Kel 2ac - Protein Rekombinan (Makalah)

MAKALAH BIOTEKNOLOGI FARMASI

MAKALAH BIOTEKNOLOGI FARMASI

PROTEIN REKOMBINAN

PROTEIN REKOMBINAN

Disusun

Disusun Oleh Oleh ::

Kelompok 2 A

Kelompok 2 A

PROGRAM ST!DI FARMASI PROGRAM ST!DI FARMASI

FAK!LTAS KEDOKTERAN DAN ILM! KESEHATAN FAK!LTAS KEDOKTERAN DAN ILM! KESEHATAN !NI"ERSI

!NI"ERSITATAS S ISLAM ISLAM NEGERI NEGERI S#AS#ARIF HIRIF HIDA#DA#AAT!LLAH T!LLAH $AKARTA$AKARTA DESEMBER 2%&'

DESEMBER 2%&'

PROTEIN REKOMBINAN PROTEIN REKOMBINAN

&

&(( SSiill))ii**nn* * AA++hhii,,--** &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%//.. 2

2(( PPii++ii* * AA00**llii* * NNiiss11**hh &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%%%22 .

.(( PPiimmo o BBii,,,,**3300** &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%''.. /

/(( NNuuuul l FFii,,ii* * PP**kkpp**hh**nn &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%22// 4(

4( Fi,Fi,**h,uh,unninnis*h s*h &&&&&.&.&%2&%2%%%%%%%&/%&/ '

'(( HHeess,,i i SSuulliiss,,iiooiinnii &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%%%// 5

5(( NN**66mm**h h MMuumm,,**77**hh &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%55.. 8

8(( HH**kk* * AAss99**++** &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%55// 

(( BB**++ii--**,,uun n NNii99mm**hh &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%5544 &

&%%( A( Amm11**  LLiiss,,--ooiinnii &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%&&&& &

&&&(( AAss--**3 3 FF**hhuu7777**mm**nn &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%..// &2(

&2( M*is* M*is* &&&&&.&%2%%&.&%2%%%%25%%25 &

&..(( RR**,,iih h DD*** * SS--**++iillll**hh &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%%%.. &

&//(( MM( ( AAkk11**  SSoopphhii**nn &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%2222 &

&44( E( E))iinn* * OO;;,,**))ii**nnii &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%2244 &

&''( !( !mmmmuum m NN**++** &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%//// &

&55(( TTi i <<**hh--uunnii &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%22'' &

&88( "( "iisshhiillpp- - DDiimm**llii** &&&&&&..&&%%22%%%%%%%%//%% &

Protein adalah molekul makro yang mempunyai berat molekul antara lima ribu hingga Protein adalah molekul makro yang mempunyai berat molekul antara lima ribu hingga  beberapa juta. Protein ter

 beberapa juta. Protein terdiri atas diri atas rantai-rantai asam rantai-rantai asam amino, yang terikat samino, yang terikat satu sama lain dalatu sama lain dalamam ikatan peptide Molekul protein merupakan rantai panjang yang tersusun oleh mata rantai ikatan peptide Molekul protein merupakan rantai panjang yang tersusun oleh mata rantai asam-asam amino. Dalam molekul protein, asam-asam amino saling dirangkaikan melalui asam-asam amino. Dalam molekul protein, asam-asam amino saling dirangkaikan melalui reaksi gugusan karboksil asam amino yang satu dengan gugusan amino dari asam amino yang reaksi gugusan karboksil asam amino yang satu dengan gugusan amino dari asam amino yang lain, sehingga terjadi ikatan yang disebut ikatan peptida. Ribosom berfungsi sebagai tempat lain, sehingga terjadi ikatan yang disebut ikatan peptida. Ribosom berfungsi sebagai tempat sintesis protein

sintesis protein dan merupakan contoh organel yang tidak bermembran. Organel ini terutamadan merupakan contoh organel yang tidak bermembran. Organel ini terutama disusun oleh asam ribonukleat, dan terdapat bebas dalam sitoplasma maupun melekat pada disusun oleh asam ribonukleat, dan terdapat bebas dalam sitoplasma maupun melekat pada retikulum endoplasma.

retikulum endoplasma.

Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan dalam berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen dalam berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen dan memproduksi produk komersial yang bermanfaat.

dan memproduksi produk komersial yang bermanfaat. Protein rekombinan merupakan proteinProtein rekombinan merupakan protein yang diperoleh

yang diperoleh dari dari hasil hasil teknoteknologi logi DN rekomDN rekombinanbinan. . PembePembentukantukan n proteiprotein n rekomrekombinanbinan dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai !ector. Melalui teknologi DN dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai !ector. Melalui teknologi DN rekombinan dapat dilakukan pemindahan gen pengode en"im#protein dari satu organism ke rekombinan dapat dilakukan pemindahan gen pengode en"im#protein dari satu organism ke organisme lain. $ehingga bila en"im#protein tersebut diidentifikasi sebagai kandidat en"im organisme lain. $ehingga bila en"im#protein tersebut diidentifikasi sebagai kandidat en"im untuk digunakan dalam industri, gen pengode en"im#protein tersebut dapat dikloning dalam untuk digunakan dalam industri, gen pengode en"im#protein tersebut dapat dikloning dalam suatu mikroorganisme inang yang cocok, dan diproduksi dalam

TEKNIK PRODUKSI PROTEIN

TEKNIK PRODUKSI PROTEIN REKOMBREKOMBINANINAN A.

A. Isolasi Dna Genom, Isolasi Dna Genom, Rna TRna Total Dan Poly(Aotal Dan Poly(A) Rna) Rna 1)

1) IsolaIsolasi DNA si DNA enom enom tottotal.al.

DNA genom berupa untai ganda dan dapat diisolasi dari sel DNA genom berupa untai ganda dan dapat diisolasi dari sel  jenis apapun, ter

 jenis apapun, termasuk bakteri, rmasuk bakteri, ragi, tanaman dan binatagi, tanaman dan binatang. Hasilang. Hasil isolasi DNA yang diinginkan adalah DNA seutuh

isolasi DNA yang diinginkan adalah DNA seutuh mungkin, tidakmungkin, tidak rusak dan memiliki berat molekul tinggi. Sayangnya proses rusak dan memiliki berat molekul tinggi. Sayangnya proses purifkasi DNA sendiri cenderung memutus rantai DNA

purifkasi DNA sendiri cenderung memutus rantai DNA sehinggasehingga menurunk

menurunkan berat an berat molekulnmolekulnya, namun tindakan ya, namun tindakan yang hati-hatiyang hati-hati dapat mengurangi hal ini.

dapat mengurangi hal ini. Proto

Protokol isolasi DNA berariasi, tapi kol isolasi DNA berariasi, tapi sebagai langkah a!alsebagai langkah a!al semua melibatkan pro

semua melibatkan proses lisis sel ses lisis sel dan nukleus "jika sel dan nukleus "jika sel memiliki inti#.memiliki inti#. Suspensi sel-yang-mengandung-D

Suspensi sel-yang-mengandung-DNA diinkubasi dengan NA diinkubasi dengan deterjendeterjen dan atau en$im yang

dan atau en$im yang ber%ungsi untuk melisis sel&inti. 'angkahber%ungsi untuk melisis sel&inti. 'angkah berikutn

berikutnya biasanya ya biasanya adalah mendisosiasi DNA dari adalah mendisosiasi DNA dari protein "misalnyaprotein "misalnya histon# menggunakan en$im yang dapat

histon# menggunakan en$im yang dapat mendegradasi proteinmendegradasi protein "proteinase (#. 'angkah ini sekaligus juga

"proteinase (#. 'angkah ini sekaligus juga untuk menginaktiasiuntuk menginaktiasi en$im seluler yang

en$im seluler yang dapat mendegradasi DNA "nuklease#. Proteindapat mendegradasi DNA "nuklease#. Protein yang terdegradasi sebagian, dihilangkan dari larutan dengan cara yang terdegradasi sebagian, dihilangkan dari larutan dengan cara ekstraksi %enol&kloro%or

ekstraksi %enol&kloro%orm, presipitasi dengan m, presipitasi dengan garam, atau garam, atau dengandengan mele!atkan larutan melalui kolom yang akan menahan DNA. DNA mele!atkan larutan melalui kolom yang akan menahan DNA. DNA dipresipitasi dengan etanol. Dengan cara ini

dipresipitasi dengan etanol. Dengan cara ini biasanya DNA denganbiasanya DNA dengan )* tinggi

)* tinggi "misalnya DNA genom manusia# akan membentuk"misalnya DNA genom manusia# akan membentuk threadsthreads ( 

( rantairantai ) ) dan dapat ditarik dari dan dapat ditarik dari larutan menggunaklarutan menggunakan batang gelas.an batang gelas. DNA kemudian dikeringkan dan dilarutkan kembali dalam air dengan DNA kemudian dikeringkan dan dilarutkan kembali dalam air dengan bu+er tertentu "ris-Hl atau ris-DA# dan akan stabil selama

bu+er tertentu "ris-Hl atau ris-DA# dan akan stabil selama beberapa tahun.

beberapa tahun.

!)

!) IsolaIsolasi RNA si RNA sel"lesel"le# tot# total.al. )eberapa jenis /NA

)eberapa jenis /NA dapat ditemukan dalam sel, dapat ditemukan dalam sel, termasutermasukk messenger

messenger /NA "m/NA#,/NA "m/NA#, ribosomalribosomal /NA "r/NA#,/NA "r/NA#, transfertransfer /NA "t/NA#/NA "t/NA# dan lain-lain. (ebanyakan studi "

dan lain-lain. (ebanyakan studi "Northern blot Northern blot , /-P/# cukup, /-P/# cukup menggunak

menggunakan hasil isolasi an hasil isolasi /NA seluler total. )erbeda dengan /NA seluler total. )erbeda dengan DNA,DNA, /NA berupa untai tunggal dan

/NA berupa untai tunggal dan relati% tidak stabil. Pada proses isolasirelati% tidak stabil. Pada proses isolasi dan penyimpanan /NA harus sangat diperhatikan agar /NA tidak dan penyimpanan /NA harus sangat diperhatikan agar /NA tidak

terdegradasi oleh en$im /NAse yang banyak ditemukan di lingkungan. Selama isolasi /NA, sel atau jaringan

dihomogenisasikan dalam larutan yang mengandung senya!a yang dapat menghambat kerja /NAse, misalnya guanidium isotiosianat. )eberapa metode yang berbeda dapat digunakan untuk langkah berikutnya yaitu pemisahan /NA dari DNA genom. Pada tahap akhir prosedur, seperti juga pada isolasi DNA, /NA yang dipurifkasi

dipresipitasi dengan etanol. 'arutan /NA dalam air harus disimpan dalam keadaan beku.

3) Isolasi mRNA.

0ntuk beberapa aplikasi, total /NA seluler tidak cukup baik digunakan. Dari total /NA sebagian besar berupa r/NA, sedangkan m/NA hanya 1- 23. 0ntuk membuat library gen yang diekspresi atau untuk mendeteki m/NA yang sangat jarang&sedikit jumlahnya pada Northern blot , mengisolasi m/NA

merupakan langkah a!al terpenting. Hampir semua m/NA

mengandung adenilat " poly-adenilated/polyA RNA#, sehingga si%at ini dapat digunakan untuk menangkap dan mengisolasi m/NA. otal /NA seluler dile!atkan melalui

kolom atau resin polydeoxythymine "kolom oligod, polyd# yang terikat pada %ase padat. /NA yang tidak terikat akan hilang tercuci, sedangkan poly"A# /NA dapat dielusi pada tahap berikutnya.

B. K$ONING DNA

Pada metode isolasi DNA di atas, genom sel adalah sumber DNA, oleh karena itu semua sekuens DNA yang diperoleh akan sama  jumlahnya seperti yang terdapat dalam sel. ergantung pada ukuran

genom organisme, suatu gen tunggal tertentu hanya merupakan bagian yang sangat kecil dari DNA total dalam sel. Sebagai contoh, rata-rata satu gen tunggal dalam manusia "4155.555 pb#

hanya merupakan 5.5523 dari genom total. 6adi, gen tunggal terlalu kecil untuk dapat digunakan dalam studi yang mendetil "misalnya sekuensing DNA#.

Problem ini dapat dipecahkan dengan kloning DNA, yang memungkinkan untuk membuat satu DNA tertentu dalam jumlah

besar dan murni. Semua metode (loning DNA melibatkan ligasi suatu urutan&sekuens tertentu "misalnya gen manusia# ke dalam ektor kloning. 7ektor kloning adalah urutan DNA yang terdapat di dalam satu sel "dalam hal ini biasanya bakteri E. coli# tapi bukan merupakan bagian dari genom sel. Pemba!a cloning "dan DNA yang diklon di dalamnya# akan diperbanyak dalam sel hospes,

menghasilkan sejumlah besar DNA dengan urutan spesifk yang kemudian dapat diisolasi untuk studi selanjutnya.

Plasmi% E. &oli.

(loning ke dalam plasmid E. coli masih merupakan metode terpenting untuk membuat DNA dalam jumlah besar dan murni. Plasmid adalah DNA untai ganda sirkuler yang kecil "8555-9555 pb# yang dapat memperbanyak diri "replikasi# di dalam sel bakteri

":ambar 1-9#. Plasmid memiliki origin of replication sendiri dan mampu memperbanyak diri "propagasi# dengan bantuan mesin-mesin seluler endogen. Plasmid kloning mengandung marka seleksi "selectable marker #, biasanya berupa gen yang memba!a resistensi terhadap antibiotika. E. coli yang mengandung plasmid yang dapat-diseleksi-dengan antibiotika ini akan mampu tumbuh dalam media yang mengandung antimikroba tertentu. )anyak plasmid yang memiliki gen β-lactamase, dapat tumbuh dalam ampisilin. Plasmid dapat dibedakan bedasarkan jumlah-salinan "copy number #; tinggi dan rendah. DNA plasmid murni dapat dipisahkan dari DNA genom E. coli, karena plasmid DNA jauh lebih kecil ukurannya dibanding DNA genom E. coli "genom E. coli 4 1<15= pb#. Sel E. coli yang

mengandung plamid ditumbuhkan dalam sejumlah besar media cair yang mengandung antibiotika tertentu. Sel kemudian dibuat pelet dengan cara sentri%ugasi dan lisis menggunakan alkali atau

deterjen. Semua metode pembuatan plasmid menggunakan dasar seleksi ukuran untuk memisahkan antara DNA plasmid sirkuler yang kecil dengan DNA genom yang berat molekulnya ")*# tinggi dan /NA. )eberapa mg DNA plasmid murni dapat diperoleh dari 1 '

kultur sel E. coli yang mengandung plasmid dengan jumlah salinan tinggi.

Plasmid E. coli modern telah direkayasa sehingga memiliki beberapa situs restriksi " polylinker sites#. )erikut adalah prosedur untuk kloning satu gen tertentu ":ambar 1-9#; DNA plasmid a!al dipotong dengan en$im restriksi, sehingga DNA sirkuler terbuka dan menjadi linier. DNA untai ganda linier lain, yang diinginkan, dibuat sehingga ujung-ujungnya sesuai untuk diligasikan ke dalam celah sehingga plasmid sirkuler terbentuk kembali. Plasmid yang telah diligasi ini dimasukkan melalui proses trans%ormasi ke dalam E. coli.  >ang sensiti% terhadap antibiotik marka yang terkandung dalam

plasmid. rans%ormasi bakteri dapat tercapai dengan memanaskan campuran DNA dan bakteri pada ?8° selama 1 menit "heat shock # atau dengan memberikan aliran listrik "electroporation#, sehingga DNA plasmid dapat melalui dinding bakteri masuk ke dalam sel bakteri. Setelah trans%ormasi, bakteri ditumbuhkan pada pelat agar yang mengandung antibiotik. Pada kondisi ini hanya sel yang

memiliki plasmid sirkuler yang dapat tumbuh dan membentuk koloni. iap koloni bakteri ini disebut klon, karena setiap sel dalam koloni identik secara genetik. iap klon dapat diperbanyak dalam media cair untuk membuat DNA plasmid dalam jmlah besar. (arena sel bakteri tidak mati dan dapat terus menerus membelah tanpa batas, klon yang mengandung plasmid ini merupakan sumber DNA yang permanen. Sel dapat disimpan beku selamanya, dan klon dapat diposkan dan dipakai bersama dengan laboratorium yang lain.

Plasmid modern dengan jumlah salinan tinggi berukuran 42 kb dapat menerima DNA sisipan sampai 19 kb. Namun, kebanyakan DNA yang diklon ke dalam plasmid berukuran @15 kb, ukuran yang lebih besar biasanya tidak stabil. Sehingga hanya DNA dengan

ukuran relati% kecil yang dapat diklon ke dalam ector plasmid. leh karena itu, dikembangkan ektor cloning yang dapat memba!a DNA dengan ukuran besar, antara lain ektor kloning %aga " phage#,

kosmid, bacterial articial chromosomes (!A") dan yeast articialchromosomes (#A").

$i'#a#y.

7ektor kloning di atas dapat digunakan untuk memperbanyak DNA tertentu dalam jumlah besar dan murni. etapi bagaimana gen DNA tersebut dapat ditemukan pertama kaliB Proses isolasi suatu gen tertentu dari campuran DNA yang kompleks dapat dijelaskan secara singkat sebagai berikut.

(ebanyakan strategi isolasi gen secara traditional melibatkan pembuatan library DNA atau /NA. *ateri a!al library adalah

campuran DNA kompleks yang diketahui mengandung urutan DNA yang diinginkan. Sebagai contoh, materi a!al untuk mengisolasi gen manusia tentunya adalah DNA genom yang diisolasi dari sel

manusia. DNA ini kemudian dipotong-potong menjadi beberapa %ragmen dengan ukuran tertentu secara mekanis atau didigesti menggunakan en$im restriksi endonuklease. 0kuran %ragmen tergantung pada ector kloning yang digunakan. 0ntuk library  phage, ukuran %ragmen rata-rata 4C-89 kb.

ampuran %ragmen DNA ini diligasikan ke dalam ektor

kloning dan reaksi ligase digunakan untuk mentrans%ormasi bakteri E. coli. Si%at biologi ektor kloning menjamin bah!a setiap indiidu bakteri hanya mengandung satu sisipan "insert #. Dengan demikian, prosedur ini membagi campuran a!al DNA yang kompleks menjadi  jutaan klon tunggal, tiap klon hanya mengandung satu jenis DNA,

satu library . $ibrary  dapat dibuat dari bermacam-macam sumber DNA untai ganda

Gam'a# 1 Subkloning pada bakteri. 7ektor cloning p01 digunakan untuk memperbanyak cDNA. Plasmid memiliki origin of replication bakteri "/E#, gen resisten untuk seleksi dalam media antibiotik "Amp#, dan gen yang dapat

digunakan untuk mendeteksi penyisipan cDNA "lacF#. Setelah plasmid dibuka dan cDNA disisipkan dengan bantuan en$im restriksi dan ligasi, konstruksi DNA ini dimasukkan ke dalam bakteri E. coli dengan cara syok panas "heat shock # atau elektroporasi. Setelah trans%ormasi, bakteri ditanam pada media yang

mengandung gen

resistensi antibitika yang dapat tumbuh. )akteri ditumbuhkan dalam media yang juga mengandung G-gal, substrat untuk β

galaktosidase, klon yang mengandung sisipan "insert # pada gen lacF "insert akan merusak

reading %rame#, tidak akan sanggup lagi

memetabolisme G-gal dan akan nampak sebagai koloni putih pada pelat agar. Sedangkan koloni yang terligasi dan memiliki gen lacF yang %ungsional akan memetabolisme G-gal sehingga akan nampak sebagai koloni ber!arna biru.

0ntuk mengidentifkasi bagian yang menyandi protein pada suatu gen, diperlukan library dari sekuens DNA yang terekspresi. $ibrary ini dikenal sebagai c%NA library dan sebagai materi a!al digunakan m/NA ":ambar 1-=#. 0ntuk mengisolasi gen yang

menyandi en$im metabolisme di hati, maka digunakan m/NA yang dipurifkasi dari homogenat hati. *ateri ini akan mengandung

semua m/NA yang ada dalam hati. )eberapa m/NA berjumlah sangat banyak, jika m/NA in menyandi protein yang jumlahnya banyak dalam hati, sedangkan beberapa transkrip lain berjumlah sedikit. / kemudian digunakan untuk menyalin campuran m/NA ini menjadi rst-strand c%NA. cDNA ini kemudian dikonersi menjadi dsDNA dan diligasikan ke dalam ektor cloning menghasilkan c%NA library . Patut diingat bah!a cDNA library bersi%at khas untuk tiap  jaringan "tissue-specic#, karena setiap jaringan mengekspresikan

sekelompok gen yang berbeda. cDNA library juga bersi%at spesifk untuk tiap tahap perkembangan organisme.

Gam'a# 1* Pembuatan cDNA library. m/NA diisolasi dan diterjemahkan balik dengan /. 0ntai /NA didigesti habis, DNA untai tunggal "single stranded %NA/ss%NA# yang tersisa kemudian ditambah primer oligod dan DNA polimerase. Primer akan menempel pada ujung&ekor poli"A# cDNA dan kemudian diperpanjang

"ekstensi# oleh DNA polimerase. cDNA untai ganda diligasikan ke lengan λ phage yang selanjutnya diin%eksikan ke bakteri. ilter li%t dilakukan pada bakteri yang telah dilisis kemudian dihibridisasi

menggunakan probe yang sesuai. Setelah autoradiograf, plak yang sesuai diisolasi, phage dipurifkasi dan dikarakterisasi.

 6ika library sudah

diperoleh, tahap berikutnya adalah bagaimana

menemukan satu klon spesifk yang mengandung gen tertentu di antara jutaan klon. Hal ini dapat tercapai dengan cara menapis "screening# library . )akteri yang mengandung library ini disebar pada pelatagar dengan

densitas yang cukup rendah sehingga memungkinkan untuk

mengambil satu klon tunggal. Sebagai contoh, suatu phage library yang dibuat dari DNA genom manusia, ditanam dengan kerapatan 95.555 plak per pelat. Pada densitas ini, 85 pelat berarti

mengandung 1.555.555 klon. Sebagian dari koloni&plak pada pelat ditrans%er, sebagai salinan persis, ke flter nitroselulosa atau nilon menggunakan prosedur&lter lift I "diangkat dengan flter#. ilter ini kemudian diproses suapaya mengikat secara koalen DNA atau protein yang diekspresikan oleh plak&koloni yang ditrans%er. ilter kemudian diinkubasi dengan probe DNA yang dilabel radioakti% atau antibodi spesifk, yang akan menempel pada flter pada posisi klon yang mengandung DNA atau protein yang dicari. (lon yang sesuai tersebut kemudian diambil dari pelat agar aslinya berdasarkan posisi pada flter yang telah ditandai. DNA dalam klon kemudian dapat diamplifkasi "diperbanyak# dan diisolasi seperti yang telah diterangkan sebelumnya, yaitu dengan cara subkloning ke dalam ektor plasmid.

Selain dengan cara perbanyakan menggunakan ector kloning dalam sel hidup, DNA untai ganda dapat diperoleh dalam jumlah besar dan murni secara kimia dengan cara polymerase chain reaction "P/#. Sejumlah kecil DNA untai tunggal dapat disintesis dari nukleotida tunggal dengan bantuan oligonukleotida.

Olion"leoti%a.

Salah satu a!al kemajuan yang memba!a kita pada teknik P/ yang sekarang banyak digunakan adalah kemampuan untuk mensintesis secara kimia sepotong kecil DNA dengan urutan basa tertentu "oligonukleotida#. Proses ini dimulai dengan menempelkan basa 9J yang paling ujung dari suatu urutan DNA ke polimer padat pendukung. Setiap basa baru sesuai dengan urutan yang diinginkan ditambahkan pada gugus 2J H basa yang telah ditempelkan pada polimer pendukung, satu demi satu sampai seluruh urutan DNA tersintesis. Pada tiap siklus sintesis hanya satu basa yang

ditambahkan, yang sekaligus merupakan

langkah untuk mengontrol urutan basa oligonukleotida.

ligonukleotida konensional mengandung satu dari empat basa DNA pada satu posisi. Namun, bisa saja prosedur diatur agar dapat digunakan nukleotida yang lain "misalnya inosin#, nukleotida yang dimodifkasi "ditandai dengan 'uorescent atau digoksigenin#, atau lebih dari satu macam basa pada satu posisi "degenerate

oligonukleotides#.

Polymerase Chain Reaction (P+R).

Dari suatu campuran DNA yang kompleks, P/

memungkinkan peneliti untuk membuat sejumlah besar DNA

dengan urutan basa tertentu dalam !aktu yang singkat dan tanpa kloning. Prosedur ini menggunakan DNA polimerase yang

tahan panas "thermostable# dan dua primer oligonukleotida sintetik ":ambar 1-K#. 0rutan DNA gen yang akan diamplifkasi

membatasi ujung DNA target dapat disintesis. Prosedur P/ dapat terdiri dari 2 tahap; "1# denaturasi DNA untai ganda, "8#

menempelkan primer ke DNA "annealing#, dan "2# memperpanjang primer "extension#. Selama denaturasi, pemanasan "?-C°#

digunakan untuk memisahkan kedua untai DNA target menjadi untai tunggal. 0ntai tunggal ini kemudian siap dihibridisasikan dengan oligonukleotida yang sesuai pada proses annealing jika temperatur diturunkan sampai di ba!ah titik leleh hibrid oligonukleotida-DNA "biasanya sekitar 95-=C°#. Setelah primer menempel, DNA

polimerase "aL polimerase dari bakteri hermophilus auaticus# dapat menyalin urutan DNA untai tunggal pada K8°, jika tersedia deoksinukleotida tri%os%at "dNP#. Setiap untai DNA target yang

telah ada sejak a!al akan disalin dan jumlah DNA akan menjadi dua kali lipat pada akhir tiap siklus. 6adi, setelah 89-25 siklus, urutan DNA yang diinginkan dapat diperbanyak sampai jutaan kali lipat. DNA sejumlah ini memungkinkan untuk dilihat "isualisasi# langsung sebagai pita "band# pada gel agarose, dan lebih dari cukup untuk melakukan cloning atau sekuensing DNA. Perubahan temperatur berturutturut yang diperlukan untuk melakukan P/ ini dilakukan pada mesin thermocycler . Satu P/ biasanya selesai dalam !aktu 1-2 jam, dan oleh karena itu merupakan metode tercepat untuk membuat DNA tertentu untuk studi lebih lanjut. (eterbatasan P/ antara lain adalah misinkorporasi "salah menambahkan# nukleotida oleh en$im aL polimerase "a error # dan ketidakmampuan untuk mengamplifkasi %ragmen DNA yang besar "aL generasi baru

mampu mengamplifkasi 485 kb#. *odifkasi a dengan tingkat fdelitas tinggi akan mengurangi kesalahan P/ dan meningkatkan kemampuan amplifkasi.

Aplikasi P/ bermacam-macam, antara lain; "1# untuk mengamplifkasi DNA pada daerah tertentu sebagai strategi

rekayasa genetik yang tidak tergantung pada en$im restriksi, "8# memperbanyak DNA genom untuk keperluan diagnostik, "2#

memnyisipkan&membuat mutasi "site directed mutagenesis#, "9# dikombinasi dengan /, untuk mengkuantifkasi jumlah m/NA a!al "/-P/#.

Gam'a# 1/ /eaksi P/. etakan DNA, primer A dan ), dan DNA polimerase "a# dikombinasi dalam reaksi siklus berulang mengikuti temperatur denaturasiannealing-ekstensi, yang

mengamplifkasi DNA pada daerah yang dibatasi oleh pasangan primer A dan ).

Site-directed mutagenesis.

P/ telah sangat memudahkan site-directed mutagenesis "!alaupun ada

 juga prosedur lain untuk membuat mutasi&mutagenesis#. *ite-directed mutations "mutasi yang dibuat pada tempat yang ditentukan# mempunyai banyak aplikasi, termasuk untuk studi struktur-%ungsi reseptor, transcription factors, en$im, dan %aktor transkripsi lainnya. *ite-directed mutations juga dapat dilakukan terhadap elemen regulasi suatu gen untuk mengubah tempat

pengikatan transcription factor dan menguji pengaruhnya terhadap %ungsi promotor. *ite-directed mutations juga membantu rekayasa genetik karena memungkinkan untuk

*utagenesis biasanya berupa substitusi satu nukleotida, !alaupun bisa juga dilakukan untuk mengubah beberapa pasang basa sekaligus "termasuk delesi anatu insersi kecil#. Protokol yang banyak digunakan adalah membuat mutasi dengan cara

perpanjangan yang kemudian saling menumpuk "o+erlap extension mutagenesis# ":ambar 1- C#. Pada prosedur ini, mutagenesis

dilakukan dengan

membuat primer oligonukleotida yang komplemen terhadap DNA normal kecuali pada posisi basa mutan, yang biasanya diposisikan di dekat ujung 9J oligonukleotida untuk menjamin priming. Dengan

P/, primer mutan diinkorporasikan ke dalam DNA yang baru

disintesis. Selanjutnya, DNA hasil P/ "yang sekarang mengandung mutasi# digunakan untuk memulai P/ kedua bersama-sama

dengan primer

oligonukleotida yang baru. Setelah beberapa siklus P/ akan diperoleh cetakan mutan yang

panjang yang dapat diperbanyak

dengan P/ tradisinal. )eberapa ariasi strategi ini dibicarakan pada

pustaka yang tercantum. Gam'a# 10

*ite-directed mutagenesis. Primer mutan "tanda bintang# dan primer 2J normal digunakan untuk mengamplifkasi cDNA. Hasil reaksi digunakan untuk mengamplifkasi cetakan bersam-sama dengan primer 9J normal. /eaksi ini akan menghasilkan cDNA termutasi yang dapat diamplifkasi dengan primer norma

D. An*lisis DNA +*n RNA

Pemisahan DN dan RN berdasarkan ukuran dengan elektroforesis pada berbagai sistem gel merupakan teknik dasar yang penting dalam biologi molekuler. Pada p% netral, DN dan RN bermuatan negatif dan akan bermigrasi ke arah anoda. &ika migrasi dilakukan  pada matriks polimer 'gel(, fragmen kecil akan bergerak lebih cepat daripada fragmen yang  besar ')ambar *-+(. Dengan demikian, migrasi elektroforetik melalui gel akan memisahkan campuran fragmen DN sehingga Nampak sebagai pita-pita yang berbeda ukurannya. anyak matriks gel yang dapat dignakan untuk pemisakhan asam nukleat, tapi yang paling  banyak digunakan adalah gel agarose dan poliakrilamid. )el agarose sesuai untuk pemisahan

fragmen DN yang berukuran .*-+ kb, sedangkan poliakrilamid untuk fragmen Dna  berukuran .+-+ kb. Denaturan seperti urea dapat ditambahkan pada gel poliakrilamid untuk dapat memisahkan fragmen DN sampai pada tingkat resolusi * pb 'misalnya untu/  sekuensing DN(. $alah satu jenis elektroforesis gel agarose adalah pulsed field gel electrophoresis 'P0)1( yang digunakan untuk memisahkan fragmen DN yang sangat besar  'lebih dari * kb(. 2ntuk melihat fragmen DN setelah dipisahkan dengan elektroforesis gel digunakan teknik lain. &ika fragmen DN cukup banyak, gel dapat langsung di3arnai 'staining( selama atau setelah elektroforesis sehingga DN dapat langsung dilihat. 1thidium  bromide mengikat DN dan akan berfluoresensi#berpendar merah diba3ah sinar 24. &ika  jumlah DN terlalu sedikit untuk di!isualisasi langsung, radioaktif digunakan untuk 

mendeteksi 'lihat hibridisasi(. Hi1i+is*si *s*m nukle*,(

 %ibridisasi asam nukleat adalah salah satu metode analisis yang paling sering digunakan. 5eknik ini digunakan untuk $outhern blotting, Northern blotting dan untuk skrining library. 5ujuan metode ini adalah untuk melihat '!isulisasi( sekuens asam nukleat tertentu 'DN atau RN( dalam lingkungan#latar belakang campuran sekuens lain yang kompleks. 5eknik ini memanfaatkan sifat DN yaitu dua untai asam nukleat yang komplemen akan saling mengikat 'hibridisasi( dengan tingkat spesifisitas yang tinggi. $ebaliknya, sekuens asam nukleat yang nonkomplemen tidak berikatan secara spesifik, mismatch nukleotida menurunkan temperatur#titik leleh. 2ntuk mendeteksi DN atau RN tertentu dalam suatu campuran yang kompleks, isi campuran harus diimobilisasi pada membran dan diubah menjadi bentuk untai tunggal 'lihat $outhern dan Northern blotting(. 6arutan hibridisasi yang mengandung probe untai tunggal yang dilabel radioaktif ditambahkan agar terjadi hibridisasi  pada kondisi tertentu. 5emperatur dan konsentrasi garam pada larutan hibridisasi menentukan

akan mengikat sekuens target yang benar-benar cocok. $etelah hibridisasi, kelebihan probe yang tidak terikat dicuci, sinyal radioaktif akan terdeteksi pada lokasi di mana sekuens target terletak. $inyal radioaktif di!isualisasi dengan mengeksposkan pada fim 7-ray menghasilkan titik atau pita hitam pada tempat radioaktif.

Sou,hen 1lo,,in=(

/etika DN genom didigesti dengan endonuklease restriksi dan dipisahkan dengan elektroforesis gel, fragmen indi!idual tidak akan dapat dilihat, bahkan jika digunakan DN dalam jumlah besar. /arena kompleksnya DN genom, digesti dengan en"im restriksi yang di!isualisasi dengan ethidium bromide akan menghasilkan pola 8smear9 yang tercipta dari ribuan fragmen DN. 2ntuk mendeteksi fragmen tertentu pada 8smear9 tersebut digunakan teknik hibridisasi dengan probe radioaktif yang la"im dikenal sebagai $outhern blotting 'diambil dari nama penemunya 1d $outhern( ')ambar *-:(. $outhern blotting dimulai dengan pemisahan elektroforesis gel fragmen DN yang telah didigesti dengan en"im  pemotong. DN kemudian didenaturasi 'dipisahkan menjadi + untai tunggal( dengan  perlakuan alkali, selanjutnya untai tunggal ditransfer ke membran melalui transfer kapilaritas. DN akan terikat pada secara ko!alen pada membran dan diimobilisasi pada fase padat, menghasilkan replika fragmen pada gel. 0ragmen DN spesifik pada membran dapat diidentifikasi dengan hibridisasi menggunakan probe yang spesifik untuk fragmen gen yang dikehendaki.

No,hen 1lo,,in=(

Pemisahan gel dan hibridisasi asam nukleat dapat juga untuk analisis RN menggunakan  prosedur Northern blotting '5abel *-+(. eberapa hal yang membedakan dengan $outhern  blotting adalah; '*( RN jauh lebih rentan terhadap degradasi dibanding DN, oleh karena itu elektroforesis dilakukan dalam bufer yang mengandung "at kimia yang bersifat melindungi 'biasanya formaldehid(, '+( RN sudah berupa untai tunggal dan membutuhkan kondisi denaturasi yang lebih ringan, '<( RN biasanya berukuran tertentu sehingga tidak  memelukan digesti en"im untuk memperoleh pola pita. /edua prosedur sangat mirip karena setelah elektroforesis RN juga ditransfer ke membran melalui difusi kapilaritas. iasanya sinar 24 digunakan untuk mengikat 'crosslink( RN pada membran sehingga tidak bergerak  'imobilisasi(.

Sekuensin= DNA

Penentuan urutan nukleotida merupakan analisis DN yang paling detil. da beberapa teknik  untuk sekuensing DN, tetapi metode penghentian rantai dengan dideoksi 'dideo=y chain termination( yang dikembangkan oleh $anger adalah metode yang paling banyak digunakan ')ambar *-*(. DN mula-mula harus didenaturasi dan dipisahkan menjadi untai tunggal dengan cara pemanasan. $atu primer oligonukleotida yang dilabel radioaktif kemudian ditambahkan ke dalam reaksi dan akan menempel pada sekuens pasangannya pada DN target. DN polimerase digunakan untuk menyalin DN untai tunggal. dN5P dalam jumlah  banyak 'sampai jenuh( hanya akan menghasilkan produk ekstensi dengan ujung terlabel

radioaktif, tapi tidak menghasilkan informasi urutan basa. Penambahan sedikit ddN5P ke dalam campuran dN5P akan dapat memberikan informasi urutan basa DN. Dideoksinukleotida akan terinkorporasi pada ujung <9 untai DN yang baru disintesis. DN  polymerase tidak dapat menambahkan basa baru pada ddN5P. Dengan demikian, inkorporasi ddN5P mengakibatkan penghentian sintesis rantai DN. Penambahan dN5P dan ddN5P dengan rasio yang tepat memungkinkan untuk menghentikan sintesis rantai DN pada tiap  posisi nukleotida. $ebagai contoh, jika ektensi primer dilakukan menggunakan d5P, d55P, d)5P dann dd>5P, polymerase akan mensintesis untai DN baru sampai dia harus menggunakan dd>5P 'misalnya ketika basa komplemennya )(. dd>5P akan terinkorporasi, dan pada titik ini DN polimerase tidak akan dapat melanjutkan kstensi. Dengan demikian,  panjang produk hasil ekstensi yang terlabel radioaktif menentukan osisi ) pertama yang disalin. 2ntuk menentukan posisi ) yang lain, bukan hanya ) yang pertama, reaksi sekuensing yang sebenarnya dilakukan dengan menggunakan campuran d>5P dan dd>5P dengan perbandingan ?+;*. Pada kondisi ini kemungkinan terjadi penghentian rantai DN adalah ?*;+ yang terjadi ketika terdapat ) pada DN yang disekuensing. kan diperoleh  produk ekstensi dengan berbagai panjang, yang dapat di!isualisasi setelahelktroforesis pada

gel poliakrilamid. erdasarkan pada panjang produk, maka tiap fragmen akan menentukan  posisi satu ). 2ntuk menentukan posisi keempat basa, empat reaksi sekuensing dilakukan

untuk tiap sampel. Pada tiap reaksi dicampurkan dN5P dan ddN5P yang sesuai dikombinasi dengan < dN5P lainnya dalam konsentrasi jenuh. /eempat reaksi kemudian dielektroforesis  bersebelahan pada gel 'poliakrilamiddenaturasi( sekuensing sehingga hasil sekuens DN

dapat langsung dibaca. $ecara teoritis sekuensing DN nampaknya cukup rumit, tapi sebenarnya pada kenyataannya relatif sangat mudah. 5eknologi modern telah memungkinkan untuk melakukan otomasisasi sekuensing DN. 2ntk skala besar, robot dapat digunakan

untuk menyiapkan reaksi sekuensing. @ang lebih penting adalah peralatan yang ada saat ini telah memungkinkan kita untuk dapat membaca hasil sekuensing secara langsung dan sekaligus dapat menyimpan data ke dalam database komputer. $elain mengurangi kerja manusia, otomasisasi demikian juga mengurangi faktor kesalahan yang sering terjadi dalam  pembacaan dan pemulisan urutan DN secara manual. /ebanyakan mesin sekuensing sekarang menggunakan fluorescent 'cat yang berfluoresensi( sebagai pengganti radioaktif. >at ini dapatdiinkorporasikan ke dalam primer sekuensing atau ke dalam nukleotida. $eperti  pada sekuensing manual, elektroforesis gel 'atau elektroforesis kapiler( digunakanuntuk 

memisahkan fragmen DN berdasrkan ukurannya.%anya saja pada sekuensing otomatis deteksi fragmenDN yang berfluoresensi dilakukan dengan bantuan sinarlaser dan sinyal diproses oleh komputer.

Metode sekuensing otomatis lainnya sedang dikembangkan, termasuk penggunaan chips DN. Pada strategi ini sejumlah besar nukleotida yang diatur dan dilekatkan pada chips DN. %ibridisasi fragmen DN pada chips memungkinkan detesi sekuens yang o!erlap yang dapat diubah menjadi sekuens DN yang terhubung 'nyambung(. 5eknologi ini terutama akan sangat berguna untuk mendeteksi polimorfisme dan mutasi,karena sekuens yang telah diketahui dapat dilekatkan pada chips dengan !ariasi tertentu pada tiap nukleotida

Ekspesi Rekom1in*n Po,ein

/emampuan untuk mengekspresikan protein rekombinan dalam jumlah besar adalah salah satu manfaat yang dapat diperoleh dari kloning cDN. anyak sekali kegunaan praktis dari protein rekombinan '5abel *-A(. $alah satunya adalah sebagai sumber reagen 'misalnya en"im restriksi( yang tidak akan habis dan merupakan sumber yang tidak ternilai untuk  hormon dangro3th factors 'misalnya insulin manusia dan eritropoietin( yang sulit diperoleh dari sumber alaminya. /etersediaan protein rekombinan dalam jumlah besar juga sangat membantu dalam studi biofisik dan analisis struktur dan fungsi protein.

T*nsl*si in )i,o >in )i,o ,*nsl*,ion? po,ein

rekombinan da banyak metode dan hospes 'pejamu( untuk mengekspresikan protein rekombinan, dan hanya beberapa akan dibahas berikut ini. >ara yang paling sederhana untuk  mengekspresikan protein rekombinan adalah dengan in !itro translation menggunakan lisat retikulosit 'reticulocyte lysates(. Dengan cara ini, mRN 'biasanya ditranskripsikan secara in !itro dari cDN yang diklon dalam plasmid( diterjemahkan 'translasi( menggunakan ribosom

yang ada dalam lisat retikulosit. Balaupun proteinnya tidak berjumlah banyak, protein tersebut dapat dilabel dengan asam amino radioaktif 'misalnya <$-metionin(. Protein yang ditranslasikan secara in !itro dapat digunakan sebagai substrat untuk en"im-en"im, reaksi katalisis, imunopresipitasi, uji interaksi DN-protein, dan lain-lain.

Ekspesi po,ein ekom1in*n +*l*m E( ;oli

1. coli adalah salah satu hospes pertama yang digunakan dan akan tetap menjadi sumber yang penting untuk mengekspresikan protein rekombinan. 1. coli paling baik  digunakan untuk ekspresi protein intraseluler yang relati!e kecil dan tidak memerlukan modifikasi pascatranslasi 'posttraslational modification( yang terlalu banyak untuk dapat  berfungsi. Protein diekspresikan dengan bantuan !ektor plasmid untuk ekspresi, yang banyak  diantaranya dapat diinduksi dengan pemberian reagen seperti CP5) 'yang akan melepas represi promotor( untuk mengasilkan ekspresi dalam jumlah tinggi sebelum kemudian dipurifikasi. Melekatkan protein tertentu pada molekul lain misalnya  galaktosidase kadang-kadang dapat lebih menstabilkan protein, yang jika tidak dilekatkan mungkin akan terdegradasi dalam 1. coli. %al umum lain yang juga dapat dilakukan adalh dengan menambahkan label#marka 'tag( yang telah dipurifikasi kepada protein yang diekspresikan untuk memudahkan menemukan#mengisolasi protein setelah diekspresikan. Marka yang  banyak digunakan adalah glutation-$transferase ')$5( yang dapat diisolasi menggunakan kolom glutation atau marka histidin untuk isolasi menggunakan kolom nikel. $alah satu keuntungan sistem ekspresi pada 1. coli adalah mudah untuk melakukan manipulasi DN rekombinan 'mirip seperti kloning plasmid( dan proses seleksi dan ekspresi yang cepat. . /erugiannya adalah ketidakmampuan untuk melakukan prosesing kompleks seperti glikosilasi, dan bah3a beberapa protein bersifat labil 'atau toksik( pada hospes. $elain itu,  protein yang besar biasanya tidak diproduksi atau tidak terlipat 'folding( dengan efisien.

Ekspesi po,ein ekom1in*n +en=*n 1*n,u*n 1*;ulo)ius .

1kspresi yang dibantu oleh baculo!irus dalam sel serangga adalah satu cara lain yang umum digunakan untuk ekspresi protein rekombinan. Dengan cara mentransfer plasmid yang mengandung cDN yang dikehendaki, terjadi rekombinasi dengan DN baculo!irus dalam sel $f: sehingga sekuens DN yang menyandi protein mantel !irus 'coat protein( utama,  polyhedrin, diganti dengan protein yang dikehendaki. Dengan cara ini akan dihasilkan ekspresi protein rekombinan dalam jumlah tinggi. $el $f: dapat melakukan glikosilasi '3alaupun secara struktural berbeda dengan sel mamalia(, dan dapat mengekspresikan lebih

dari satu proteinbersama-sama sekaligus 'misalnya imunoglubulin(. Protein rekombinan  biasanya akan terlokalisasi seperti pada sel normal 'misalnya reseptor pada membran, ranscription factors pada nukleus(, 3alaupun tingkat ekspresi yang tinggi akhirnya dapat mengganggu pola ini. 5ingkat ekspresi yang tinggi akan memudahkan purifikasi, kecuali jika terjadi agregasi. Namun, untuk melakukan seleksi dan rekombinasi sejumlah besar protein mutan pada sistem ini masih agak sulit. 1kspresi pada galur sel mamalia. anyak protein memerlukan ekspresi memggunakan sistem sel mamalia. Balaupun sistem ini sangat jarang dapat menproduksi protein seefisien 1. coli atau aculo!irus, salah satu kelebihannya adalah mampu memproses polipeptida kompleks menggunakan mesin intraseluler yang sesuai. $elain segi prosesing peptida, folding, atau glikosilasi yang dapat dilakukan dengan tepat, untuk mengekspresi protein tertentu seringkali diperlukan kondisi yang hanya dapat dicapai dengan menggunakan sel homolog atau jaringan khusus 'tissue specific(. $ebagai contoh, untuk mempelajari beberapa reseptor atau transcription factors maka perlu dilakukan ekspresi  protein tersebut pada sel yang mengandung cofaktor atau target yang sesuai. 2ntuk 

mammalian cell lines, ekspresi cDN biasanya diatur dengan promotor yang kuat dari suatu !irus. $ebagai alternatif, telah dikembangkan !ektor ekspresis yang dapat diinduksi yang memungkinkan untuk melakukan seleksi klonal yang kemudian diikuti dengan induksi  promotor dengan cara menambahkan 'atau menghilang( rea gen tertentu 'misalnya tetrasiklin( yang dapat memodulasi akti!itas promotor. Protein yang mengandung leader seEuence dapat disekresikan ke dalam media. %al ini mengakibatkan pengenceran konsentrasi protein, namun kontaminan media ekstraseluler akan jauh lebih sedikit daripada intraseluler sehingga isolasi dan purifikasi protein yang bersangkutan akan lebih mudah.

Ekspesi men==un*k*n )ek,o *+eno)ius

anyak !irus digunakan untuk ekspresi pada sel mamalia, memanfaatkan sifat tropisme alami !irus dan kemampuan !irus untuk menginduksi perubahan mesin sintesis intraseluler sehingga menghasilkan tingkat ekspresi yang tinggi. 4ektor adeno!irus sangat menarik karena telah menginfeksi berbagai macam sel mamalia dan karena genom adeno!irus telah dapat diubah menghasilkan !irus yang tidak mapu-replikasi dan dapat memba3a sekuens manusia. deno!irus telah bnayak digunakan untuk mengekspresikan  protein rekombinan pada sel dan jaringan yang sulit ditransfek. Penggunaan adeno!irus sebagai !ektor untuk terapi gen juga menjadikan sistem ini sangat menarik untuk ekspresi gen. Dengan menghilangkan gen-gen kunci adeno!irus, !irus yang dusah dimodifikasi ini dapat berfungsi sebagai pemba3a gen mamalia. Memasukkan !ektor !irus yang mengandung

gen yang dikehendaki ke dalam sel +:< yang mengekspresikan 1*a memungkinkan untuk  mengemas dan memanen !irus serta !irus tidak ber-replikasi pada sel lain. 4ektor adeno!irus telah digunakan untuk mengekspresikan gennormal pada organ yang defektif 'misalnya ekspresi >05R pada penderita cystic fibrosis(, untuk mengekspresikan gen yang toksik pada tumor 'misalnya timidin kinase pada tumor otak(, dan untuk mentarget gen cell-cycle arrest  pada sel !askuler yang sedang berproliferasi. /eterbatasan adeno!irus antara lain ketidakmampuannya untuk menerima DN asing F* kb,jangka 3aktu ekspresinya relatif   pendek in !i!o 'beberapa minggu sampai bulan(,toksik terhadap sel, dan menginduksi respon

imun. eberapa sistem pemba3a !irus lain sedang dikembangkan termasuk denoassociated !irus, %erpes dan retro!irus 'yang berintegrasi ke dalam genom hospes(. 4aksin !irus juga digunakan untuk mengekspresikan protein rekombinan dalam cell lines, misalnya sel %e6a, sebagai mekanisme yang efisien untuk ekspresi gen pada galur sel mamalia.

Sis,em l*in un,uk ekspesi po,ein ekom1in*n

anyak sistem lain yang digunakan tapi tidak akan dibahas di sini, antara lain  produksi dalam susu binatang, Drosophila, ragi dan tanaman

Sistem Es-#esi P#otein

(emampuan untuk mengekspresikan proteinrekombinan dalam jumlah besar adalah salah satu man%aat yang dapat diperoleh dari kloning cDNA. )anyak sekali kegunaan praktis dari protein rekombinan. Salah satunya adalah sebagai sumber reagen "misalnya en$im restriksi# yang tidak akan habis dan merupakan sumber yang tidak ternilai untuk hormon dan gro!th %actors "misalnya insulin manusia dan eritropoietin# yang sulit diperoleh dari sumber alaminya. (etersediaan protein rekombinan dalam  jumlah besar juga sangat membantu dalam studi biofsik dan analisis

struktur dan %ungsi protein.

Translasi in vitro (in vitro translation) protein rekombinan

Ada banyak metode dan hospes "pejamu# untuk mengekspresikan protein rekombinan, dan hanya beberapa akan dibahas berikut ini. ara yang paling sederhana untuk mengekspresikan protein rekombinan adalah dengan in +itro translationmenggunakan lisat retikulosit "reticulocyte lysates#.

Dengan cara ini, m/NA "biasanya ditranskripsikan secara in itro dari cDNA yang diklon dalam plasmid# diterjemahkan "translasi# menggunakan ribosom yang ada dalam lisat retikulosit. Malaupun proteinnya tidak berjumlah banyak, protein tersebut dapat dilabel dengan asam amino radioakti% "misalnya 29S-metionin#. Protein yang ditranslasikan secara in itro dapat digunakan sebagai substrat untuk en$im-en$im, reaksi katalisis, imunopresipitasi, uji interaksi DNA-protein, dan lain-lain.

kspresi protein rekombinan dalam . Coli 

. coli adalah salah satu hospes pertama yang digunakan dan akan tetap menjadi sumber yang penting untuk mengekspresikan protein rekombinan. . coli paling

baik digunakan untuk ekspresi protein intraseluler yang relati%  kecil dan tidak memerlukan modifkasi pascatranslasi

" posttraslational

modication# yang terlalu banyak untuk dapat ber%ungsi. Protein diekspresikan dengan bantuan ektor plasmid

untuk ekspresi, yang banyak diantaranya dapat diinduksi dengan pemberian reagen seperti EP: "yang akan melepas represi promotor# untuk mengasilkan ekspresi dalam jumlah tinggi sebelum kemudian dipurifkasi. *elekatkan protein tertentu pada molekul lain misalnya  galaktosidase kadang-kadang dapat lebih menstabilkan protein, yang jika tidak dilekatkan mungkin akan terdegradasi dalam . coli.

Hal umum lain yang juga dapat dilakukan adalah dengan menambahkan label&marka "tag# yang telah dipurifkasi kepada protein yang diekspresikan untuk memudahkanmenemukan&mengisolasi protein

setelah diekspresikan.*arka yang banyak digunakan adalah glutation-Strans%erase ":S# yang dapat diisolasi menggunakan kolom glutation atau marka histidin untuk isolasi menggunakan kolom nikel. Salah satu keuntungan sistem ekspresi pada . coli adalah mudah untuk melakukan manipulasi DNA rekombinan "mirip sepertikloning plasmid# dan proses seleksi dan ekspresi yang cepat. (erugiannya adalah ketidakmampuan untuk melakukan prosesing kompleks seperti glikosilasi, dan bah!a beberapa protein bersi%at labil "atau toksik# pada hospes. Selain itu, protein yang besar biasanya tidak diproduksi atau tidak terlipat "%olding# dengan efsien.

kspresi protein rekombinan dengan bantuan Saccharomyces cerivisiae

Sistem genetik yang sangat berkembang, penggunaannya mudah, berkurangnya !aktu dan biaya membuat *. "ere+isiae menjadi organisme yang menarik untuk diekspresikan dan memproduksi protein rekombinan. /agi mampu memba!a plasmid yang dirancang khusus dan kemampuan ini ber%ungsi dalam sistem ekspresi protein rekombinan. Plasmid terdiri dari situs restriksi yang dapat digunakan untuk memasukkan urutan gen yang diinginkan. rans%ormasi dari ragi dengan plasmid menghasilkan

protein yang diinginkan dan dapat

ditingkatkan.

kspresi protein rekombinan dengan bantuan baculovirus

kspresi yang dibantu oleh baculoirusdalam sel serangga adalah satu cara lain yang umumdigunakan untuk ekspresi protein rekombinan. Dengancara mentrans%er plasmid yang mengandung cDNA yangdikehendaki, terjadi rekombinasi dengan DNA baculoirusdalam sel S% sehingga sekuens DNA yang menyandiprotein mantel irus "coat protein# utama, polyhedrin,diganti dengan protein yang dikehendaki. Dengan caraini akan dihasilkan ekspresi protein rekombinan dalamjumlah tinggi. Sel S% dapat melakukan glikosilasi"!alaupun secara struktural berbeda dengan sel mamalia#,dan dapat mengekspresikan lebih dari satu

proteinbersama-sama sekaligus "misalnya imunoglubulin#.Protein rekombinan biasanya akan terlokalisasi sepertipada sel normal "misalnya reseptor pada membran,transcription %actors pada nukleus#, !alaupun tingkatekspresi yang tinggi akhirnya dapat mengganggu pola ini.ingkat ekspresi yang tinggi akan memudahkan purifkasi,kecuali jika terjadi agregasi. Namun, untuk melakukanseleksi dan rekombinasi sejumlah besar protein mutanpada sistem ini masih agak sulit.

kspresi pada galur sel mamalia

)anyak protein memerlukan ekspresi memggunakan sistem sel mamalia. Malaupun sistem ini sangat jarang dapat menproduksi protein seefsien . coli atau

)aculoirus, salah satu kelebihannya adalah mampu memproses polipeptida kompleks menggunakan mesin intraseluler yang sesuai. Selain segi prosesing peptida, %olding, atau glikosilasi yang dapat dilakukan dengan tepat, untuk mengekspresi protein tertentu

seringkali diperlukan kondisi yang hanya dapat dicapai dengan menggunakan sel homolog atau jaringan khusus "tissue specifc#. Sebagai contoh, untuk mempelajari beberapa reseptor atau transcription %actors maka perlu dilakukan ekspresi protein tersebut pada sel yang mengandung co%aktor atau target yang sesuai.

0ntuk mammalian cell lines, ekspresi cDNA biasanya diatur dengan promotor yang kuat dari suatu irus. Sebagai alternati%, telah dikembangkan ektor ekspresis yang dapat diinduksi yang memungkinkan untuk melakukan seleksi klonal yang kemudian diikuti dengan induksi promotor dengan cara menambahkan "atau menghilang# reagen tertentu "misalnya tetrasiklin# yang dapat memodulasi aktiitas promotor. Protein yang mengandung leader seLuence dapat disekresikan ke dalam media.

Hal ini mengakibatkan pengenceran konsentrasi protein, namun kontaminan media ekstraseluler akan jauh lebih sedikit daripada intraseluler sehingga isolasi dan purifkasi protein yang bersangkutan akan lebih mudah.

kspresi menggunakan vektor adenovirus

)anyak irus digunakan untuk ekspresi pada sel mamalia, meman%aatkan si%at tropisme alami irus dan kemampuan irus untuk menginduksi perubahan mesin sintesis intraseluler sehingga menghasilkan tingkat ekspresi yang tinggi. 7ektor adenoirus sangat menarik karena telah mengin%eksi berbagai macam sel mamalia dan karena genom adenoirus telah dapat diubah menghasilkan irus yang tidak mapu-replikasi dan dapat memba!a sekuens manusia. Adenoirus telah banyak digunakan untuk mengekspresikan protein rekombinan pada sel dan  jaringan yang sulit ditrans%er.

Penggunaan adenoirus sebagai ektor untuk terapi gen juga menjadikan sistem ini sangat menarik untuk ekspresi gen. Dengan menghilangkan gen-gen kunci adenoirus, irus yang susah dimodifkasi ini dapat ber%ungsi sebagai pemba!a gen mamalia. *emasukkan ektor irus yang mengandung gen yang dikehendaki ke dalam sel 82 yang mengekspresikan 1a memungkinkan untuk mengemas dan memanen irus serta irus tidak ber-replikasi pada sel lain. 7ektor adenoirus telah digunakan untuk mengekspresikan gen normal pada organ yang de%ekti%  "misalnya ekspresi / pada penderita cystic fbrosis#, untuk mengekspresikan gen yang toksik pada tumor "misalnya timidin kinase pada tumor otak#, dan untuk mentarget gen cell-cycle arrest pada sel askuler yang sedang berproli%erasi. (eterbatasan adenoirus antara lain ketidakmampuannya untuk menerima DNA asing O15 kb, jangka !aktu ekspresinya relati% pendek in io "beberapa minggu sampai bulan#, toksik terhadap sel, dan menginduksi respon imun. )eberapa sistem pemba!a

irus lain sedang dikembangkan termasuk Adenoassociated irus, Herpes dan retroirus "yang berintegrasi ke dalam genom hospes#. 7aksin irus  juga digunakan untuk mengekspresikan protein rekombinan dalam cell lines, misalnya sel He'a, sebagai mekanisme yang efsien untuk ekspresi gen pada galur sel mamalia.

Sistem lain untuk ekspresi protein rekombinan

)anyak sistem lain yang digunakan tapi tidak akan dibahas di sini, antara lain produksi dalam susu binatang, Drosophila, ragi dan tanaman.

PI$IAN OST UNTUK AMP$I2IKASI PROTEIN

Sistem host tersedia dalam beberapa bentuk termasuk %ag, bakteri, ragi, tumbuhan, jamur berserabut, serangga atau sel mamalia yang tumbuh dalam kultur dan he!an transgenik. Pilihan terakhir dari host akan bergantung pada persyaratan yang spesifk dan aplikasi untuk protein rekombinan. Pemilihan host tidak hanya mempengaruhi amplifkasi dan isolasi dari protein, tetapi juga cara dimana produk kemudian dapat dimurnikan. Dalam rangka untuk memutuskan host mana yang paling cocok dalam jumlah dan tingkat kemurnian produk serta integritas biologis dan potensi toksisitas sebaiknya dipertimbangkan. Sebagai contoh, system ekspresi bakteri tidak cocok jika modifkasi pasca-translasi diperlukan untuk menghasilkan produk rekombinan yang dapat ber%ungsi penuh.

'okasi produk dalam host akan mempengaruhi pilihan metode untuk isolasi dan pemurnian dari produk. Sebagai contoh, sebuah host bakteri dapat mensekresikan protein ke dalam media pertumbuhan, mentransportnya ke dalam ruang periplasmik atau menyimpannya sebagai badan inklusi yang tidak dapat larut dalam sitoplasma.

KE$EBIAN DAN KEKURANGAN PROTEIN REKOMBINAN (elebihan

)idang kesehatan 1. Produksi insulin

8. Penggunaan insulin untuk pasien diabetes dalam memproduksi insulin sangatlah banyak sehingga untuk mendapatkannya dibutuhkan inulin dari pankreas sapi atau babi yang cukup banyak pula. etapi dengan teknologi DNA rekombinan telah memungkinkan para ilmu!an untuk mengembangkan insulin manusia sintetis.

2. *utasi

*enggantikan gen yang rusak dengan gen yang sehat dilakukan dengan cara kloning untuk memperbanyak salinan. :en rusak oleh pasien disisipkan gen sehat untuk memulai %ungsi gen yang baru sehingga pasien dapat normal

?. (anker

(anker adalah penyakit yang berbahaya dapat menyebabkan kematian pada penderitanya, meskipun telah dilakukan kemoterapi tidak menutup kemungkinan untuk pasien menderita kanker tersebut kembali. De!asa ini, Para ilmu!an mencoba menganalisis dan mencari solusi pengobatan dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan untuk mencegah pertumbuhan sel yang tidak terkontrol.

9. 7aksin

DNA rekombinan juga telah mengembangkan aksin untuk penyakit seperti herpes, inuen$a, hepatitis dan penyakit menular lainnya. Enter%eron obat, yang digunakan untuk mengobati lim%oma dan leukemia myelogenous, juga merupakan hasil dari teknologi DNA rekombinan. 7aksin disisipkan pada produk tanaman seperti pada tanaman tomat atau kentang sehingga dalam proses pengiriman dan penyimpanan, dibandingkan dengan aksin injeksi.

)idang pertanian

1. (euntungan kepada petani yaitu dengan menekan pengeluaran biaya untuk pembelian pestisida. Selain itu, P/: juga mengurangi hilangnya pasar akibat penolakan konsumen atas komoditas yang tercemar oleh pestisida, serta dapat menekan rusaknya lingkungan akibat penggunaan pestisida yang berlebihan dalam pengendalian hama dan penyakit. Hasil penelitian menunjukkan bah!a penanaman ).t. corn dapat

secara nyata menekan aplikasi pestisida dan mengurangi hilangnya biaya pengendalian P

8. oleran terhadap jenis herbisida. DNA rekombinan memberikan keuntungan biaya dalam mengatasi gulma karena petani tidak memerlukan penggunaan herbisida dalam jumlah besar dengan berbagai jenis herbisida.anaman hasil rekayasa genetika tersebut resisten terhadap jenis herbisida,contohnya strain kedele hasil rekayasa genetika *osanto yang tidak memiliki e%ek negati% apabila diaplikasikan herbisida jenis /oundup.

2. ahan terhadap serangan penyakit tanaman. )eberapa cenda!an, irus, dan bakteri banyak menimbulkan kerugian. Para pakar ftopatologi telah banyak menemukan beberapa arietas tanaman hasil rekayasa genetika yang tahan terhadap seranagan penyakit.

?. pengembangan padi yang berisi tingkat peningkatan besi dan itamin, untuk digunakan di negara-negara Asia di mana kekurangan gi$i kronis adalah masalah. *enurut situs tersebut, daerah baru dalam pengembangan meliputi pisang yang memproduksi aksin untuk mencegah penyakit menular dan ternak yang tahan terhadap boine spongi%orm encephalopathy "penyakit sapi gila#

9. *eningkatkan efsiensi %otosintesis, sehingga hasil panen dengan mengkonersi tanaman 2 dan ? oleh rekombinasi genetik

Ke#"ian

)ahaya lingkungan

)ahaya lingkungan yang mungkin diakibatkan oleh penggunaan produk rekayasa genetika antara lain ;

1. (ekha!atiran etis

 eknologi ini juga menimbulkan kekha!atiran etis, terutama ketika gen manusia dimasukkan ke dalam organisme bukan manusia yang kemudian menjadi sebagian manusia. Di ina, DNA manusia sedang ditempatkan dalam tomat dan paprika untuk mempercepat pertumbuhan mereka. imbul pertanyaan; Apakah makan tomat yang mengandung DNA manusia membuat Anda kanibalB.

8. (ematian organisme bukan target. Hasil penelitian laboratorium menunjukkan bah!a arietas jagung ).t. telah menyebabkan kematian yang tinggi pada &monarc butter'y caterpillarsI meskipun serangga ini tidak menyerang tanaman jagung. Hal ini karena pollen  jagung ).t terba!a oleh angin ke tanaman milk,eed yang

merupakan inang &monarc butter'y caterpillarsI.

2. Penurunan e%ektiftas dari pestisida. Penggunaan tumbuhan yang tahan terhadap hama secara terus menerus dapat menstimulir munculnya gen-gen baru hama yang tahan&resisten terhadap beberapa jenis pestisida.

?. rans%er gen kepada spesies yang tidak menjadi target. (asus munculnya Isuper,eedsI yang sangat resisten terhadap herbisida akibat penggunaan rekayasa genetika "soybean roundup#. Hal ini terjadi karena adanya trans%er gen dari tumbuhan ke gulma.

:angguan kesehatan

:angguan kesehatan yang mungkin diakibatkan oleh penggunaan produk rekayasa genetika anatara lain;

1. penggunaan DNA rekombinan dalam produk makanan mengkha!atirkan %ek jangka panjang pada kesehatan manusia masih belum diketahui dan dipastikan keamanannya. *enurut pro%esor Enggris *ae Man-Ho, DNA rekombinan dapat membahayakan karena memasukkan gen asing ke dalam genom. hal ini dapat menimbulkan e%ek berbahaya dan %atal, termasuk kanker.

8. gangguan kesehatan bagi manusia, adalah Alergi. )eberapa produk makanan yang berasal dari hasil DNA rekombinan menimbulkan dampak alergi terhadap manusia. Entoduksi gen tertentu seperti gen kacang-kacangan ke dalam tanaman kedelai dapat menimbulkan reaksi allergi yang berpengaruh terhadap ketahanan tubuh.

2. Pengaruh lain yang belum diketahui. Pengaruh hasil DNA rekombinan terhadap kesehatan masih terus diteliti, akan tetapi berdasarkan penomena yang telah terjadi seperti kasus cross polinasi dan kasus alergisitas, para ahli berpendapat kemungkinan reaksi buruk yang lain dapat terjadi.

Pertimbangan ekonomi

Penggunaan dinilai tidak ekonomis dan merugikan petani, karena untuk menghasilkan membutuhkan biaya yang tinggi dan selanjutnya biasanya dipatenkan oleh penciptanya. )iaya penelitian dan hak paten Produk hasil DNA rekombinan akan dibebankan kepada pengguna "petani# melalui penjualan yang mahal. Selain itu, Produk hasil DNA rekombinan pada umumnya tidak menghasilkan keturunan dan digunakan hanya satu kali tanam. (ondisi ini tentunya menimbulkan ketergantungan yang tinggi petani terhadap benih oleh perusahaan penghasil .

PERBEDAAN BIOTEKNO$OGI KON3ENSIONA$ DAN MODERN

*enurut the 0nited Nation onention on )iological Diersity, terminologi bioteknologi diartikan sebagai teknologi aplikati% yang meman%aatkan sistem biologi, organisme-organisme hidup atau turunannya guna menyempurnakan produk atau proses untuk kepentingan spesifk.

Ada 8 jenis bioteknologi, yakni bioteknologi konensional "sederhana# dan bioteknologi modern.

)ioteknologi konensional menerapkan biologi, biokimia, atau rekayasa masih dalam tingkat yang terbatas. )ioteknologi konensional menggunakan jasad hidup secara utuh. )ioteknologi secara sederhana sudah dikenal oleh manusia sejak ribuan tahun yang lalu. Sebagai contoh, di bidang teknologi pangan adalah pembuatan bir, roti, maupun keju yang sudah dikenal sejak abad ke-1. Di bidang medis, penerapan bioteknologi di masa lalu dibuktikan antara lain dengan penemuan aksin, antibiotik, dan insulin !alaupun masih dalam jumlah yang terbatas akibat proses %ermentasi yang tidak sempurna.

)ioteknologi modern telah menggunakan teknik rekayasa tingkat tinggi dan terarah sehingga hasilnya dapat dikendalikan dengan baik.  eknik yang sering digunakan adalah dengan melakukan manipulasi genetik pada suatu jasad hidup secara terarah sehingga diperoleh hasil sesuai dengan yang diinginkan. Pada masa ini, bioteknologi berkembang

sangat pesat, terutama di negara negara maju. (emajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, rekombinan DNA, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain. eknologi ini memungkinkan untuk memperoleh penyembuhan penyakit-penyakit genetik maupun kronis yang belum dapat disembuhkan, seperti kanker ataupun AEDS. Dari hasil penelitian, ilmu!an memperkirakan lebih dari ?555 masalah kesehatan disebabkan atau ada keterkaitannya dengan gen manusia. Sebagian penyakit disebabkan oleh kelainan gen, yang lain bisa merupakan kombinasi kelainan genetik dan %aktor pola hidup&lingkungan. eknik yang digunakan dalam bioteknologi modern adalah teknik manipulasi bahan genetik "DNA# secara in itro, yaitu proses biologi yang berlangsung di luar sel atau organisme, misalnya dalam tabung percobaan. leh karena itu, bioteknologi modern juga dikenal dengan rekayasa genetika, yaitu proses yang ditujukan untuk menghasilkan organism transgenik. rganisme transgenik adalah organisme yang urutan in%ormasi genetik dalam kromosomnya telah diubah sehingga mempunyai si%at menguntungkan yang dikehendaki. )eberapa prinsip dasar dalam rekayasa genetika, yaitu DNA rekombinan, %usi protoplasma, dan kultur jaringan.

Pe#'e%aan Biotenoloi Kon4ensional %an Biotenoloi Mo%e#n 1. )ioteknologi (onensional

- 'angsung menggunakan makhluk hidup dan belum mengetahui penggunaan en$im

- anpa didasari prinsip ilmiah

- )erdasarkan keterampilan yang di!ariskan turun temurun - idak sepenuhnya diproduksi secara masal

- )ioteknologi yang menggunakan mikroorganisme untuk memproduksi alkohol, asam asetat, tempe, tahu, oncom, dll

8. )ioteknologi *odern

- *emakai makhluk hidup dan komponennya secara langsung - *enggunakan prinsip-prinsip ilmiah

- Hasil pengkajian berbagi disiplin ilmu yg mendalam - Diproduksi secara masal

- *engupayakan membuat produk dengan e%ekti% dan efsien

- Didasarkan pada manipulasi atau teknik DNA disamping menggunakan dasar mikrobiologi dan biokimia

- idak hanya digunakan pada industri makanan namun juga telah meliputi banyak bidang, seperti teknik genetik.

- Dengan beragamnya penelitian dan perkembangan keilmuan serta teknologi, keuntungan yang lebih besarpun didapatkan. ontoh

1. 7aksin

ontoh; 7aksin Hepatitis ) dan malaria. Secara konensional pelemahan kuman dilakukan dengan pemanasan atau pemberian bahan kimia. Dengan bioteknologi dilakukan %usi atau transplantasi gen.

8. Hormon

ontoh; Hormon Ensulin. Penderita penyakit Diabetes mellitus kekurangan hormon insulin sehingga kadar gula dalam darahnya sangat tinggi. Dengan adanya bioteknologi, saat ini hormon insulin telah dapat dihasilkan secara buatan "transgenik# dengan bantuan bakteri Escherichia coli. Pembuatan insulin dilakukan dengan menyisipkan gen insulin ke dalam bakteri. Pada sel bakteri . coli, dimasukkan DNA sel manusia yang mengandung gen insulin sehingga bakteri . coli dapat menghasilkan insulin. (arena bakteri dapat berkembang biak dengan cepat maka hormon insulin pun dapat dihasilkan dalam jumlah yang banyak. (ini, insulin mudah didapatkan oleh penderita diabetes mellitus dalam bentuk cair.

+onto5 P#o%" 2a#masi Be#'asis Biotenoloi

1. P#o%"si "man Tiss"e Plasminoen A&ti4ato# (tPa) -a%a tanaman Cucumis sativus

*erupakan salah satu dari empat jenis aktiator plasminogen "urokinase, streptokinase, tPa, dan DSPAQ1#. Diproduksi di dinding hati dan pada pembulu darah. *erupakan en$im dengan berat molekul K8kD dan tersusun dari 98K asam amino. *erupakan en$im yang terlibat dalam proses pemecahan gumpalan darah dengan mengkatalisis konersi plasminogen menjadi plasmin . Hasil rekombinannya banyak digunakan untuk pengobatan penyakit  jantung dan oklusi pembulu darah otak .

 Pa masih sangat dibutuhkan untuk pengobatan penyakit  jantung . (arena onset kerja tPa yang cepat dalam pengobatan. Hal itulah yang mendasari berkembangnya teknologi rekombinan untuk menghasilkan tPa dalam skala lebih besar.

Pada a!alnya tPa berasal dari ekstraksi Human )o!es *elanoma ells . Selanjutnya dikembangkan dengan teknik rekombinan pada  Aspergilus nidulans *el mamalia *el insekta *. "ere+isiae dan E. coli. Dengan adanya teknologi molekuler %arming dikembangkan lah rekombinan protein oada tanaman mentimun. *olekuler arming adalah suatu proses penggunaan tanaman dan he!an yang direkayasan secara genetis sebagai suatu materi baru dan termodifkasi (Da4ies an% +5am'e#s, !666)

Alasan dipilih teknik rekombinan dengan bantuan tanaman karena tanaman dapat memproduksi protein tanpa mengubah struktur asli tanaman. DNA yang mengandung tPa ditrans%er kedalam nukleus tanaman dengan bantuan Agrobacterium

(euntungan lain menggunakan tanaman adalah ;

•  anaman dapat memproduksi protein kompleks yang tidak dapat diproduksi oleh yeast atau bakteri

•  anaman dapat memproduksi protein dalam jumlah banyak pada jaringannya

• anaman dapat tumbuh pada skala pertanian yang cukup besar hanya dengan air, mineral dan cahaya matahari. Dibandingkan dengan kultiasi sel mamalia yang

membutuhkan proses yang lebih sulit dan mahal (No##is, !66)

Meto%oloi Penelitian

Plasmi% %an Bate#i

Dalam penelitian ini, cDNA dari gen tPA manusia ":ene )ank  6umlah aksesi E515?K# dengan Sac E dan )am HE situs restriksi di

kloning ke dalam ekspresi tanaman ektor p)E181 yang mengandung kembang kol mosaik irus promotor a*7 29S dan urutan terminator transkripsi "NS#, dan gen -glucuronidase. 0rutan (o$ak dan sinyal (D' melekat pada amino dan karboksi terminal gen PA masing-masing. tPA diamplifkasi dengan primer yang mengandung G)A E dan Hinc E situs restriksi -gagtctagataaacatggatgcaatgaagagaaccc-0 , termasuk urutan (o$ak sebelum kodon mulai menjadi primer "A#, dan -atagtcaactcatagctcatctttcggtcgcatgttg-0 , termasuk urutan (D' sebelum menghentikan kodon sebagai primer terbalik "/A#. (emudian dimasukkan ke dalam tanaman ektor biner p)E181 "diambil dari NE:)# di ba!ah kendali kembang kol irus mosaik promotor 29S dan NS terminator. )agian tengah gen ini diamplifkasi dengan dua primer "); 9J-ttgatgcgaaactgaggctg-2J dan /); 9J-cttctcagatttcgtgstacc-2J# dan konstruk akhir disebut sebagai p)EtPA. 1,K-kb polymerase chain reaction "P/# produk dimasukkan ke dalam dua a*729S dan NS terminator "dari gen nptEE# dan hilir dari ektor p)E181 dengan situs restriksi G)A E dan )am HE "selama subcloning dari p/8.1 di p)E181#. (emudian diisi ulang dengan DNA ? ligase.

Dalam percobaan ini, eksplan kotiledon tanaman mentimun "s%ahan arietas lokal# yang digunakan. )iji mentimun didesin%eksi. Setelah = hari, kotiledon diisolasi dari batang dengan melengkung dan dibagi menjadi 9<9-mm. 0ntuk memerifkasi regenerasi yang tepat, eksplan kotiledon tanaman mentimun ditempatkan pada media *S dengan hormon na%talen asetat "NAA# dan konsentrasi yang berbeda hormon purin amino ben$il ")AP#. 6uga, di tes lain, yang berbeda konsentrasi antibiotik kanamisin digunakan untuk menghilangkan sel non-transgenik. Dimurnikan dari scherichia coli, plasmid p)E181 "mengandung gen tPA# dipindahkan ke Agrobacterium ')A??5?. rans%ormasi gen tPA ke dalam eksplan kotiledon dari tanaman mentimun dilakukan melalui Agrobacterium dan metode manual.

Analisis P+R %an RTP+R

(arena tanaman resisten terhadap antibiotik kanamisin mungkin tidak benar untuk tanaman reansgenik-untuk contoh, sel-sel tumbuhan hanya menerima ektor "tanpa tPA gen# reaksi P/ digunakan untuk mengkonfrmasikan keberadaan gen. kstraksi DNA dari daun mentimun muda segar diregenerasi pada medium selekti% yang dilakukan melalui *etode A). (eberadaan gen tPA diselidiki dalam sel tumbuhan mentimun yang diregenerasi pada media selekti% dengan reaksi P/ dan tPA gen spesifk primer. 0rutan dari primer adalah sebagai berikut;

 -tPA; 9J:A:A:AAAAAA::A:AA:AA:A:A::: 2J /-tPA; 9JAA:AAAA:A:::A:: 2J

(ondisi yang diperlukan untuk proli%erasi DNA dari gen tPA termasuk denaturasi a!al 1C5s&95_{, 29 siklus denaturasi =5s&9}5_,

annealing 25s&=55_{, dan elongasi 185s&K8}5_{. Produk P/ diperiksa}

pada 13 gel agarose dan :elred. Daun muda mentimun transgenik dan larutan /NG-Plus "Synagene, Enc# digunakan untuk ekstraksi /NA. Pembangunan cDNA dilakukan menggunakan kit ekstraksi