PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM
SEL EUKARIOT
OLEH
SHABARNI GAFFAR, M.Si.
NIP: 132 313 560
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PRODUKSI PROTEIN HETEROLOG DALAM
SEL EUKARIOT
OLEH
SHABARNI GAFFAR, M.Si.
NIP: 132 313 560
Bandung, September 2007
Mengatahui : Ketua Jurusan Kimia, FMIPA
Universitas Padjadjaran
Dr. Unang Supratman
DAFTAR GAMBAR
Beberapa contoh O-link dan N-link oligosakarida pada ragi (A), serangga (B) dan mamalia (C)... Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan vektor YIp... Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen Cu/Zn-SOD manusia di kloning diantara promotor dan
terminator gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase
(GAPDp) ragi... Vektor integrasi untuk P. pastoris...
Peta vektor pPICZ/pPICZα... Peta vektor pGAPZ/pGAPZα... Autographa californica multiple nuclear polyhidrosis
DAFTAR TABEL
Tabel 1.
Tabel 2.
Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae...
Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P. Pastoris...
4
Produksi Protein Heterolog Dalam Sel Eukariot
1. Pendahuluan
Sistem ekspresi prokariot biasanya digunakan untuk memproduksi protein heterolog (rekombinan) dari cDNA eukariot yang dikloning. Akan tetapi, pada beberapa penelitian, protein yang disintesis oleh bakteri tersebut tidak stabil atau tidak punya aktifitas biologi. Selain itu, meskipun kita menggunakan prosedur pemurnian protein yang sangat hati-hati, senyawa yang bersifat toksin pada bakteri dan senyawa yang menyebabkan kenaikan temperatur tubuh manusia dan binatang (pyrogen) mungkin dapat mengkontaminasi produk.
Untuk mengatasi masalah ini beberapa peneliti telah mengembangkan sistem ekspresi protein eukariot, yaitu ragi, serangga atau sel mamalia untuk memproduksi protein-protein terapetik yang tidak terkontaminasi, sehingga dapat digunakan oleh manusia atau binatang dengan jumlah yang banyak dan stabil; aktif secara biologi untuk studi biokimia, biofisik, dan struktur; dan protein yang digunakan untuk proses industri. Selanjutnya, protein manusia yang ditujukan untuk penggunaan medis harus identik sifatnya dengan protein natif.
Ketidakmampuan prokariot untuk memproduksi versi autentik dari protein eukariot, pada umumnya disebabkan oleh pelipatan protein yang tidak tepat dan tidak adanya mekanisme modifikasi pasca translasi. Pada eukariot terdapat enzim Protein Disulfida Isomerase (PDI) yang mengkatalisis pembentukan ikatan disulfida pada protein. Pembentukan ikatan disulfida yang menyimpang akan merubah konfigurasi protein, sehingga menyebabkan protein tidak stabil dan kehilangan aktifitas.
merupakan modifikasi utama yang memberikan stabilitas dan sifat pengikatan yang khusus terhadap protein. Glikosilasi yang umum terjadi adalah pengikatan gula spesifik ke gugus hidroksil dari asam amino serin atau asparagin (O-linked glicosylation), dan gugus amida dari asparagin (N-linked glycosylation) (gambar 1). Sekitar 30% protein mamalia mengalami
glikosilasi.
Gambar 1. Beberapa contoh O-link dan N-link oligosakarida pada ragi (A), serangga (B) dan mamalia (C). T adalah threonin, S adalah serin, N adalah asparagin dan X asam sembarang asam amino. Monosakarida/oligosakarida yang berbeda.dilambangkan oleh bentuk yang berbeda.
penelitian atau proses industri. Sistem ekspresi eukariot yang berbeda harus dicoba untuk menentukan sistem mana yang dapat mensintesis protein rekombinan yang fungsional dan dalam jumlah besar. Pemilihan vektor ekspresi tergantung pada kualitas protein rekombinan yang akan diproduksi, penggunaannya, dan biaya produksi dan purifikasi juga penting untuk dipertimbangkan.
Pada prinsipnya vektor ekspresi eukariot tidak berbeda dengan vektor ekspresi prokariot. Vektor ekspresi eukariot memiliki promotor eukariot yang menjalankan transkripsi gen yang dikloning, signal terminasi transkripsi dan translasi, urutan yang dapat menyebabkan mRNA mengalami poliadenilasi, dan gen penanda untuk menyeleksi klon yang positif. Karena prosedur DNA rekombinan secara teknik sulit untuk dilakukan menggunakan sel eukariot, kebanyakan vektor eukariot merupakan suttle vector dengan dua origin of replication (ORI) dan gen penanda seleksi. Salah satunya berfungsi di E. Coli dan yang lain berfungsi di sel inang eukariot. Jika vektor ekspresi eukariot akan digunakan sebagai plasmid, maka vektor itu harus mempunyai ORI eukariot. Alternatif lain, jika vektor itu didisain untuk integrasi ke kromosom, maka harus mempunyai urutan yang komplemen dengan urutan pada inang untuk memfalisitasi insersi ke kromosom.
2. Sistem Ekspresi Saccaromyces cerevisiae.
Saccaromyces cerevisiae telah digunakan sebagai inang untuk ekspresi gen
eukariot dengan alasan-alasan sebagai berikut:
1. Ber-sel tunggal dan sudah dipelajari secara genetik maupun fisiologi. 2. Beberapa promotor gen yang kuat telah diisolasi dari ragi ini dan
4. Ragi ini biasanya mensekresikan beberapa protein. Jadi apabila protein heterolog direkayasa untuk dibebaskan secara ekstraselular, maka produk dapat segera di purifikasi.
5. Karena sudah bertahun-tahun digunakan pada industri makanan, S.
cerevisiae sudah didaftarkan oleh U.S Food and Drug Administration sebagai organisme “generally recognize as safe” (GRAS).
Oleh karena itu penggunakan organisme ini untuk produksi agen terapetik manusia (drug or pharmaceuticals) tidak membutuhkan penelitian secara ekstensif seperti yang diwajibkan untuk inang yang belum terjamin keamanannya. Dewasa ini terdapat sejumlah protein yang telah diproduksi di S. cerevisiae, dan digunakan secara komersial sebagai vaksin, agen terapeutik, dan untuk diagnosa (table 1). Sebagai contoh lebih dari 50% suplai insulin dunia diproduksi oleh S. cerevisiae.
Tabel 1
Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae.
Protein rekombinan Kegunaan
Antigen permukaan virus hepatitis B Protein circumsporozoide malaria Envelope protein HIV-1
Vaksin
Protein virus hepatitis C
Antigen HIV-1 diagnostik
Faktor pertumbuhan epidermal
faktor koagulasi darah XIIIa hirudin
human growth factor human serum albumin
2.1. Vektor untuk S. cerevisiae
Terdapat tiga kelas utama vektor ekspresi untuk S. cerevisiae: episom atau plasmid, yaitu vektor Yeast Episomal plasmid [YEps], vektor integrasi (Yeast Integrating plasmid [Yips] dan Yeast Artificial kromosom [YACs]. Vektor-vektor ini telah digunakan secara ekstensif untuk memproduksi protein heterolog intra atau ekstraselular.
Vektor YEp direkayasa dari plasmid 2µm dengan jumlah copy tinggi. Seleksi berdasarkan pada mutan strain inang yang membutuhkan asam amino tertentu (histidin, triptofan atau leusin) atau nukleotida urasil untuk pertumbuhan. Strain ini disebut bersifat auxotrof karena medium pertumbuhan harus diberi suplemen dengan nutrient spesifik. Dalam prakteknya vektor ini dilengkapi dengan versi gen wild type yang menjadi komplemen dari gen yang dimutasi di sel inang. Sebagai contoh, bila plasmid YEp dengan gen LEU2 wild type, ditransformasi ke sel inang mutan leu2 dan kemudian ditumbuhkan pada media yang tidak ada penambahan
leusin, maka hanya sel yang membawa plasmid yang akan tumbuh.
Sejumlah promotor dari gen S. cerevisiae sudah diambil untuk efisiensi rekayasa transkripsi gen heterolog dalam vektor ragi. Pada umumnya vektor-vektor ini dapat diregulasi dengan ketat. Promotor yang dapat diinduksi lebih disukai untuk produksi sejumlah besar protein rekombinan selama pertumbuhan skala besar. Dalam kasus ini promotor yang diregulasi oleh galaktosa, merespon sangat cepat penambahan galaktosa, yang menaikkan efisiensi transkripsi sampai 1000x. Promotor yang dapat direpresi, konstitutif dan promotor hibrida yang menggabungkan sifat promotor yang berbeda juga tersedia. Tingkat ekspresi maksimal tergantung pada efisiensi terminasi transkripsi. Pada umumnya untuk vektor YEp urutan terminator dan promotor diambil dari gen yang sama.
memfasilitasi perjalanan protein rekombinan melewati membran sel dan pelepasan protein ke luar sel. Alasan utama modifikasi ini adalah lebih mudahnya memurnikan protein yang disekresikan dibandingkan protein yang terdapat dalam lisat sel. Urutan pengenal yang umum untuk S. cerevisiae diambil dari gen α mating factor. Urutan pengenal sintetik juga
sudah dirancang untuk menaikkan jumlah sekresi protein. Urutan lain yang menstabilkan protein rekombinan, mencegah degradasi proteolisis, dan menyediakan urutan asam amino spesifik (affinity tag) yang digunakan untuk purifikasi secara selektif, dapat digabungkan ke urutan pengode gen heterolog. Asam amino tambahan ini dilengkapi oleh sisi pemotongan protease sehingga bisa dipotong dari protein rekombinan setelah dimurnikan.
Gambar 2. Skema yang menggambarkan integrasi DNA dengan vektor YIp. Gen marker seleksi (LEU2) dan gen yang diinsersi (GOI) diinsersikan ke vektor diantara dua segmen yang merupakan ujung gen nonesensial ragi (A1 dan A2). Urutan ini mengalami rekombinasi dengan kromosom sehingga GOI dan LEU2 terintegrasi ke kromosom.
Beberapa pendekatan sedang dilakukan untuk menaikkan jumlah gen heterolog yang terintegrasi melalui penentuan urutan DNA yang berulang. Kira-kira terdapat 200 copy urutan DNA untuk RNA ribosom (rRNA) dan sekitar 400 copy urutan δ pada genom S. cerevisiae. Urutan δ merupakan bagian dari DNA yang non esensial, yang diambil dari retrotransposon. Retrotransposon merupakan urutan DNA kromosom yang ditranskripsi. Molekul RNA ini berperan sebagai templat untuk reverse transcriptase, dan urutan DNA yang disalinnya mengalami integrasi ke kromosom pada sisi yang berbeda. Pada studi awal, 10 copy gen yang diinsersikan ke urutan δ memproduksi sejumlah rekombinan protein.
kromosom dalam sel inang. Sistem YAC sangat stabil dan sudah digunakan untuk pemetaan fisik genom manusia, analisis unit transkripsi yang besar dan pembentukan perpustakaan genom yang mengandung DNA dari kromosom manusia. Vektor YAC menyerupai kromosom karena mempunyai urutan yang berperan sebagai ORI (autonomous replicating sequence), urutan centromer ragi dan urutan yang muncul pada dua sisi
setelah linearisasi DNA yang berfungsi sebagai telomer kromosom untuk mempertahankan kestabilan kromosom. (gambar 2). Dalam beberapa kasus, input DNA diklon ke sisi yang merusak gen marker yeast. Tanpa adanya produk gen ini, respon kolorimetri bisa diamati bila sel penerima ditumbuhkan pada medium khusus. Beberapa vector YAC mengandung gen marker penanda seleksi yang terpisah dari sisi cloning. YAC tidak pernah digunakan sebagai system ekspresi untuk produksi protein heterolog komersial walaupun punya potensi untuk produksi sejumlah besar protein tunggal dari gen yang punya jumlah copy banyak atau protein heterolog dengan subunit berbeda.
2.2. Produksi protein heterolog intraselular dalam S. cerevisiae
setelah kehilangan darah selama proses operasi. Untuk mencegah hal ini, dokter berspekulasi bahwa Cu/Zn-SOD dapat dimasukkan ke organ yang sedang mengalami reperfusi. Cu/Zn-SOD mungkin bisa bertindak sebagai agen terapi terhadap penyakit-penyakit inflamasi seperti osteoarthritis, rheumathoid arthritis scleroderma dan ankylosing spondylitis. Untuk penggunaan ini bentuk natif dari Cu/Zn-SOD lebih disukai untuk mencegah respon immunologi yang merugikan yang mungkin dihasilkan dari penggunaan enzim dari spesies lain.
Gambar 3. Vektor ekspresi S. cerevisiae. cDNA untuk gen Cu/Zn-SOD manusia di kloning diantara promotor dan terminator gen gliseraldehid fosfat dehidrogenase (GAPDp) ragi.
2.3. Sekresi protein heterolog oleh S. cerevisiae
Semua protein yang mengalami glikosilasi pada S. cerevisiae, disekresikan ke luar sel. Protein ini harus mempunyai urutan pemula supaya bisa melewati sistem sekresi. Konsekuensinya urutan pengode dari protein rekombinan yang membutuhkan gula O-linked atau N-linked untuk aktifitas biologi harus dilengkapi dengan urutan pemula. Biasanya urutan pemula dari gen yeast mating factor type α (prepro-α-factor) diinsersikan pada bagian depan cDNA gen yang akan di ekspresikan. Dengan kondisi ini, pembentukan ikatan disulfida yang tepat, pemotongan proteolitik dari urutan pemula, dan modifikasi pascatranslasi yang tepat sering terjadi, dan protein rekombinan yang aktif akan disekresikan. Selama proses ini peptida pemula dibuang oleh endopeptidase yang mengenali dipeptida Lys-Arg. Kodon Lys-Arg harus ditempatkan berdekatan dengan N terminal cDNA, sehingga setelah peptida pemula dibuang, protein rekombinan akan memperoleh residu asam amino yang benar pada posisi N terminal.
selama proses sekresi, sehingga PDI mungkin meningkatkan pelepasan protein rekombinan, terutama yang memiliki ikatan disulfida. Untuk memeriksa hipotesa ini, urutan promotor dan terminator transkripsi gliseraldehid fosfat dehidrogenase yang konstitutif ditempatkan pada ujung gen PDI ragi yang dikloning dalam vektor YIp, dan diintegrasikan ke kromosom. Strain transforman menunjukkan peningkatan produksi PDI 16x dibandingkan dengan strain wild type. Bila sel yang meng-overproduksi PDI ini ditransformasi dengan vektor YEp yang membawa gen platelet-growth factor B manusia, terdapat peningkatan sekresi proten rekombinan 10x lebih
tinggi dibandingkan dengan sel yang mempunyai level PDI normal. Sehingga overproduksi PDI secara spesifik meningkatkan sekresi protein dengan pembentukan ikatan disulfida.
3. Sistem ekspresi Pichia pastoris.
Ekspresi protein rekombinan dalam S. cerevisiae telah berhasil digunakan untuk ekspresi berbagai protein dari sumber yang berbeda. Namun dalam beberapa kasus level ekspresinya rendah. Pada contoh lain protein rekombinan mengalami hiperglikosilasi dengan lebih dari 100 residu manosa pada rantai samping N-linked oligosakarida. Kelebihan manosa ini sering merubah fungsi protein dan menghasilkan protein rekombinan yang bersifat antigen. Selain itu protein yang dirancang untuk sekresi pada S. cerevisiae sering tertahan pada membran periplasma, sehingga menambah
biaya dan waktu untuk pemurnian. Selanjutnya, bila densitas sel tinggi maka S. cerevisiae akan memproduksi etanol, yang merupakan racun bagi sel.
Sebagai konsekuensinya menurunkan jumlah protein yang disekresikan. Untuk alasan ini beberapa peneliti mencoba spesies ragi yang lain dan sel eukariot yang dapat berperan sebagai sel inang yang efektif untuk produksi protein rekombinan.
modifikasi pascatranslasi, serta mudah dimanipulasi seperti E. coli dan S. cerevisieae. Penggunaannya juga mudah, mudah, cepat dan mengekspresikan
protein dengan level tinggi.
P. pastoris merupakan ragi metilotropik yang memiliki beberapa
keunggulan dibandingkan dengan S. cerevisiae, yaitu:
1. P. pastoris memiliki promotor yang diregulasi dengan ketat, yaitu promotor gen AOX1 yang mengkode enzim alkohol oksidase yang dapat diinduksi oleh metanol. Apabila ada metanol, 30% dari protein selular adalah alkohol oksidase. Sedangkan bila tidak ada metanol, gen AOX1 tidak bekerja. Selanjutnya promotor gen AOX1 dengan cepat merespons penambahan metanol ke medium. Dengan kata lain, promotor AOX1 merupakan kandidat yang baik untuk menjalankan transkripsi gen yang dikloning dan memproduksi protein rekombinan dalam jumlah besar;
2. Tingkat sekresi protein rekombinan pada P. pastoris tinggi, hal ini disebabkan oleh konsentrasi sel yang tinggi dan tidak dihasilkannya etanol yang merupakan racun bagi sel; dan
3. P. pastoris biasanya mensekresikan sangat sedikit proteinnya sendiri,
sehingga memudahkan pemurnian protein rekombinan yang disekresikan.
Vektor ekspresi P. pastoris pada umumnya memiliki format yang sama. Gen yang diekspresi berada dibawah kontrol promotor dan urutan terminator transkripsi dari gen AOX1 P. pastoris , ORI dan gen marker seleksi dari E. Coli dan gen marker seleksi dari ragi (gambar 4). Selain itu juga terdapat penambahan urutan signal dari gen fosfatase PHO1 P. pastoris atau gen dari ragi lain yang memfasilitasi sekresi protein rekombinan. Vektor P. pastoris pada umumnya dirancang sebagai plasmid integrasi untuk
spesifik melalui proses rekombinasi homolog antara DNA pada vektor dengan daerah yang homolog pada genom P. pastoris.
Gambar 4. Vektor integrasi untuk P. pastoris. Gen yang dikloning (GOI) diinsersikan diantara promotor dan terminator gen alkohol oksidase (AOX1).
Kemampuan P. pastoris mensekresikan protein tertentu dengan tingkat sekresi tinggi tidak terlepas dari kemampuan ragi tersebut melakukan metabolisme terhadap alkohol. Metabolisme yang dimaksud adalah oksidasi metanol menjadi formaldehid dengan menggunakan molekul oksigen oleh alkohol oksidase. Salah satu produk samping dari oksidasi metanol adalah hidrogen peroksida (H2O2). Untuk mencegah sifat racun dari H2O2, maka metabolisme metanol ini dilakukan disebuah organel sel khusus yang disebut dengan peroksisom. Karena alkohol oksidase memiliki afinitas yang sangat rendah terhadap oksigen, maka kompensasi P. pastoris adalah dengan cara mensekresi protein dengan jumlah sangat
banyak (Invitrogen, 2004).
Sistem ekpresi P. pastoris telah digunakan untuk memproduksi lebih dari 100 protein aktif dari bakteri, jamur, invertebrata, tumbuh-tumbuhan, dan mamalia, termasuk manusia (Tabel 2). Protein-protein rekombinan ini, seperti antigen permukaan hepatitis B, serum albumin manusia, dan bovine lysozyme, memiliki sifat identik dengan protein natifnya.
penggunaan kodon dari gen yang diekspresikan, (2) jumlah gen yang digunakan, (3) efisiensi dan kekuatan promoter, (4) efisiensi sinyal translasi, (5) jenis peptida sinyal, (6) proses dan pelipatan di dalam retikulum endoplasma dan badan Golgi, (7) faktor lingkungan dalam sekresi ekstraseluler, dan (8) hidrolisis protein oleh protease. Berdasarkan pertimbangan di atas, peptida sinyal dan proses pelipatan protein menjadi perhatian utama dalam peningkatan sekresi protein. Untuk menyelesaikan permasalahan di atas, beberapa penelitian dengan menggunakan teknik manipulasi genetik telah berhasil meningkatkan tingkat sekresi dari protein dalam P. pastoris.
3.1. Vektor ekspresi untuk P. pastoris.
Vektor pPICZ dan pPICZα merupakan vektor dengan tingkat ekspresi tinggi. Keduanya membawa marker Zeosin, sehingga seleksi dapat dilakukan secara langsung dan multi-copy integran dapat diketahui langsung tanpa menggunakan banyak medium. Zeosin juga dapat digunakan untuk E. coli, sehingga mengurangi penggunaan antibiotik lain dan mengurangi ukuran vektor (Gambar 5).
Kedua vektor ini memiliki: (1) promotor AOX1, untuk mengekspresikan protein dengan level tinggi yang diinduksi oleh metanol. (2) C-terminal c-myc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk memudahkan deteksi dan purifikasi protein. (3) gen 5’ AOX1 yang berfungsi
untuk menargetkan integrasi ke genom P. pastoris. pPICZα juga mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium.
Vektor pGAPZ dan pGAPZα dapat mengekspresikan protein tanpa menggunakan metanol. Vektor ini lebih disukai untuk ekspresi skala besar. Vektor ini memiliki promotor GAP untuk mengekspresikan protein dengan level tinggi, gen resistan Zeosin untuk seleksi langsung, dan C-terminal c-myc epitope dan urutan polihistidin (6xHis) untuk memudahkan deteksi dan
purifikasi protein. pGAPα juga mengandung signal sekresi a-faktor, yang berfungsi untuk menargetkan protein rekombinan ke medium (Gambar 6).
3.2. Integrasi multicopy.
Beberapa vektor ekspresi untuk Pichia yang tersedia dapat meningkatkan jumlah copy gen dalam P. Pastoris. Sehingga protein akan diekspresikan lebih tinggi. Vektor pPIC3.5K dan pIC9K membawa gen resistan kanamycin, sehingga seleksi transforman yang membawa multi copy vektor terintegrasi dapat dilakukan. Multi insersi dapat diidentifikasi melalui peningkatan resistensi terhadap Geneticin.
Tabel 2
Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi P. pastoris Protein rekombinan Tingkat ekspresi (mg/L)
Protein bakteri:
Toksin tetanus fragmen C a-amilase
T2A peroksidase
Fragmen neurotoxin C. botulinum
12000
Wheat lipid transfer protein
22000 720 60 Protein mamalia:
Mouse gelatin
Human tumor necrosis factor Human IGF-1
4. Sistem ekspresi ragi yang lain
berurutan pada vektor ekspresi. Secara kebetulan terjadi integrasi dan setelah 40 generasi dihasilkan hemoglobin A fungsional yang memiliki tetramer yang tepat yaitu dua rantai globin dan dua rantai globin .
Sejumlah spesies jamur Aspergillus juga telah digunakan secara ekstensif untuk produksi enzim komersial, seperti -amilase, lipase, amyloglukosidase, katalase, dan selulase untuk industri makanan dan kertas. Jamur ini mensekresikan sejumlah besar natif protein, tumbuh dengan cepat pada medium yang tidak mahal, memproses mRNA eukariot dan melakukan modifiksi pasca translasi. Beberapa vektor telah dicocokkan dengan elemen pengontrol trankripsi dan translasi jamur, untuk ekspresi protein rekombinan. Chymosin manusia, laktoferin tikus, interleukin-6 manusia, xantin oksidase Drosophilla dan protein lain telah berhasil diproduksi pada sel inang jamur.
Sebagai kesimpulan sistem ekspresi ragi telah memberikan peranan yang penting dalam memproduksi protein rekombinan untuk kepentingan penelitian, industri, dan aplikasi medik. Bagaimanapun, pengalaman telah menunjukkan bahwa tidak ada satu sistempun yang dapat memproduksi versi autentik dari protein heterolog, sehingga sistem ekspresi yang menggunakan insek atau sel mamalia juga dikembangkan.
5. Sistem ekspresi Baculovirus untuk sel serangga
jumlah besar. Sintesis polyhedrin dimulai sekitar 36-48 jam setelah infeksi dan berlanjut selama 4-5 hari, sampai infeksi selesai dan sel inang mati.
Gambar 7. Autographa californica multiple nuclear polyhidrosis virus. (A) single nucleocapsid (partikel virus) dikeluarkan dari sel yang terinfeksi. (B) kluster dari nucleocapsid (virion) yang terperangkap dalam matriks protein.
Promotor untuk gen polyhedrin (polyh) sangat kuat, dan tidak dibutuhkan untuk produksi virus. Sehingga penggantian daerah pengkode polyhedrin dengan protein heterolog dan diikuti dengan infeksi sel serangga, akan menghasilkan produksi sejumlah besar protein heterolog. Selanjutnya, karena kesamaan sistem modifikasi pascatranslasi antara serangga dan mamalia, maka protein rekombinan yang dihasilkan akan sangat mirip dengan bentuk aslinya.
5.1. Vektor sistem ekspresi Baculovirus
Langkah pertama dalam produksi rekombinan AcMNPV adalah merancang vektor transfer. Transfer vektor merupakan plasmid E. coli-based yang membawa segmen DNA dari AcMNPV yang mengandung promotor polyhedrin dan sebagian segmen upstream DNA AcMNPV, multiple cloning site, terminator polihedrin dan daerah signal poliadenilasi, serta sebagian
segmen downstream DNA AcMNPV. Daerah pengkode untuk gen polyhedrin telah di delesi. Segmen upstream dan downstream AcMNPV menyediakan daerah untuk rekombinasi homolog dengan AcMNPV. Gen yang diinginkan di klon diantara promotor dan terminator polyhedrin dan kemudian dipropagasi ke E. coli (Gambar 8).
Kemudian sel serangga dalam kultur di ko-transfeksi dengan DNA AcMNPV dan vektor transfer yang membawa gen yang diklon. Selama proses transfeksi, terjadi peristiwa double crossover dan gen yang diklon dengan promotor dan terminator polyhedrin terintegrasi ke DNA AcMNPV. Virion yang tidak memiliki gen polyhedrin menghasilkan zona yang berbeda pada lisis sel (plak negatif) yang merupakan rekombinan Baculovirus.
medium ditambahkan substrat untuk β-galaktosidase. Penambahan siklus infeksi terhadap plak negatif akan meningkatkan konsentrasi virus rekombinan. Protein heterolog dipanen 4 sampai 5 hari setelah sel serangga terinfeksi. Sistem ekspresi baculovirus ini telah digunakan untuk memproduksi lebih dari 500 protein heterolog.
5.2. Peningkatan hasil rekombinan baculovirus.
Linearisasi dari genom AcMNPV sebelum transfeksi ke sel serangga, meningkatkan frekuensi plak rekombinan. Prosedur sederhana ini menurunkan jumlah plak non-rekombinan, karena linearisasi genom baculovirus mengurangi ketidak efektifan dan double crossover antara DNA AcMNPV linear dengan vektor transfer sirkular. Untuk menjamin proses linearisasi terjadi secara konsisten, sisi restriksi Bsu31 telah diinsersikan kedalam gen polyhedrin dari genom AcMNPV wild type. Pada kondisi ini sekitar 30% plak mengandung baculovirus rekombinan.
5.3. Konstruksi suttle vektor Baculovirus E.coli-sel serangga.
memproduksi baculovirus. Shuttle vektor baculovirus E. coli-sel serangga ini disebut bacmid.
Gambar 9. Konstruksi bacmid rekombinan. Plasmid E. Coli digabungkan ke genom AcMNPV dengan cara double crossover antara segmen DNA (5’ dan 3’) yang mengapit gen polyhedrin untuk membentuk suttle vektor yang dapat bereplikasi di E. Coli dan di sel serangga.
Dalam prakteknya hampir semua sistem ekspresi prokariot dan eukariot membawa satu kopi gen yang diklon. Ekspresi simultan dari dua atau lebih gen yang diklon akan membentuk protein multimer yang fungsional. Pada suatu studi sejumlah gen dari virus bluetongue (BTV) sukses diinsersikan ke vektor baculovirus, sehingga terbentuk vektor dengan tujuh gen insersi. Sistem ini ditest dengan vektor yang membawa empat protein BTV. Ekspresi dari gen ini menghasilkan partikel yang secara struktur mirip dengan virus pada siklus perakitan. Virus-like partikel ini diinjeksikan ke domba dan menghasilkan antibodi terhadap protein BTV yang bertahan untuk waktu lama. Dalam studi yang lain, antibodi manusia dan elemen antibodi di produksi dari vektor dua gen dengan urutan pengkode kombinasi variasi rantai immunoglobulin ringan dan berat.
5.4. Glikosilasi dan pemrosesan protein mamalia di sel serangga.
mengatasi kekurangan ini, sel serangga yang stabil diintegrasi dengan gen α-2,6-sialiltransferase dan vektor kloning baculovirus diintegrasi dengan gen β-1,4 glaktotransferase mamalia, dibawah kontrol promotor early-stage. Pada
kondisi uji, sistem ini mensintesis N-link glikan dengan galaktosa dan asam sialat.
Dalam beberapa kasus, protein heterolog juga tidak diproses dengan tepat dari prekursor inaktif yang besar menjadi bentuk aktif dalam sel serangga. Sel mamalia mengandung sejumlah enzim pemroses protein (proprotein konvertase). cDNA untuk salah satu enzim ini, yaitu furin, telah diklon kedalam vektor ekspresi baculovirus dibawah kontrol promotor polyhedrin dan dikotransfeksi ke sel serangga dengan vektor ekspresi baculovirus lain dengan urutan untuk preproprotein yang normalnya tidak diproses oleh sel serangga. Pada kondisi ini terjadi konversi penuh menjadi protein aktif.
6. Sistem ekspresi untuk sel mamalia.
Sistem ekspresi sel mamalia penting untuk produksi protein heterolog dengan modifikasi pascatranslasi yang lengkap. Sejumlah sel telah dikembangkan untuk tujuan ini. Contohnya sel yang diambil dari ginjal monyet hijau dari Afrika (COS), sel ginjal bayi hamster (BHK), dan sel ginjal embrio manusia (HEK-239), digunakan untuk mempercepat ekspresi gen dan mempercepat produksi sejumlah kecil protein heterolog, atau untuk mengetahui integritas dari konstruksi selama pengembangan vektor. Sel Chinnese hamster ovary (CHO) telah umum digunakan untuk ekspresi gen
jangka panjang dan untuk produksi protein jumlah banyak. Sejauh ini telah ratusan vektor ekspresi mamalia yang dikembangkan, dan semuanya tidak berbeda dalam disainnya.
urutan terminasi transkripsi (signal poliadenilasi) harus dari eukariot dan secara teratur diambil dari virus lain (cytomegalovirus, SV40, virus herpes
simpleks) atau gen mamalia (β-actin, metallothionein, thymin kinase, bovine growth hormone). Promotor konstitutif yang kuat dan signal poliadenilasi
dibutuhkan.
Gambar 10. Peta vektor ekspresi untuk sel mamalia. Multiple cloning site (MCS) dan selectable marker gene (SMG) berada dibawah kontrol promotor (p), poliadenilasi (pa), dan terminasi transkripsi (TT) untuk eukariot. Intron (I) mempercepat produksi protein heterolog.
Promotor yang dapat diinduksi sering digunakan bila sintesis secara kontinu dari protein heterolog bersifat toksid terhadap sel inang. Ekspresi dari gen yang diinginkan dapat ditingkatkan dengan menempatkan urutan intron antara promotor dan sisi kloning dari konstruksi transkripsi (cassette). Intron hibrida yang terdiri dari bagian donor dan sisi akseptor dari dua gen yang berbeda cukup efektif untuk berbagai sel. Urutan yang dibutuhkan untuk seleksi dan propagasi dari vektor ekspresi mamalia dalam E. coli diambil dari vektor kloning E. coli seperti pBR322.
meyakinkan bahwa translasi terjadi pada lokasi yang tepat. Sedangkan urutan yang mengandung 5’ dan 3’ untranslated region (UTR) penting untuk efisiensi translasi dan kestabilan mRNA. Sintetik 5’ dan 3’ UTR atau dari gen β-globin manusia digunakan pada vektor ekspresi mamalia.
Vektor ekspresi sel mamalia pada umumnya membawa satu gen yang mengkode polipeptida fungsional. Bentuk aktif dari beberapa protein komersial mengandung dua rantai protein yang berbeda. Contohnya, hormon tyhroid manusia merupakan dua rantai polipeptida (heterodimer), hemoglobin, dan antibodi merupakan tetramer dengan dua copy masing-masing subunit (yaitu α2β2 dan H2L2). Gen atau cDNA dari masing-masing subunit dapat diklon, disintesis dan masing-masing subunit dipurifikasi secara terpisah, dan kemudian semua rantai polipeptida digabung dalam tabung reaksi. Namun, hanya sedikit protein multi-rantai yang dapat dirakit in vitro. Sebaliknya perakitan in vivo dari protein dimer atau tetramer cukup efisien. Sehingga sejumlah strategi telah dikembangkan untuk produksi dua rekombinan protein dalam sel yang sama.
diklon terpisah satu dengan yang lain oleh urutan DNA yang mengandung sisi pemasukan internal ribosom (IRES= internal ribosomal entry site). IRES ditemukan pada genom virus mamalia, dan menyebabkan terjadinya translasi simultan dari protein yang berbeda pada mulekul mRNA policistronik. Transkripsi dari konstruksi ”gen a-IRES-gen b” dikontrol oleh satu promotor dan signal poliadenilasi. Pada kondisi ini ”dua gen” tunggal (bicistronik) ditranskripsi dan translasi berlangsung dari ujung 5’ mRNA untuk memproduksi rantai pertama (rantai a) dan didalam elemen IRES memproduksi rantai kedua (rantai b). Biasanya, konstruksi vektor ekspresi mamalia memakan waktu lama dan membutuhkan usaha yang gigih untuk mendapatkan produksi protein yang optimum.
6.1. Sistem marker penyeleksi untuk vektor ekspresi mamalia.
Beberapa skema seleksi telah di disain yang fungsinya tidak hanya untuk identifikasi sel yang mengalami transfeksi, juga untuk meningkatkan produksi protein heterolog melalui amplifikasi jumlah copy vektor ekspresi. Sistem dihidrofolat reduktase methotrexate (DHFR-MTX) termasuk ke dalam kategori ini. DHFR mengkatalisis reduksi dihidrofolat menjadi tetrahidrofolat, yang dibutuhkan untuk produksi purin. MTX merupakan inhibitor kompetitif dari DHFR. Sensitifitas MTX dapat diatasi jika sel memproduksi DHFR berlebih. Bila konsentrasi MTX meningkat dalam jangka waktu tertentu, gen DHFR dalam kultur sel akan diperbanyak. Pada protokol standar DHFR-MTX, sel defisien DHFR ditransfeksi dengan vektor ekspresi yang membawa gen DHFR sebagai marker seleksi dan kemudian sel diperlakukan dengan MTX. Setelah seleksi awal terhadap sel yang mengalami transfeksi, konsentrasi MTX ditingkatkan, sehingga sel dengan jumlah copy tinggi vektor dapat diseleksi.
DAFTAR PUSTAKA
Ansari, A., V. C. Emery. 1998. Baculoviruses, 219-233. Dalam R. Rabley and J. M. Walker (ed.) Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc., Totowa, N.J.
Barnes, L. M., C. M. Bentley, and A. J. Dickson. 2000. Advances in animal cell recombinant protein production: GS-NSO expression system. Cytotechnology 32: 109-123.
Cregg, J. M. 1999. Expression in the methylotropic yeast Pichia pastoris, 157-191. Dalam J. Fernandez and J. P. Hoeffler (ed.) Gene Expression Systems: Using nature for the Art of Expression. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.
Glick, B.R., Pasternak, J.J. 2003. Molecular biotechnology, principles and applications of recombinant DNA. ASM Press (Washington DC). 163-173.
Geisse, S., and H. P. Kocher. 1999. Protein expression in mamalian and insect cells, Methods Enzymol. 306:19-42.
Invitrogen, A manual of methods for expresion of recombinant proteins in Pichia Pastoris, 2004. California. 7-10.
Robinson, A. S., Hines, V., Wittrup, K. D. 1994. Protein disulphide isomerase overexpression increases secretion of foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio/Technology. 12, 381-384
Schultz, L. D., Markus, H. Z., Hofmann, K. J., Montgomery, D. L., Dunwiddier, C. T., Kniskern, P. J., Freedman, R. B., Ellis, R. W., Tuite, M. F. 1994. Using molecular genetic to improve the production of recombinant proteins by the yeast Saccharomyces cerevisiae. Ann. N. Y. Acad. Sci. 721, 148-157
Shi-Hwei, L., Wei-I, C., Chia-Chin, S., Margaret Dah-Tsyr, C. 2005. Improved secretory production of glucoamylase in Pichia pastoris by combination of genetic manipulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 326, 817-824 Tuite, M.F. and Freedman, R.B. 1994, Improving secretion of recombinant
