Hubungan Viabilitas Sel, Ekspresi Protein P53 dan Ki-67
pada Kultur Fibroblas Gingiva Manusia yang Dipajan Lipopolisakarida
Bakteri Gram-Negatif
(The Correlation between Cell Viability, Expression of p53 Protein and Ki-67
on Cultured Human Gingival Fibroblasts Exposed to Bacterial
Lipopolysaccharide)
Banun Kusumawardani
Staf Pengajar Bagian Periodontologi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember
ABSTRACT
Bacterial lipopolysaccharide (LPS) are potent inflammatory agents and play a major role in inflammatory periodontal disease, but LPS also have direct cytotoxic effects on cells of the periodontium.is implicated in etiology of inflammatory periodontal disease. The purpose of this study was to investigate the correlation between cell viability with expression of p53 protein, and correlation between expression of p53 protein with Ki-67 on cultured human gingival fibroblasts exposed to LPS. Cultured human gingival fibroblasts were exposed to LPS in concentration of 50 and 200 μg/ml and untreated medium for a period of 24, 48, 72, and 96 hours. Cells were harvested and prepared for immunohistochemically methods.The correlation between cell viability with expression of p53 protein, and correlation between expression of p53 protein with Ki-67 were significant. The growth of gingival fibroblasts is partially inhibited by LPS, but the left viable cells continue to proliferate and eventually attains a cell density equivalent to unexposed cells. Up-regulation of p53 protein during the initially logarithmic phase of growth may be a consequence of on going DNA damage. Ki-67 is consistently absent in quiescent cells and in confluent monolayer culture.
Keywords: bacterial lipopolysaccharide, gingival fibroblasts, cell viability, p53 protein, Ki-67.
PENDAHULUAN
Periodontopatogen yang diduga sebagai penyebab penyakit periodontal adalah mikroorganisme gram-negatif (Loesche et al., 1985), dan yang sangat berhubungan dengan penyakit periodontal destruktif adalah spesies Bacteroides dan spirochete (Slot, 1979; Lopez, 2000). Spesies bakteri gram-negatif ini mempunyai lipopolisakarida (LPS), yang merupakan suatu komponen struktural dari selaput luar bakteri gram-negatif. Lipopolisakarida dapat dideteksi pada plak gigi (Duguid, 1985) dan permukaan akar gigi (Olson et al., 1985).
Pajanan LPS dengan konsentrasi 100 sampai 1000 μg/ml dan waktu pajanan sampai 7 hari pada kultur sel fibroblas tikus dapat menurunkan pertumbuhan dan viabilitas sel (Olson et al., 1985), tetapi Takata et al.,(1997) mendapatkan sel junctional epithelium tikus dapat memulai siklus sel untuk berproliferasi setelah dipapar LPS dengan konsentrasi 5 mg/ml selama 1 hari.
Elemen selular yang banyak ditemukan dari jaringan ikat gingiva adalah fibroblas (Itoiz dan Carranza, 1996). Fibroblas secara normal hanya menunjukkan pertumbuhan yang minimal pada jaringan ikat dewasa, namun
pada kondisi patologis dan selama penyembuhan luka, fibroblas teraktivasi untuk meningkatkan level proliferasi dan sintesis (Ross, 1968 sit Ko et al., 1981). Fibroblas memulai sintesis DNA setelah 15 sampai 18 jam dan mencapai maksimal pada 22 sampai 24 jam, selanjutnya akan menurun (Ko et al., 1977 sit Ko et al., 1981).
Pada penelitian ini, viabilitas sel diobservasi untuk mengetahui pengaruh pajanan LPS pada kultur sel fibroblas gingiva manusia. Viabilitas sel adalah jumlah sel yang sehat dalam suatu sampel, tanpa membedakan apakah sel-sel membelah secara aktif atau quiescent (Wyllie et al., 2000).
Jurnal ILMU DASAR Vol. 7 No. 2, 2006 : 126-132 127
Protein p53 menstimulasi perbaikan DNA. Jika perbaikan DNA berhasil, maka proliferasi sel akan dilanjutkan untuk memelihara massa sel (King, 2000). Proliferasi sel dapat diestimasi dengan KI-67, karena ekspresi Ki-67 dapat diobservasi pada inti sel yang berproliferasi dan terletak pada siklus sel fase G1, S, G2, dan M (Gerdes et al., 1984).
Ekspresi protein p53 dan Ki-67 belum diteliti pada sel fibroblas gingiva manusia yang dipajan LPS. Penelitian tentang aksi LPS tersebut merupakan hal-hal pokok untuk klarifikasi mekanisme aktivitas LPS. Determinasi aktivitas proliferasi sel fibroblas gingiva setelah pajanan LPS dapat bermanfaat untuk mengetahui aktivitas biologis LPS pada jaringan periodontal. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan data tentang 1) hubungan viabilitas sel dengan ekspresi protein p53, dan 2) hubungan ekspresi protein p53 dengan Ki-67 pada kultur sel fibroblas gingiva manusia yang telah dipajan LPS konsentrasi 50 dan 200 μg/ml dengan waktu pajanan 24, 48, 72 dan 96 jam
METODE
Prosedur Kultur Primer Sel Fibroblas Gingiva Manusia
Jaringan gingiva diambil dari gingiva bebas pada gigi P1 untuk perawatan ortodontik yang sudah diekstraksi. Pasien sehat, tanpa gejala klinis inflamasi atau hiperplasi gingiva, dan tanpa riwayat penyakit sistemik, dan tidak merokok.
Jaringan gingiva diletakkan ke dalam petri dish, dicuci tiga kali dengan PBS yang mengandung penicillin dan streptomycin untuk menghindari kemungkinan kontaminasi bakteri. Jaringan gingiva dipotong-potong berukuran sekitar 1 mm3, kemudian diberi 5 ml media kultur dan diinkubasi ke dalam inkubator CO2 5%, 37 oC selama 3 hari.
Eksplan jaringan gingiva dipindahkan dari petri dish. Media kultur diganti hingga pertumbuhan sel mencapai konfluensi yang memungkinkan untuk dipasase (subkultur). Kultur sel dimonitor dengan inverted microscope.
Prosedur Pembuatan Sampel Untuk Metode dye exclution test
Suspensi sel fibroblas yang mengandung sekitar 2 x 104sel/200μl dipindahkan ke dalam 96 multiwell plate (MP), kemudian diberi media kultur. Setelah diinkubasi selama 48 jam, media kultur dibuang. Sel fibroblas diberi
200 μl media kultur yang mengandung LPS Escherichia coli dengan konsentrasi 50 dan 200 μg/ml. MP tanpa perlakuan sebagai kontrol hanya diberi media kultur. Setiap konsentrasi dibuat 5 replikasi. Setelah diinkubasi selama 24, 48, 72 dan 96 jam, sel fibroblas diberi trypan blue. Semua sel dihitung, baik yang hidup atau mati pada bilik hitung hemositometer. Hasil penghitungan sel dikonversikan menjadi persentase viabilitas sel.
Prosedur Pembuatan Sampel Untuk Metode Imunohistokimiawi
Suspensi sel fibroblas yang mengandung sekitar 2 × 105 sel/ml dipindahkan ke dalam 24 multiwell plate (MP), kemudian diberi media kultur. Setelah diinkubasi selama 48 jam, media kultur dibuang. Sel fibroblas diberi 1 ml media kultur yang mengandung LPS Escherichia coli dengan konsentrasi 50 dan 200 μg/ml. MP tanpa perlakuan sebagai kontrol hanya diberi media kultur. Setelah diinkubasi selama 24, 48, 72, dan 96 jam, sel-sel fibroblas dipisahkan dengan trypsin dan dipindahkan ke dalam mini tube, selanjutnya dilakukan sentrifugasi selama 10 menit. Suspensi sel diteteskan pada slide poly-L-lisin dan dikeringkan pada suhu kamar. Fiksasi dengan methanol PA, kemudian aseton PA. Sediaan kemudian diaplikasi dengan hidrogen peroksida 0,5% dalam methanol absolut selama 10 menit, untuk mengakhiri aktivitas endogenous peroxidase. Aplikasi dalam normal serum, kemudian diaplikasi antibodi primer dengan dilusi 1:100 untuk p53 dan 1:50 untuk Ki-67. Inkubasi selama semalam pada 4oC. Inkubasi dalam biotinylated secondary antibody, kemudian diinkubasi dalam streptavidine peroxidase. Setiap tahap dicuci dengan PBS 2 x 5 menit. Aplikasi DAB dan dicuci pada air mengalir selama 15 menit. Counterstained dengan Harry’s hematoxylin. Mounting dengan Canada balsam dan sediaan ditutup dengan deckglass. Dilihat dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x. Semua sel dihitung, baik yang terekspresi atau tidak pada 5 lapang pandang. Inti sel yang terekspresi protein p53 dan Ki-67 berwarna coklat. Hasil penghitungan sel dikonversikan menjadi persentase ekspresi p53 dan Ki-67.
Analisis Data
ekspresi protein p53, dan hubungan antara ekspresi protein p53 dengan ekspresi Ki-67.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penghitungan sel dinyatakan dalam bentuk persentase viabilitas sel, ekspresi protein p53, dan ekspresi Ki-67. Rerata persentase viabilitas sel, ekspresi protein p53 dan Ki-67 untuk tiap kelompok sampel dapat dilihat pada Tabel 1.
Terdapat hubungan negatif yang kuat (p < 0,01) antara viabilitas sel fibroblas gingiva manusia dengan ekspresi protein p53. Semakin
banyak sel fibroblas yang hidup akan membuat ekspresi protein p53 semakin sedikit. Hasil uji yang menunjukkan signifikansi hubungan antara viabilitas sel fibroblas gingiva manusia dengan ekspresi protein p53 dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.
Terdapat hubungan positif yang kuat (p < 0,01) antara ekspresi protein p53 dengan Ki-67. Semakin tinggi ekspresi protein p53 akan membuat ekspresi Ki-67 semakin tinggi pula. Hasil uji yang menunjukkan signifikansi hubungan antara ekspresi protein p53 dengan Ki-67 dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.
Tabel 1. Rerata persentase viabilitas sel, ekspresi protein p53 dan Ki-67
Konsentrasi (μg/ml)
Waktu (Jam)
Viabilitas Sel (Rerata ± SD)
Ekspresi p53 (Rerata ± SD)
Ekspresi Ki67 (Rerata ± SD)
Kontrol 24 100 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
48 100 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
72 100 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
96 100 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
LPS 50 24 78,31 ± 2,45 81,71 ± 8,56 45,83 ± 30,62 48 86,15 ± 2,65 32,15 ± 6,11 14,33 ± 7,34
72 95,52 ± 1,24 0 ± 0 0 ± 0
96 99,17 ± 1,86 0 ± 0 0 ± 0
LPS 200 24 61,87 ± 1,29 88,80 ± 6,61 13,56 ± 12,26 48 73,79 ± 4,72 21,13 ± 3,97 8,12 ± 5,17
72 95,35 ± 1,54 0 ± 0 0 ± 0
96 99,26 ± 1,65 0 ± 0 0 ± 0
LPS-50
0 20 40 60 80 100 120
24 48 72 96
waktu
p
resen
ta
se viabilitas
p53
Ki-67
Jurnal ILMU DASAR Vol. 7 No. 2, 2006 : 126-132 129
LPS-200
0 20 40 60 80 100 120
24 48 72 96
Waktu
P
resen
tase viabilitas
p53
Ki-67
Gambar 2. Hubungan antara viabilitas sel dengan ekspresi protein p53, dan hubungan ekspresi protein p53 dengan ekspresi Ki-67 pada kultur sel fibroblas gingiva manusia yang telah dipajan LPS 200 μg/ml
Pada Tabel 1, Gambar 1 dan 2 menunjukkan bahwa pajanan LPS konsentrasi 50 dan 200 μg/ml pada waktu pajanan 24 jam menurunkan viabilitas sel, meningkatkan ekspresi protein p53 dan meningkatkan ekspresi Ki-67. Jika waktu inkubasi kultur sel fibroblas gingiva manusia ditambah sampai 48, 72 dan 96 jam maka viabilitas sel akan bertambah sampai mencapai viabilitas sel yang mirip dengan kelompok kontrol, sedangkan ekspresi protein p53 dan Ki-67 akan berkurang sampai sama dengan kelompok kontrol.
Analisis siklus sel pada hari ke 3 dan 7 menunjukkan persentase sel pada fase S menurun sampai 72%, persentase sel pada fase G0 atau G1 meningkat sampai 37%, dan
persentase sel pada fase G2 atau M tetap
konstan selama kultur Marrioti dan Cochran, 1990). Oleh karena itu hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol viabilitas sel tetap konstan, tidak ada ekspresi protein p53 dan Ki-67 selama waktu pajanan 24, 48, 72 dan 96 jam.
Pada hari pertama inkubasi (24 jam) diduga terjadi upregulation dari p53 wild type yang merupakan konsekuensi dari kerusakan DNA, sehingga protein p53 menginduksi penghentian sementara siklus sel agar menyediakan waktu yang cukup untuk perbaikan kerusakan. Jika tidak mungkin terjadi perbaikan, p53 mempromotori apoptosis untuk mengeliminasi sel fibroblas yang rusak karena pajanan LPS.
Hasil penelitian di atas menunjukkan bahwa kultur sel fibroblas gingiva pada kelompok perlakuan di awal inkubasi diduga telah
mengalami apoptosis dan perbaikan DNA. Apoptosis sel fibroblas gingiva tersebut merupakan suatu mekanisme sel untuk mengatur pertumbuhan, diferensiasi, dan turnover sel. Hal ini didukung oleh hasil penelitian yang menunjukkan bahwa pada waktu pajanan 72 dan 96 jam tidak ada ekspresi p53, dan pada penghitungan jumlah sel fibroblas gingiva yang hidup diperoleh hasil bahwa pada akhir periode inkubasi, jumlah sel fibroblas gingiva mencapai suatu densitas sel seperti pada densitas sel yang tidak dipajan LPS.
proliferasi dan kerusakan DNA tidak diturunkan pada sel anak.
Protein p53 memegang peranan dalam sintesis, perbaikan DNA dan apoptosis. Protein p53 bereaksi sebagai faktor transkripsi untuk beberapa gen, misalnya p53 menghambat proliferasi dengan menginduksi p21 (cyclin-dependent kinase inhibitor), p53 menstimulasi perbaikan DNA dan p53 mempromotori apoptosis dengan meningkatkan bax dan menurunkan bcl2 (King, 2000). Jadi kerusakan DNA dapat diperbaiki dengan perubahan koordinasi antara proliferasi, perbaikan DNA dan apoptosis, sehingga dihasilkan sel-sel anak yang normal pada saat mitosis.
Berdasarkan pernyataan Lazzaro dan Cleveland (2000) maka persentase pengecatan sel untuk ekspresi Ki-67 pada penelitian ini menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol, hasil penghitungan rerata persentase ekspresi Ki-67 untuk semua waktu pajanan adalah 0%, maka dianggap negatif. Rerata persentase ekspresi Ki-67 terendah pada kelompok perlakuan, yaitu 0% dihasilkan pada konsentrasi LPS 50 dan 200 μg/ml dengan waktu pajanan 72 dan 96 jam, hasil ini juga dikategorikan negatif, sedangkan rerata persentase ekspresi Ki-67 tertinggi pada kelompok perlakuan, yaitu 45,83% dihasilkan pada konsentrasi LPS 50 μg/ml dengan waktu pajanan 24 jam, dapat dikategorikan sedang. Pada kelompok perlakuan lainnya menunjukkan hasil ekspresi Ki-67 pada kategori rendah, yaitu antara 1% - 15%.
Hasil tersebut di atas mengindikasikan bahwa inti sel fibroblas gingiva yang bereaksi positif terhadap Ki-67 mempunyai kemampuan proliferasi yang terbatas. Hal ini mirip dengan penelitian Saygun dkk (2003) yang menunjukkan bahwa sel fibroblas dari lesi hereditary gingival fibromatosis tidak ada yang terekspresi Ki-67. Shirasuna dkk (1989) melaporkan bahwa fibroblas gingiva dari pasien dengan congenital gingival fibromatosis menunjukkan sedikit proliferasi daripada gingiva normal, tetapi jumlah biosintesis kolagen dan glikosaminoglikan adalah cukup besar.
Terdapat hubungan positif yang kuat antara ekspresi protein p53 dengan Ki-67 yaitu semakin tinggi ekspresi protein p53 akan semakin tinggi pula ekspresi Ki-67, tetapi penggunaan Ki-67 untuk memperkirakan aktivitas proliferatif tidak dianjurkan pada jaringan yang terekspresi p53 atau p21 secara
berlebihan (Meer dkk, 2003). Ki-67 secara konsisten tidak ditemukan pada sel quiescent dan tidak dapat dideteksi selama proses perbaikan DNA (Schlüter dkk, 1995). Oleh karena pada penelitian ini protein p53 terekspresi secara berlebihan dan protein p53 berperan dalam proses perbaikan DNA, maka KI-67 lebih sedikit terekspresi daripada protein p53.
Menurut Ko dkk (1981) bahwa pada siklus sel fibroblas gingiva, sintesis protein terus meningkat dan sintesis DNA mencapai level maksimal setelah 24 jam. Pernyataan tersebut mengindikasikan bahwa hasil penelitian ini, pada hari pertama inkubasi (24 jam) pertumbuhan sel fibroblas gingiva sebagian dihambat oleh LPS, tetapi sel fibroblas gingiva yang hidup akan terus berproliferasi dan akhirnya mencapai densitas sel yang ekuivalen dengan sel yang tidak dipajan LPS.
Pada jam ke 72 dan 96 tidak ditemukan ekspresi protein p53 dan Ki-67 pada kultur sel fibroblas gingiva setelah dipajan LPS. Pada jam ke 72 dan 96 tersebut kultur sel fibroblas gingiva sudah membentuk cell monolayer yang konfluen (homogen dan merata) pada dasar multiwell plate. Pada keadaan tersebut sel akan menghentikan proliferasi dan juga pertumbuhannya (Albert dkk, 1994).
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan pada kultur sel fibroblas gingiva manusia, maka dapat disimpulkan bahwa:
1. Pertumbuhan sel fibroblas gingiva sebagian dihambat oleh LPS, tetapi sel fibroblas gingiva yang hidup akan terus berproliferasi dan akhirnya mencapai densitas sel yang ekuivalen dengan sel yang tidak dipajan LPS. 2. Ekspresi protein p53 yang berlebihan
pada waktu pajanan LPS 24 jam diprediksikan bahwa banyak sel fibroblas gingiva yang mengalami kerusakan DNA.
3. Ki-67 lebih sedikit terekspresi daripada ekspresi protein p53, karena Ki-67 tidak ditemukan pada sel quiescent.
DAFTAR PUSTAKA
Jurnal ILMU DASAR Vol. 7 No. 2, 2006 : 126-132 131
Garland Publishing, Inc. New York & London. 863-910.
Duguid, R. 1985. Inhibition of 3H-thymidine uptake in human gingival fibroblasts by extracts from human dental plaque, oral bacteria of the Streptococcus and Actinomyces species. Arch Oral Biol ;30;89-93.
Fine, D.H., Mendietta, C., Barnett, M.L., Furgang, D., Naini, A., Vincent, J.W., 1992. Endotoxin levels in periodontally healthy and diseased sites: correlation with levels of Gram-negative bacteria. J Periodontol ;63:897-901.
Gerdes, J., Lemke, M., Baisch, H., Wacker, H.H., Schwab, U., Stein, H. 1984. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear defined by the monoclonal antibody Ki67. J Immunol ;133:1710-1715.
Itoiz, ME., Carranza, FA. 1996. Periodontal microbiology in Carranza, FA., and Newman, MG. Clinical Periodontology. 8th ed. WB Saunders Company. Philadelphia. 12-29. King, RJB. 2000. Cancer Biology. 2nd ed.
Pearson Education. England. 146-173. Ko, SD., Narayanan, AS., Page, RC. 1981.
Influence of cell cycle on collagen synthesis by human gingival fibroblasts. J Periodontol Res ;16:302-308.
Lazzaro, B., Cleveland, D. 2000. P53 and antigen Ki-67 expression in small oral biopsy specimens of salivary gland tumors. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod ;89:613-617.
Loesche, W.J., Syed, S.A., Schmidt, E., Morrison, E.C. 1985. Bacterial profiles of subgingival plaques in periodontitis. J Periodontol ;56:447-456.
Lopez, N.J. 2000. Occurrence of Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Porphyromonas gingivalis, and Prevotella intermedia in progressive adult periodontitis. J Periodontol ;71:948-954.
Marrioti, A., Cochran, DL. 1990. Characterization of fibroblasts derived from human periodontal ligament and gingiva. J Periodontol;61:103-111.
Meer, S., Galpin, JS., Altini, M., Coleman, H., Ali, H. 2003. Proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 immunoreactivity in ameloblastoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod;95:213-221.
Olson, R.H., Adams, D.F., Layman, D.L. 1985. Inhibitory effects of periodontally diseased root extracts on the growth of human gingival fibroblasts. J Periodontol ;56:592-596.
Saygun, I., Özdemir, A., Günhan, Ö., Aydintuğ, YS., Karslioğlu, Y. 2003. Hereditary gingival fibromatosis and expression of Ki-67 antigen: a case report. J Periodontol;74:873-878. Schlüter, C., Duchrow, M., Wohlenberg, C.,
Becker, MHG., Key, G., Flad, HD., Gerdes, J. 1995. The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki-67: a very large, ubiquitous nuclear protein with numerous repeated elements, representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins. J Cell Biol;123:513-522.
Shirasuna, K., Okura, M., Watanani, K., Hayashido, Y., Saka, M., Matsura, T. 1989. Abnormal celular property of fibroblasts from an unidentified syndrome with gingival hyperplasia as the predominant feature. J Oral Pathol; 7:381-385.
Simon, B.I., Goldman, H.M., Ruben, M.P., Baker, E. 1970. The role of endotoxin in periodontal disease. II. Correlation of the quantity of endotoxin human gingival exydate with the clinical degree of inflammation. J Periodontol ;41:81-86.
Slot, J., Bragd, L., Dahlen, G. 1986. The occurrence of Actinobacillus actinomycetescomitans, Bacteroides gingivalis, and Bacteroides intermedius in destructive periodontal disease in adults. J Clin Periodontol;13:570-576.
Thompson, CB. 1995. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science ;267:1456-1462.
Tipton, DA., Braxton, SD., Dabbous, MK. 1995. Role of salivary components as modulators of bleaching agent toxicity to human gingival fibroblasts in vitro. J Periodontol;66:766-774.
Vogelstein, B., Lane, D., Levine, AJ. 2000. Surfing the p53 network. Nature;408:307-310.
Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D., Kesey, J., Manzow, S. 2000. Guide to cell proliferation and apoptosis methods. Roche Diagnostics Corporation.
