasi protein tersebut dan penekanan ekspresi Pgp. Oleh karena itu, inaktivasi Pgp dan penekanan ekspresinya mampu mengatasi permasalahan resistensi sel kanker terhadap doksorubisin (Mechetner, et al., 1998; Zhou, et al., 2006; Wong, et al., 2006).
Terapi pengobatan kanker payudara pada umumnya menggunakan terapi kombinasi (ko-kemoterapi) dengan obat/senyawa yang memiliki efek sinergis terhadap sel kanker, bersifat spesifik, dan memiliki efek toksik seminimal mungkin. Terapi kombinasi hingga saat ini dikembangkan secara empiris. Namun sampai saat ini belum ada terapi pengobatan untuk kanker payudara yang telah metastasis. Hal tersebut menuntut pengembangan cara pengobatan baru bagi kanker payudara. Pemanfaatan senyawa alam yang non-toksik dengan efektivitas tinggi melawan kanker dapat menjadi pilihan pengembangan terapi kombinasi dengan agen kemoterapi (Tyagi, et al., 2004). Oleh karena itu, berbagai metode dapat dilakukan untuk mengembangkan dan mengevaluasi kombinasi terapi yang tepat.
2.4 Tanaman yang Bersifat Antikanker
Salah satu upaya mengatasi penyakit kanker ini adalah mengembangkan obat dari tumbuhan yang mengandung senyawa antikanker. Pengembangan obat kanker dari tanaman ini dipandang memiliki beberapa keuntungan, seperti biaya yang lebih murah, mudah didapat, dan efek samping relatif sedikit (Depkes RI, 2008). Beberapa tumbuhan yang telah diteliti memiliki potensi sebagai antikanker dapat dilihat pada Tabel 2.1.
2.4.1 Andaliman
andaliman tersebar kemana-mana dan tumbuh secara liar. Di Sumatera Utara, tanaman ini tumbuh liar pada berbagai tempat, yaitu daerah Angkola, Mandailing, Humbang, Silindung, Dairi, dan Toba Holbung (Parhusip, 2006).
Tabel 2.1 Beberapa tumbuhan yang berpotensi sebagai antikanker
NO Tumbuhan Sel Kanker Bagian yang
klorofrom Paru-paru C
9 MDA-MB-231 Asam linoleat Payudara D
10 Buah lada MDA-MB-231 Ekstrak etanol Payudara E
11 Sambang
colok MCF-7 Ekstrak etanol Payudara
Memiliki efek
Payudara Memiliki efek
D = Hasanzadeh, et al., 2011 K = Furqan, 2014 E = Hirokawa, et al. 2006 L = Yanti, 2014
F = Untung, et al., 2008 M = Aulianshah, et al., 2014 G = Meiyanto, et al., 2009 N = Arisanty, 2013
Sistematika tumbuhan andaliman menurut Sharma (1993) sebagai berikut: Divisi : Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Anak kelas : Dialypetalae Bangsa : Geraniales Suku : Rutaceae Marga : Zanthoxylum
Jenis : Zanthoxylum acanthopodium DC.
Nama asing andaliman adalah yan-jiao (Cina), mouh laaht faa jiu (Cina Kanton),
mao la hua jiao (Cina Mandarin), indonesian lemon pepper (Inggris), indonesischer zitronenpfeffer (Jerman), tambhul (India), sansho (Jepang), dan emmay/yerma (Tibet) (Anonim, 2012).
masing-masing bebas dan kemudian tumbuh menjadi buah tetapi berkumpul pada satu tangkai. Daunnya merupakan daun majemuk dengan panjang 2-25 cm, anak daun 1-6 pasang dengan tangkai yang pendek, tepi daun bergerigi, ujung daun runcing, warna daun hijau dan permukaan atas daun lebih tua dibanding permukaan bawah daun. Panjang bunganya 3 mm. Tumbuhan ini berkembang biak dengan biji. Sistem akar tunggang dimana akar lembaga tumbuh terus menjadi akar pokok yang bercabang-cabang menjadi akar-akar yang lebih kecil dan sedikit berbulu halus di seluruh permukaannya (Parhusip, 2006).
Buah andaliman mengandung senyawa alkaloid, fenol hidrokuinon, flavonoid, steroid/triterpenoid, tannin, glikosida, dan minyak atsiri (Parhusip, 2006). Buah andaliman memiliki aktivitas fisiologi sebagai antioksidan dan antimikroba (Wijaya, 2000; Soedarmadji, et al., 2004).
Secara tradisional, buah andaliman banyak digunakan sebagai bahan aromatik, tonik, perangsang nafsu makan, obat sakit perut, serta diare. Masyarakat India menggunakan buah andaliman untuk mengobati kelumpuhan dan berbagai macam penyakit kulit, seperti bisul dan kusta. Buah andaliman juga digunakan sebagai bumbu masak di Sumatera Utara, khususnya Tapanuli Utara (Suryanto, et al., 2004;
2.4.2 Pengujian sifat antikanker dari berbagai tanaman obat Hynniewta, et al., 2008; Sirait, dkk., 1991).
uji in vitro dapat digunakan sebagai uji praklinik awal untuk menggambarkan interaksi kombinasi, sehingga ketika dilakukan uji in vitro hasilnya akan lebih efisien.
2.4.2.1 Metode pemisahan ekstraksi
Ekstrak aktif dari tanaman yang akan dilakukan penelitian terlebih dahulu dilakukan pemisahan ekstraksi. Metode pemisahan ekstraksi dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu maserasi, perkolasi, reflux, digesti, sokletasi, infundansi, dan dekoktasi. Maserasi adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan pelarut melalui beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (Depkes RI, 1986). Maserasi dapat dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok ke dalam sebuah bejana kemudian dituangi 75 bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk. Setelah 5 hari, sari diserkai, ampas diperas dan dicuci dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Sari dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari. Lalu dienaptuangkan dan disaring (Depkes RI, 1979).
Sokletasi adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan pelarut yang selalu baru, umumnya dilakukan dengan alat khusus (menggunakan alat soklet) sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Infundasi adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur pemanasan air (bejana infus di atas penangas air mendidih), temperatur terukur (90 – 98°C) selama waktu tertentu (15 – 20 menit). Dekoktasi adalah ekstraksi dengan metode infus yang dilakukan selama 30 menit dengan temperatur titik didih air (Depkes RI, 2000).
2.4.2.2Metode pengujian aktivitas antikanker
Pengujian aktivitas antikanker dapat dilakukan dari beberapa parameter, antara lain uji sitotoksik, indeks selektivitas, analisis isobologram, combination index
Formazan merupakan zat berwarna ungu yang tidak larut dalam air sehingga dilarutkan menggunakan HCl 0,04 N dalam isopropanol atau 10% SDS dalam HCl 0,01 N. Intensitas warna ungu terbentuk dapat ditetapkan dengan spektrofotometri dan berkorelasi langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme, sehingga berkorelasi dengan viabilitas sel. Persentase viabilitas dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut (Kupcik, et al., 2001).
Gambar 2.3 Reduksi MTT menjadi formazan (Kupcsik, et al., 2011) absorbansi sampel
% Viabilitas = x 100 %
absorbansi kontrol
Nilai indeks selektivitas diperoleh dengan menggunakan sel yang berasal dari ginjal monyet hijau afrika (sel Vero) menggunakan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Indeks selektivitas diperoleh dari rasio IC50 sel
Vero sel dibandingkan dengan sel kanker yang diuji. Nilai lebih tinggi dari 3 menunjukkan bahwa obat atau ekstrak memiliki selektivitas yang tinggi (Weerapreeyakul, et al., 2012). Indeks selektivitas dihitung menggunakan persamaan di bawah ini:
IC50 sel Vero
Indeks selektivitas =
Metode yang umum digunakan untuk mengevaluasi kombinasi obat adalah isobologram dan Combination Index (CI).
CI= (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2
Keterangan:
Dx : konsentrasi satu senyawa tunggal yang dibutuhkan untuk memberikan efek sebesar efek kombinasi, yaitu IC50 terhadap pertumbuhan sel kanker payudara
(D)1 dan (D)2 : besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan
efek yang sama.
Combination Index (CI) yang diperoleh diinterpretasikan seperti pada Tabel 2.2. Tabel 2.2 Interpretasi nilai CI (Combination Index)
Sumber: Reynolds, et al., (2005)
Pengujian siklus sel dan apoptosis menggunakan metode flow cytometry.
Flow cytometry adalah teknik yang digunakan untuk menghitung dan menganalisis partikel mikroskopis yang tersuspensi dalam aliran fluida (Sayed, et al., 2009). Prinsip dasar dari metode ini adalah berdasarkan fluoresensi. Suspensi sel atau partikel yang hendak dianalisa disedot atau dialirkan. Aliran dikelilingi oleh fluida yang sempit, sel akan melewati satu demi satu melalui sinar laser terfokus. Sinar laser akan menyerang sel tersebut. Sel yang sesuai dengan cahaya laser dan panjang gelombang yang tepat dapat dipancarkan kembali sebagai fluoresensi jika sel mengandung zat alami fluorescent satu atau lebih fluorochrome-label antibodi melekat pada permukaan atau struktur internal sel. Penyerapan cahaya tergantung
CI Interpretasi CI Interpretasi <0,1 sinergis sangat kuat
0,1–0,3 sinergis kuat 0,3–0,7 sinergis
0,7–0,9 sinergis ringan-sedang
0,9–1,1 mendekati additif 1,1–1,45 antagonis ringan-sedang 1,45–3,3 antagonis
oleh serangkaian dioda. Filter optik berfungsi untuk memblokir cahaya yang tidak diinginkan. Hasil data disimpan melalui komputer (Ulfah, 2010). Flow cytometry
dapat digunakan untuk menganalisa DNA content sel melalui pewarnaan sel dengan pewarna propidium iodide (PI) atau 4’,6’-diamino-2-phenylindole (DAPI). Dengan adanya fluorochrome yang memiliki kemampuan berinterkalasi dengan basa untai DNA seperti propidium iodide, maka tiap sel yang memiliki jumlah set kromosom yang berbeda akan memberikan intensitas fluoresensi yang berbeda. Semakin banyak set kromosom maka intensitas fluoresensi akan semakin besar. Untuk pengujian apoptosis, ditambahkan antibodi Annexin V dan propidium iodida, sedangkan pengujian siklus sel ditambahkan antibodi propidium iodida. Lalu diukur dengan alat
flow cytometer (Hostanska, et al., 2004). Flow cytometer atau FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) digunakan untuk membaca intensitas fluoresensi tiap sel (Givan, 2001). Skema alat flow cytometer ditunjukkan oleh Gambar 2.4.
Gambar 2.4 Skema alat flow cytometer
Pewarnaan
Sel kultur
Sel yang telah disuspensikan
Penambahan antibodi
Laser
Sel dihomogenkan
Penetapan
Ampas
Imunositokimia merupakan suatu metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spesifik atau antigen dalam sel dengan menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen. Ada dua jenis metode imunositokimia, yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Pada metode langsung, antibodi yang mengikat fluoresen atau zat warna langsung berikatan dengan antigen pada sel. Sedangkan pada metode tidak langsung, antigen diikatkan pada antibodi primer secara langsung kemudian ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer. Selanjutnya ditambahkan substrat kromogen yang akan diubah oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna (pigmen) yang akan mewarnai sel. Untuk menjamin antibodi agar dapat mengikat antigen, sel harus difiksasi dengan ditempelkan pada bahan pendukung padat sehingga antigen akan immobile. Hal ini dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan sel pada slide mikroskop,
